全 文 ：西北大学学报(自然科学版)
2008年 10月 , 第 38卷第 5期 , Oct., 2008, Vol.38, No.5
JournalofNorthwestUniversity(NaturalScienceEdition)
　　收稿日期:2007-10-27
　　基金项目:长江学者创新团队基金资助项目(PCSIRT)
　　作者简介:王翀(1979—), 女 ,陕西西安人 , 西北大学博士生 ,从事种质资源多样性研究。
　　通讯作者:赵桂仿(1952—), 男 ,陕西西安人 , 西北大学教授 ,博士生导师 , 从事分子遗传学研究。
·生命科学与医药学 ·
利用 ISSR分析 6种绞股蓝属植物的遗传
多样性与亲缘关系
王　翀 ,郭志刚 ,赵桂仿
(西北大学 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室 /生命科学学院 ,陕西 西安　710069)
摘要:目的　对绞股蓝属(GynostemmaBL.)6种植物的遗传多样性与亲缘关系进行分析。方法　
利用 ISSR标记技术对 57条引物进行初筛 ,选择其中适合的 11条引物对材料进行遗传多样性分
析 ,并根据遗传距离构建 UPGMA聚类图。结果　11个 ISSR引物共检测到 120个位点 ,平均每个
引物检测到 10.91个位点 ,多态性比率(PPB)达到 98.33%, 6个物种的多态性比率分布于 34.17%
～ 1.67%之间 , Shannon信息指数(I)为 0.414 5 , Nei′s基因多样性指数(He)为 0.270 7, G.pen-
taphylum, G.cardiospermum, G.longipes, G.yixingense, G.laxiflorum的分类处理与形态学研究结果基
本一致 , G.pentagynum与 G.longipes遗传距离最近 。结论　ISSR分子标记适合于绞股蓝属植物遗
传多样性研究。
关　键　词:绞股蓝属;ISSR;遗传多样性;亲缘关系
中图分类号:Q949　　文献标识码:A　　文章编号:1000-274Ⅹ (2008)05-0767-04
　　绞股蓝属 GynostemmaBL.为多年生攀援草本 ,
包含 2亚属 2组 16种 2变种 ,我国有 2亚属 2组 14
种 2变种 ,主要分布于秦岭 、长江以南广大地区 [ 1] 。
该属广布种绞股蓝 (G.pentaphylum(Thunb.)
Makion)为我国常用中草药 ,具有悠久的应用历史 。
现代药理学研究证明绞股蓝属植物含有与人参皂甙
相似的成分 ,具有抗疲劳 、降血脂 、提高免疫力等作
用 ,广泛应用于医药保健领域 [ 2-4] 。目前采用的绞
股蓝属植物分类系统 ,主要依据子房 、果实形态进行
划分 ,由于属内种间形态特征交叉过渡现象严重 ,为
鉴定带来一定困难。
简单序列重复区间扩增多态(inter-simplese-
quencerepeat, ISSR)是 Zietkiewicz等 [ 5]在 1994年
创建的一种 DNA分子标记技术 ,它利用重复锚定引
物扩增出 SSR之间的片断 ,具有重复性好 、稳定性
高 、多态性丰富等优点 ,在种质鉴定 、遗传多样性 、亲
缘关系研究领域具有广泛应用 。本研究共收集中国
6种常见野生绞股蓝属植物样品 ,并对其进行 ISSR
分析 ,以期为绞股蓝属分类及保护策略的制定提供
分子水平依据 。
1　材料与方法
1.1　材　料
本实验选用绞股蓝属 6种植物样品(见表 1),
全部为野外采集 ,样品来源于我国秦岭以南 5省区 ,
采集时每个居群选取代表性成年植株 10 ～ 15株 ,采
样时个体间距离保持 10m以上 ,避免取自同一个体
材料 。采摘幼嫩叶片 ,置于盛有硅胶的塑胶袋中干
燥保存 ,同时采集并制作标本 。
1.2　基因组 DNA的提取与检测
采用改进的 CTAB法提取样品基因组 DNA:取
干燥的绞股蓝叶片 0.05g左右 ,加入适量石英砂置
于 -70℃预冷的研钵中快速研磨 ,待材料磨成冻粉
后 , 加入 5 mLSTE溶液 (700 mmol/LNaCl, 100
mmol/LTris-HCl(pH 8.0), 2% PVP(W/V), 50
DOI :10.16152/j.cnki .xdxbzr.2008.05.023
mmol/LEDTA(pH8.0), 2% (V/V)β -巯基乙醇),
将研钵内的物质磨成匀浆 ,立刻转移至离心管中 ,
4℃下 6 000 r/min离心 10min,弃上清 ,沉淀中加入
1mL预热的 CTAB缓冲液 (2%(W/V)CTAB, 1.4
mol/LNaCl, 100 mmol/LTris-HCl(pH8.0), 20
mmol/LEDTA(pH8.0), 2%(V/V)β -巯基乙醇),
65℃保温 60 min。加入等体积氯仿 /异戊醇 (24∶
1),轻摇混匀 10 min, 12 000 r/min离心 10 min。取
上清 ,重复此步骤直至加入抽提液后看不到中间层
有任何杂质。吸出上清 ,加入 1/10体积的 3 mol/L
NaAc和等体积的预冷的无水乙醇 ,放入 -20℃中保
存 30min。 11 000 r/min离心 7 min, 取沉淀 , 用
70%乙醇清洗 , 5 000 r/min离心 5 min。沉淀干燥
后用 10 μLTE缓冲液 (10 mmol/LTris-HCl, 1
mmol/LEDTA(pH8.0))溶解 , 0.7%琼脂糖凝胶检
测 DNA的大小和完整性。将 DNA溶液调至 20 ng/
μL,用于 ISSR标记技术分析 。
表 1　实验材料及来源
Tab.1　Originsofmaterialsusedinthestudy
编号 中文名 学名 采集地
1 绞股蓝 G.pentaphyllum 江苏南京紫金山
2 五柱绞股蓝 G.pentagynum 湖南湘西保靖县
3 心籽绞股蓝 G.cardiospermum 贵州铜仁梵净山
4 长梗绞股蓝 G.longipes 陕西安康镇坪县
5 喙果绞股蓝 G.yixingense 安徽铜陵钟鸣
6 疏花绞股蓝 G.laxiflorum 安徽铜陵钟鸣
1.3　ISSR扩增及其产物检验
选取 2份材料进行预试验 , 从 57条 ISSR引物
(根据 BritishColumbia大学公布的序列设计 ,由上
海生物工程技术服务有限公司合成)中选出 11条
反应稳定 、条带清晰的 ISSR引物用于全部材料的扩
增(见表 2)。
表 2　ISSR引物序列与多态性分析
Tab.2　ListofISSRPrimers′sequencesandanalysisofISSR-generatedbandingpatterns
引物号 　　碱基序列 退火温度 /℃ 扩增带数 /条 多态性条带 /条
U857 ACACACACACACACACYG 47 14 14
U861 ACCACCACCACCACCACC 63 11 11
U862 AGCAGCAGCAGCAGCAGC 57 8 8
U864 ATGATGATGATGATGATG 54 14 14
U873 GACAGACAGACAGACA 51 14 14
U880 GGAGAGGAGAGGAGA 48 10 10
U887 DVDTCTCTCTCTCTCTC 51 9 9
U888 BDBCACACACACACACA 49 12 12
U889 DBDACACACACACACAC 49 9 8
U891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 45 11 10
U895 AGAGTTGGTAGCTCTTGATC 54 8 8
　　　注:R=A/G, Y=C/T, D=A/G/T, V=A/C/G, B=C/G/T, H=A/C/T
　　PCR反应体系为 20 μL, 包括 2.0 mmoL/L
Mg2 +, 0.2 mmoL/LdNTPs, 1.0 μmol/L引物 , 20 ng
模板 DNA, 2UTaqDNA聚合酶 , 1×PCRbufer。反
应程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s, 45 ～
77℃退火 45 s, 72℃延伸 2 min,进行 40个循环;最
后 72℃延伸 7min。
反应产物在含有 EB的 1.5%琼脂糖凝胶中电
泳分离 ,在紫外光投射仪下检测 ,通过 KodakScien-
tificImagingSystems(EstmanKodakCompany)照相
记录。
1.4　数据统计与分析
根据 ISSR扩增条带的有无分别用 “ 1”和 “ 0”
表示 ,获得二元数据矩阵。利用 POPGENE软件包
分析各居群的多态位点比率(PPB)、Shannon多样
性指数(I)和 Nei′s基因多样性指数(He),并估算各
居群间的遗传距离。采用 UPGMA法进行分析 ,并
构建聚类图。
2　结果与分析
2.1　ISSR引物筛选与遗传多样性分析
从 57条 ISSR引物中筛选出扩增条带清晰 、重
复性好的 11条引物 ,对 6种绞股蓝属植物材料进行
扩增 ,共得到 120条带 ,平均每个引物扩增出 10.91
条 ,其中多态性条带 118条 ,多态性比率(PPB)达到
98.33%, Shannon信息指数(I)为 0.414 5, Nei′s基
因多样性指数(He)为 0.270 7 ,揭示了供试材料在
种间水平上具有丰富的多态性 ,扩增条带的分子量
从 200 bp～ 2 000bp不等 。分别对 6种绞股蓝属植
物 ISSR扩增条带进行遗传多样性分析 ,各物种多态
性比率在 34.17% ～ 1.67%之间 ,最低的是 G.longi-
pes,最高的是 G.pentaphylum和 G.pentagynum(分
—768— 西北大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　第 38卷
别为 34.17%和 30.00%),各物种的 Shannon信息
指数和 Ne′s基因多样性指数与多态性比率趋势基
本一致(见表 3)。
表 3　绞股蓝属 6个居群的遗传多样性
Tab.3　GeneticdiversistyofGynostemmaBL.
居群 来源 观测等位基因数
有效等位
基因数
Shannon
信息指数
Nei′s基因
多样性指数 多态性比率
1 江苏南京 1.366 1 1.169 7 0.161 4 0.103 8 34.17
2 湖南吉首 1.330 3 1.156 1 0.148 0 0.095 5 30.00
3 贵州梵净山 1.066 7 1.015 8 0.020 4 0.011 6 6.67
4 陕西安康 1.018 3 1.011 1 0.009 4 0.006 3 1.67
5 安徽铜陵 1.066 0 1.020 9 0.024 3 0.014 6 5.83
6 安徽铜陵 1.030 3 1.020 9 0.015 9 0.011 0 2.50
种间水平 1.983 3 1.451 8 0.414 5 0.2707 98.33
2.2　绞股蓝属种间的遗传变异
根据 DNA扩增结果 ,利用 POPGENE软件包计
算各样品间的 Nei′s遗传距离(D)和遗传一致度(I)
(见表 4),并对绞股蓝属 6种植物进行 UPGMA聚
类分析 ,结果见图 1。
表 4　绞股蓝属 6个居群之间的 Nei′s遗传一致度与遗传距离
Tab.4　MatrixofgeneticidentityandgeneticdistanceforGynostemmaBL.
PopID 1 2 3 4 5 6
1 ＊＊＊＊ 0.649 1 0.670 9 0.645 9 0.566 4 0.583 2
2 0.432 2 ＊＊＊＊ 0.681 6 0.738 7 0.608 1 0.529 3
3 0.399 1 0.383 2 ＊＊＊＊ 0.663 7 0.669 6 0.675 0
4 0.437 1 0.302 9 0.409 9 ＊＊＊＊ 0.651 2 0.551 0
5 0.568 5 0.497 5 0.401 1 0.428 9 ＊＊＊＊ 0.599 4
6 0.539 3 0.636 3 0.393 0 0.595 9 0.511 9 ＊＊＊＊
　　注:右上角为遗传一致度 , 左下角为遗传距离
图 1　基于 ISSR标记的 UPGMA聚类图
Fig.1　UPGMAdendrogrambasedonISSRmarkers
　　利用 POPGENE软件分析 ISSR扩增结果 ,得到
绞股蓝属种间遗传一致度与遗传距离矩阵与亲缘关
系聚类图。结果显示 , 6种绞股蓝属植物可明显地
分为两类:一类包括绞股蓝 G.pentaphylum、五柱绞
股蓝 G.pentagynum、长梗绞股蓝 G.longipes;另一类
包括心籽绞股蓝 G.cardiospermum、喙果绞股蓝 G.
yixingense、疏花绞股蓝 G.laxiflorum。 6个物种种间
遗传距离在 0.302 9 ～ 0.636 3范围之内 ,平均遗传
距离为 0.462 5,其中五柱绞股蓝与长梗绞股蓝遗传
距离最小 ,只有 0.302 9。
3　讨　论
Hamrick认为 ,物种的分布范围影响其遗传变
异 ,遗传多样性水平与该物种分布区大小成正比 ,狭
域种的遗传多样性水平低于广布种 [ 6] 。本实验材
料中绞股蓝 G.pentaphylum为该属的广布种 ,分布
于我国秦岭长江以南广大地区 ,其余各种均为地区
特有种[ 1] ,分布区狭小 ,生态环境单一 ,只分布于特
殊的生境 [ 7] 。本研究结果显示绞股蓝的多态性比
率为 34.17%,特有种的比率为 30.00% ～ 1.67%不
等 , Shannon信息指数和 Nei′s基因多样性指数与多
态性比率趋势基本一致 ,显示出前者的遗传多样性
水平明显高于后者 ,符合广布种的遗传多样性水平
高于狭域种这一规律。
遗传多样性体现着物种适应环境的能力 ,遗传
多样性越丰富 ,在环境发生变化时该物种生存下来
的可能性就越大[ 8] 。本研究结果表明 ,绞股蓝属的
遗传多样性水平差距很大 ,广布种多态性比率最高 ,
达到 34.17%, 特有种多态性比率最低的只有
1.67%,特有种遗传多样性的贫乏显示其生存适应
的弱势 ,同时也提醒我们在利用绞股蓝属植物资源
时 ,既要考虑到不同种间药用价值的差异 ,也要保护
野生特有种资源。
关于绞股蓝属 6个种种间亲缘关系 ,以形态特
征为依据的经典分类法 ,依据子房与果实形态将绞
股蓝属分为绞股蓝亚属(包括绞股蓝 、长梗绞股蓝
等 9个种)与喙果藤亚属(包括五柱绞股蓝 、心籽绞
—769—第 5期　　　　　　　　　　王翀等:利用 ISSR分析 6种绞股蓝属植物的遗传多样性与亲缘关系
股蓝 、喙果绞股蓝 、疏花绞股蓝等 7个种)[ 1] 。应用
ISSR分子标记技术对该属 6种植物亲缘关系进行
分析 ,其结果与经典分类关于五柱绞股蓝的分类结
果不完全一致。经典分类法依据果实形态将五柱绞
股蓝归为喙果藤亚属 ,独立为一组 , ISSR标记聚类
结果显示五柱绞股蓝与长梗绞股蓝的遗传距离最
近 ,最后与绞股蓝亚属的两个种聚为一支。 1986年
《中国植物志》描述该属植物子房球形 ,具有 3 ～ 2
室 ,此后发表的扁果绞股蓝 [ 9] 、翅茎绞股蓝 [ 10]等新
种均支持这一观点 ,但五柱绞股蓝子房结构不同于
该属其他种类 ,具有 5 ～ 4室[ 11] 。关于五柱绞股蓝
的分类地位还有待进一步研究 。
结合野外观察分析 ISSR标记聚类结果 ,聚类图
显示绞股蓝属植物在遗传组成上受到生存环境的影
响。将湿润地区生长的绞股蓝 G.pentaphylum等 3
个种首先聚为一类 ,它们大多分布于空气湿度大 ,土
壤有机质丰富的林下或溪边 ,将干燥地区生长的疏花
绞股蓝 G.laxiflorum等 3个种聚为一类 ,它们多分布
于崖壁缝隙间或石灰岩山丘上 ,光照强烈 ,空气干燥。
利用 ISSR分子标记构建的 UPGMA系统树所
反映的种间关系与传统形态分类 、细胞学特征有一
定差异 ,这与不同的分类水平有关 。ISSR以基因组
内广泛存在的串联重复序列为主体设计引物 ,扩增
出重复序列之间的 DNA片段 ,可以检测出整个基因
组的多态性信息 ,经典分类以几个主要的形态特征
为分类依据 ,因而两种不同分类水平的结果不完全
吻合。 ISSR分子标记由于具有扩增产物稳定 、多态
性高等优点 ,常被作为种间及种下物种鉴定与亲缘
关系分析的工具 。
致谢:本研究得到中国科学院昆明植物研究所
陈书坤研究员热心指导与大力支持 ,在吉首大学刘
世彪副教授的帮助下完成样品采集工作 ,陈书坤研
究员与西北农林科技大学陈彦生研究员为本研究提
供标本鉴定 ,在此 ,表示诚挚感谢 !
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(编　辑　徐象平)
Analysisofgeneticdiversityandafinityamong6speciesofGynostemmaBL.byISSRWANGChong, GUOZhi-gang, ZHAOGui-fang(KeyLaboratoryofResourceBiologyandBiotechnologyinWesternChinaMinistryofEducation/NorthwestUniversity, Xi′an710069,China)
Abstract:Aim　Toinvestigatethegeneticdiversityandafinityamong6 speciesofGynostemmaBL.byinter-sim-plesequencerepeat(ISSR)technique.Methods　11appropriateISSRprimerswereselectedfromatotalof57 IS-SRonesforPCRamplification.Results　120 bandswereamplifiedby11 informativeandreliableprimers, with
10.91 bandsperprimerinaverage, therateofpolymorphicbandswas98.33%, thepercentagesofthepolymorphicsitesinthe6 speciesdiferedwithin34.17% ～ 1.67%, ahighlevelofgeneticdiversityinGynostemmaBL.was
revealedthatShannnon′sgenediversity(I)was0.414 5, Nei′sgenediversity(He)was0.270 7.TheUPGMAclusteranalysisindicatedthatthegeneticrelationshipwasbasicalyconsistentwiththeconventionalclassification,G.pentagynumandG.longipeshadthesmalestgeneticdiference.Conclusion　TheresultsrevealthatISSRmeth-odissuitableforgeneticdiversityanalysisofGynostemmaBL.Keywords:GynostemmaBL.;ISSR;geneticdiversity;geneticrelationships
—770— 西北大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　第 38卷