全 文 ：16 林业科技开发 2014 年第 28 卷第 2 期
doi:10． 13360 / j． issn． 1000－8101． 2014． 02． 004
不同提取方法的铁线莲属叶片总 DNA提取效果
盛璐，张逢凯，潘婷，季孔庶*
(南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京 210037)
摘 要:以铁线莲属植物的叶片为材料，采用 CTAB－SDS法、简易 CTAB法、改良 CTAB法等 3 种提取方法，比较耗
时、纯度、得率、浓度和质量等指标，以期为铁线莲属植物叶片总 DNA 的提取筛选适宜方法。结果表明，在纯度和
浓度方面 CTAB－SDS法 ＞简易 CTAB法 ＞改良 CTAB法，在节省提取时间方面改良 CTAB法 ＞ CTAB－SDS 法 ＞简
易 CTAB法。以 CTAB－SDS法所提取的 9 种铁线莲 DNA 为模板，进行 PCＲ 扩增，CTAB－SDS 法提取的 DNA 得率
高、质量好，PCＲ扩增成功率也较高。综合比较，采用 CTAB－SDS法进行铁线莲属叶片总 DNA提取效果更佳。
关键词:铁线莲;基因组 DNA;提取方法; CTAB－SDS;简易 CTAB
Effect of different methods on DNA extraction from leaves of Clematis L．∥SHENG Lu，ZHANG FengKai，
PAN Ting，JI KongShu
Abstract:In order to screen the ideal method to extract genomic DNA from the leaves of Clematis，9 species of the Clematis
were used as the experimental material in this study． Depending upon the index of DNA purity，yield，concentration and
time consuming，three methods，CTAB－SDS，simplified CTAB，modified CTAB was compared to achieve the optimal one．
The results showed that in the respect of purity，yield，concentration，the order from high to low quality was CTAB－SDS，
simplified CTAB and modified CTAB，respectively;and the time consuming order from more to less time was the modified
CTAB，CTAB－SDS，and simplified CTAB． The quality of genomic DNA extracted by CTAB－SDS was better than others
for PCＲ amplification template preparing． In conclusion，the CTAB－SDS was the most suitable method for genomic DNA
extraction from the leaves of Clematis．
Key words:Clematis;genomic DNA;extraction method;CTAB－SDS;simplified CTAB
First author’s address:Key Laboratory of Forest Genetics ＆ Biotechnology，Ministry of Education，Nanjing Forestry Uni-
versity，Nanjing 210037，China
收稿日期:2013－08－20 修回日期:2013－11－09
基金项目:江苏高校优势学科建设工程项目资助(PAPD)。
作者简介:盛璐(1985 －)，女，博士生，研究方向为园林植物与观赏园
艺。通讯作者:季孔庶，男，教授。E-mail:ksji32@ 163． com
铁线莲属(Clematis L．)隶属于毛茛科，是一种观
赏价值高、具有多种抗逆性的藤本植物，全世界约有
230 ～ 355 种，广泛分布于除南极洲外的各大洲［1－2］。
我国有铁线莲属植物 140 多种，全国各地均有分布，
大部分种类分布于华中和西南地区。本属中，多数植
物花形新颖别致，变化大，花朵色泽调和，独具风采;
花期较长，适应性强，并具有较强的耐寒性，园艺用途
广泛，观赏价值高，是非常优良的垂直绿化材料，有着
藤本皇后的美称，在国际观赏园艺中占有重要地
位［3］。此外，该属植物自古就以其药用价值而被广
泛使用，如《开宝本草》中记载的传统中药威灵仙和
川木通及《新修本草》中记载的女萎。我国原产的铁
线莲属植物中可供药用的有 85 种，民间常将其作为
利尿通淋及祛风止痛药物，铁线莲属药用植物在临床
上也有广泛应用，因其具有抗肿瘤作用而使该属植物
备受关注［4－5］。
基因组 DNA的提取是植物分子生物学研究的基
础技术。获取高质量的 DNA 是进行限制性酶切、
PCＲ扩增、分子杂交、遗传多态性分析以及基因组学
等分子生物学研究的基础。由于植物中次生代谢产
物如多酚类化合物可导致 DNA 降解，并且多糖的污
染也会影响植物 DNA 纯度，多糖能抑制限制性内切
酶、连接酶以及 DNA 聚合酶等酶类的生物活性。因
此从富含多酚和多糖的植物组织中分离获得高质量
的基因组 DNA 并不是简单的事。目前植物基因组
DNA提取常用的方法有 CTAB法、SDS法、氯化苄法、
高盐低 pH法、果胶酶法等［6－7］。
铁线莲属植物叶片总 DNA 提取方法中多采用
CTAB法或 SDS法，胡讳晨等［8］采用 4 种不同的方法
对滑叶铁线莲叶片的总 DNA进行提取，所得 DNA提
取率较低，杂质稍多。为此，本文采用 CTAB －SDS
法、简易 CTAB 法、改良 CTAB 法等 3 种方法提取铁
应用研究 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
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线莲属叶片 DNA，筛选出较适合铁线莲属叶片 DNA
的提取方法。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
试验所用材料毛叶铁线莲(Clematis lanugino-
sa)、转子莲(C． patens)、湖州铁线莲(C． huchouen-
sis)、重瓣铁线莲(C． florida var． plena)、短柱铁线莲
(C． cadmia)、西伯利亚铁线莲(C． sibirica)、圆锥铁
线莲(C． terniflora)均来自国内野生资源，C． crispa
和 C． japonanca 来自国外苗圃。材料种植于南京林
业大学温室。
取铁线莲叶片，用 70%酒精对叶片进行表面消
毒后，分装于自封袋，液氮速冻后，存于 － 80℃超低温
冰箱备用。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 CTAB－SDS法
本试验方法与试剂配制按照何卫龙等［9］基础上
进行了一些改良。由于本实验材料叶片量多，所以本
实验中所加的试剂为原文献中的 10 倍。另外在为了
防止褐变在预热的 CTAB提取液中加 100 μL巯基乙
醇。为了提高 DNA 的纯度，减少 ＲNA 污染，在最后
DNA溶液中加入 2 μL 10 mg /mL的 ＲNase A，37 ℃，
保温 1 h后存于 － 80 ℃备用。
1． 2． 2 改良 CTAB法
李金璐等［10］对植物 DNA 提取实践中总结出一
种较为普遍适用的植物 DNA 改良 CTAB 提取方法
(modified CTAB method，mCTAB)，在多种植物中提
取 DNA，效果较好。本试验方法与试剂配制按照李
金璐等实验步骤进行操作。
1． 2． 3 简易 CTAB法
本试验方法与试剂配制按照刘娜娜［11］实验步骤
进行操作。
2 结果与分析
2． 1 3 种方法提取铁线莲属总 DNA比较
取 1μL 样品，以 TE 为对照，在紫外分光光度计
(Beckman Conlter DU800)上进行测定。测定铁线莲
属植物叶片 DNA OD260 /OD280、OD260 /OD230值、浓度及
DNA得率见表 1 ～ 3。DNA 得率 = DNA 浓度 ×总样
品体积 /样品鲜质量。
高纯度 DNA的 OD260 /OD280值应在 1． 8 ～ 2． 0 之
间。当 OD260 /OD280小于 1． 8 时，DNA 样品中可能存
在蛋白质污染;当 OD260 /OD280大于 2． 0 时，DNA样品
中 ＲNA的含量较高。当 OD260 /OD230的数值处于 2． 0
左右时，表明小分子盐离子、色素、多糖或醇等杂质含
量较少［12］。
表 1 3 种方法提取 C． crispa叶片的 DNA结果
方 法 OD260 /OD280 OD260 /OD230
浓度 /
(ng·μL －1)
得率 /
(μg·g － 1)
耗时 /
h
CTAB－SDS法 1． 85 2． 08 1 169． 7 117． 0 3． 2
改良 CTAB法 1． 68 0． 98 127． 1 12． 7 5． 4
简易 CTAB法 2． 02 1． 91 1 072． 7 107． 3 2． 0
表 2 3 种方法提取重瓣铁线莲叶片的 DNA结果
方 法 OD260 /OD280 OD260 /OD230
浓度 /
(ng·μL －1)
得率 /
(μg·g － 1)
耗时 /
h
CTAB－SDS法 1． 86 1． 95 1 091． 4 109． 1 3． 2
改良 CTAB法 1． 72 2． 33 141． 9 14． 2 5． 4
简易 CTAB法 2． 13 1． 46 915． 8 91． 6 2． 0
表 3 CTAB－SDS法提取铁线莲属叶片的 DNA结果
序号 种 类
OD260 /
OD280
OD260 /
OD230
浓度 /
(ng·μL －1)
得率 /
(μg·g － 1)
1 毛叶铁线莲 1． 88 1． 94 822． 9 82． 3
2 转子莲 1． 90 2． 04 1 083． 3 108． 3
3 湖州铁线莲 1． 85 2． 13 1 169． 7 117． 0
4 重瓣铁线莲 1． 86 1． 95 1 091． 4 109． 1
5 西伯利亚铁线莲 1． 90 2． 03 1 117． 9 111． 8
6 C． crispa 1． 85 2． 08 1 168． 7 116． 9
7 C． japonanca 1． 87 1． 85 610． 3 61． 0
8 圆锥铁线莲 1． 89 1． 91 631． 1 63． 1
9 短柱铁线莲 1． 88 1． 91 689． 0 68． 9
从表 1 和表 2 中可以看出，采用 CTAB －SDS 法
所提取的 DNA浓度较高，OD260 /OD230为 1． 85、1． 86，
说明不存在蛋白质和 ＲNA 的污染;OD260 /OD230为
2． 08、1． 95，说明多糖或醇等杂质含量较少，说明所提
取的 DNA不管是溶度和质量都比较高。简易 CTAB
法，存在少量 ＲNA 污染，这种提取方法，在提取过程
中没有 ＲNase A酶进行消化，另外小分子盐离子、色
素、多糖或醇等杂质含量也比较多。但这种方法，耗
时较少，若后续试验对 DNA质量要求不很高，可以采
取这种方法。改良 CTAB法，耗时较长，提取 DNA的
浓度和质量都不是很高，不适合铁线莲属植物叶片的
DNA提取。表 3 是 9 种铁线莲采用 CTAB－SDS 法叶
片 DNA 提取结果。从表 3 可以看出，OD260 /OD280和
OD260 /OD230值都较好，浓度也较高，可见，CTAB －SDS
法较适合铁线莲属叶片的 DNA提取。
2． 2 琼脂糖电泳检测
取 4μL DNA 原液，加 1μL 5 × loading buffer，用
1%琼脂糖凝胶电泳，稳压 80V，2h，GelＲed 染色，检
测 3 种不同 DNA提取方法对 C． crispa及重瓣铁线莲
提取效果的影响。对采用 CTAB －SDS 法提取 9 种铁
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 应用研究
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线莲基因组 DNA提取效果进行检测，结果见图 1。
从图 1 可以看出，1、4 采用 CTAB－SDS相结合的
方法所提取的 C． crispa 和重瓣铁线莲叶片 DNA 样
品电泳条带为一清晰的亮带，没有 ＲNA带出现，带纹
没有明显的弥散拖带。说明该方法提取的铁线莲叶
片 DNA纯度较高，多糖、蛋白质、ＲNA、酚类物质及盐
离子等杂质去除比较完全，适用于进一步的分子试
验。3、6 采用简易 CTAB 法，电泳条带也较清晰明
亮，但不如 CTAB －SDS 法明亮。2、5 为改良 CTAB
法，电泳条带亮带不明显，且带纹有一定的弥散拖带，
说明 DNA纯度较低，多糖、蛋白质、ＲNA、酚类物质及
盐离子等杂质较多。为检验 CTAB －SDS 法的优越
性，提取 9 种铁线莲叶片的 DNA 进行琼脂糖凝胶电
泳结果显示，9 个样品 DNA 均条带清晰，点样孔干
净，且无拖尾现象(图 2)，说明 DNA 完整性好质量
高，可用于进一步研究。
图 1 3 种不同方法提取铁线莲叶片 DNA电泳图 图 2 CTAB－SDS法提取 9 种铁线莲叶片 DNA电泳图
2． 3 PCＲ检测
PCＲ扩增对 DNA 模板的质量要求较高，因此
PCＲ扩增成功率可以作为检测 DNA质量的重要标准
之一。将材料 CTAB －SDS 法提取的 DNA，以 ITS 和
psbA－trnQ为目的片断进行 PCＲ扩增。
图 3 左边 1 ～ 9 片段为核糖体 DNA ITS 片段，右
边 10 ～ 18 为叶绿体 DNA psbA－trnQ 片段，引物序列
来源于 Miikeda等［13］。ITS 片段引物序列为 AB101:
5 －ACGAATTCAAGGTCCGG －TGAAGTGTTCG －3和
AB102:5 －TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC －
3;叶绿体 DNA psbA－trnQ片段引物序列为 psbAF:5
－GCTCACAACTTCCCTTTAGA －3和 trnQＲ:5 －TG-
GCCAAGTGGTAAGGCA －3，反应在 ABI －9700 型
PCＲ仪上进行。
注:1 ～ 9 对应表 3 中 9 种铁线莲 ITS片段，10 ～ 18 对应表 3 中 1 ～ 9 种铁线莲 psbA－trnQ片段;M表示 marker。
图 3 用 2 对引物扩增的 9 种铁线莲 DNA常用片段的 PCＲ扩增情况(CTAB－SDS法)
PCＲ扩增采用 25 μL 反应体系，其中包括12． 5
μL 2 × Taq PCＲ Master Mix，引物各 0． 5 μL，模板
DNA 1 μL，ddH2O 10． 5 μL。PCＲ 扩增反应在 Genen
AMP PCＲ System 9700 上进行，PCＲ 扩增程序为:
94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s，65℃(ITS 片段)
51℃(psbA－trnQ片段)退火 45 s，72°C延伸 1 min，32
个循环;72℃延伸 10 min;4℃保存。扩增反应结束后
取 5 μL进行扩增产物的电泳，染色后在紫外凝胶成
像仪上观察、拍照分析。其中包括从图中可以看出，
均获得了较清晰的扩增图谱。
应用研究 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
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3 结论与讨论
本实验采用 CTAB －SDS 法、改良 CTAB 法、简易
CTAB法，并对其 DNA耗时、纯度、得率、浓度和质量
检测。结果表明采用 CTAB －SDS 法，浓度较高，纯度
好，得率较高，耗时适中。琼脂糖凝胶电泳条带清晰，
点样孔干净，且用 CTAB －SDS 法提取的 DNA 作模
板，进行 PCＲ 检测发现，获得了较清晰的扩增图谱，
提取的 DNA可以用于后续的研究。
植物 DNA的提取方法比较多，基本上是比较成
熟的，但对不同的植物来说，由于其各自的生物化学
成分和结构不同，在具体操作中存在较大的差异。一
般来说，CTAB缓冲液比较适用于草本植物和不含酚
类或含酚类较少的植物 DNA 提取［14］。故选用 3 种
不同的 CTAB法，比较其优劣。多酚、多糖、蛋白质等
物质的含量是 DNA 提取好坏的关键影响因素，这些
物质在样品中的含量多少直接影响到了 DNA提取的
质量。在缓冲液中加入 EDTA(20mM)和一定浓度的
巯基乙醇可以较好地抑制酚的自发氧化和褐变。
PVP能络合多种酚类物质，防止多酚氧化物引起的
DNA褐变反应;β—巯基乙醇可降解蛋白质、并抑制
多种酶的氧化活性，在热的裂解缓冲液中增加氯仿抽
提次数会使缓冲液褐变，这可能与抽提过程中缓冲液
中 β—巯基乙醇含量的减少有关［15－16］。
简易 CTAB法提取的 DNA 浓度和得率均较高，
但纯度和质量稍低，且含有少量的 ＲNA 污染。而
CTAB－SDS法在简易 CTAB 法的基础上增加了 SDS
溶液提取，且用 ＲNase A 酶进行了处理，CTAB －SDS
法结合了 CTAB 和 SDS 的缓冲液的优点，所得 DNA
不管是质量、纯度、得率、溶度都较高。但耗时 3． 2h
比简易 CTAB稍长。在对 DNA纯度要求不高的情况
下，可以采用 CTAB 法。改良 CTAB 法，不仅耗时过
长，浓度和纯度都较低，可能是因为此方法耗时过长，
氯仿抽提次数过多，导致浓度较低，另外水浴时间较
长等导致了纯度较低。另外在实验过程中经过摸索
发现以下注意事项:
(1)材料用液氮速冻磨碎后，要立刻转入核分离
液中，如果暴露在空气中稍一化冻，材料就会很快变
成棕褐色，这些棕褐色物质就不可逆地与 DNA结合，
影响 DNA的质量，且研磨充分程度会影响 DNA提取
的得率，充分研磨会提高得率，但注意研磨时要注意
不能脱离液氮，防止褐化。
(2)高质量的 DNA 产品要求不含有或只含有极
少量的 ＲNA，一般情况下，可在 37℃左右温度中用
ＲNase消化 1 h 以去除 ＲNA，在消化步骤方面，进过
多次试验发现，在 DNA 提取完，加入 ＲNase 消化，效
果最好。
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( 责任编辑 吴祝华)
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