全 文 ：2006年 12月
2006, 28(4):476— 479
中国油料作物学报
Chinese journa l of oil crop sciences
甘蓝型油菜与萝卜属间
杂种的获得及分子鉴定
胡大有 1 , 王爱云2* , 李　栒 2
(1. 益阳职业技术学院 ,湖南益阳 413000;2. 湖南农业大学 ,湖南 长沙 410128)
摘要:通过蕾期重复授粉和子房培养克服甘蓝型油菜与萝卜属间杂交障碍 , 提高杂种获得率。从组合湘油 15
×萝卜 、681A×萝卜和 742×萝卜分别获得 12、 28和 18粒种子 , 前两组合分别得到 21和 11株 F1植株 ,而从组合
742×萝卜未得到再生植株 。 F1植株形态有些相似于母本 ,有些则不同于双亲。 SSR分析显示 , 由湘油 15×萝卜所
获得的 21株 F
1
植株中有 10株是真杂种。
关键词:甘蓝型油菜;萝卜;属间杂种;SSR分子标记
中图分类号:S565. 403　文献标志码:A　 文章编号:1007— 9084(2006)04— 0476— 04
　　远缘杂交是实现种属间基因转移的一条重要途
径 ,在植物遗传育种中广泛应用。萝卜属十字花
科 ,是一种重要的蔬菜 ,具有优良的抗线虫病基因和
细胞质雄性不育基因 ,通过甘蓝型油菜(B rassica na-
pus, 2n =4x =38, AACC)与萝卜 (Raphanus sativus
L. , 2n=18RR)杂交 ,可将萝卜的优良基因转移到甘
蓝型油菜中 ,拓宽甘蓝型油菜的遗传基础 ,因此 ,萝
卜被广泛用于改良甘蓝型油菜 [ 1 ～ 7] 。但萝卜与甘蓝
型油菜分属十字花科不同的属 ,远缘杂交时存在不
亲和现象 [ 8, 9] ,难以获得属间杂种 。获得的属间杂
种过去一般采用形态学 、细胞学和同工酶方法鉴定 。
近年来 ,随着分子生物学的发展 ,由于分子标记技术
能在 DNA水平上迅速 、有效的鉴定体细胞杂种 ,并
且能在苗期进行 ,节省大量的时间和精力 ,因此 ,分
子标记技术被广泛应用于杂种的鉴定 。目前 ,分子
标记的方法主要有 RFLP、 RAPD、 SSR 和 AFLP
等 [ 5 ～ 9] 。由于 SSR标记在单个座位上检测到的多
态性远高于其他任何一种分子标记 , 且广泛 、随机 、
均匀地分布于整个基因组 , 重复性好以及共显性遗
传特点 ,因此 ,被认为是鉴定杂种的一种理想而有效
的方法 。利用 SSR技术来鉴定甘蓝型油菜与萝卜
的属间杂种还未见报道 ,为此本研究建立了一套用
SSR技术鉴定甘蓝型油菜与萝卜的属间杂种及亲本
的技术体系 ,旨在为属间远缘杂种的早期鉴定提供
一种快速的方法 。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
供试材料包括甘蓝型油菜 (B rassica napus, 2n=
38, AACC )湘油 15、742、681A(湖南农业大学油料
作物研究所选育的甘蓝型油菜细胞质雄性不育
系),日本樱岛大根萝卜 (Raphanus sa tivus L. , 2n =
18RR),均由湖南农业大学油料作物研究所提供 。
1. 2　属间杂交和胚拯救
试验材料于 2004年秋季播种 ,一般栽培管理。
用湘油 15、742和 681A作母本与萝卜进行远缘杂
交。盛花期在田间采用人工剥蕾去雄重复授粉的方
法。在授粉的前 1d于母本植株上选取约 2d后才能
开花的花蕾进行人工去雄 ,并立即套袋 ,标记挂牌。
套袋后的第 2d上午 10∶00前后进行授粉 、套袋 ,第
3d再重复授粉一次 ,授粉后套袋直至受精结束。授
粉的雌蕊一些用来作为子房培养 ,一些留在植株上
直到其完全成熟或干枯作为试验对照。
第 2次授粉 7d后切取子房进行培养。用于培
养的子房首先用 70%的乙醇消毒 1 ～ 2m in,然后用
0. 1%HgC l2灭菌 8 ～ 10m in,用无菌水冲洗 5次。接
种前 ,用无菌滤纸吸干子房表面无菌水 ,去除果柄 ,
子房连同花托一起接种到培养基上培养 。选择 MS
为基本培养基 ,附加一定量激素 (如 6 - BA , NAA),
蔗糖浓度为 3. 0%(W /V), 用 0. 7%(W /V)的琼脂
收稿日期:2006— 02— 06
基金项目:湖南省科技厅资助项目(05NK3046)
作者简介:胡大有(1966— ),男 ,湖南桃江人 ,讲师 ,主要从事作物遗传育种教学和研究。
*通讯作者 , Tel:13574120246, E -m ail:w angaiyun1964@ yahoo. com. cn。
粉固化 。接种子房在 25 ±2℃,光照 16h /d,光照强
度 2 000Lx条件下培养 20 ～ 30d,从荚果中取出种
子 ,统计其数量。取出的种子在分化培养基上培养 ,
形成芽或复合芽 ,然后将复合芽切成许多单芽培养
在新鲜培养基上扩大其繁殖系数。当幼苗长至大约
3cm左右移至生根培养基培养 ,生根的幼苗水洗后
移栽到盆钵用于杂种鉴定 。
1. 3　属间杂种植株的鉴定
1. 3. 1　DNA的提取　采用 CTAB法提取 DNA并纯
化 。
1. 3. 2　PCR反应条件　反应体积 20μL,其中 10×
buffer 2. 0μL(含 M g2 +), 10mmol /L dNTPs0. 4μL,
2. 5U /μL Taq酶 0. 8μL, 10μmol /L引物 1μL, 25ng /
μL DNA 4μL, ddH2O 10. 8μL 。 Taq酶购自北京天
为时代公司 , dNTPs购自北京鼎国公司 , SSR引物序
列查自 http. www. ukcrop. com ,北京奥科公司合成 。
1. 3. 3　PCR扩增程序 　反应在 PCR仪上进行 ,
94℃ 5m in预变性 , 94℃ 1m in, 52℃ 45s, 72℃ 90s, 40
个循环 , 72℃延伸 8m in。 4℃保存 。扩增产物以
3. 0%琼脂糖凝胶 (含 0. 5μg /mL EB)电泳 ,电泳缓
冲液为 1×TAE ,标准分子量 M arker为 D2000(北京
天为时代公司 ),用 ge ldoc1000一次成像仪观察 、照
相。
2　结果与分析
2. 1　杂交亲和性及杂种形态
甘蓝型油菜和萝卜共组配 6个正 、反杂交组合
(表 1)。 3个甘蓝型油菜 ×萝卜杂交组合 ,共杂交
1 206朵花 ,获得了 37个杂交角果 ,其中离体培养得
到了 25个角果 ,结角率为 3. 06%;田间对照得到了
12个角果 ,结角率为 3. 08%(表 1)。
表 1　萝卜与甘蓝型油菜杂交的结角率及获得的种子数和再生植株数
Tab le 1　　The ratio of se tting pods in the cross ofR. sa tivu s andB. napus
组合
Com b ination
授粉花数
No. of flow ers
pollin ated
结角数
No. of pods
结角率 /%
Rate of setting
pods
种子数
N o. of seeds
再生植株
No. of regenerated
p lan ts
湘油 15×萝卜 离体培养 In vitro 172 4 2. 33 12 21
X iangyou 15×R aphanus sa tivus 田间对照 Cu lture in field 181 3 1. 66
742×萝卜 离体培养 In vitro 263 8 3. 04 18 0
742×Raphanu s sa tivus 田间对照 Cu lture in field 124 3 2. 42
681A ×萝卜 离体培养 In vitro 382 13 3. 40 28 11
681A ×R aphanus sa tivu s 田间对照 Cu lture in field 84 6 7. 14
总计或平均 离体培养 In vitro 817 25 3. 06 58 32
Total orm ean 田间对照 Cu lture in field 389 12 3. 08
　　以湘油 15号 、681A为母本 ,萝卜为父本 , F1共
得到 32株杂种植株 。其中湘油 15×萝卜和 681A ×
萝卜分别得到 21和 11株。从获得的杂交种子外表
来看 ,其性状 、大小 、色泽与母本相同 ,种子发芽率在
60%左右。 F1植株在人工气候箱中生长缓慢 ,植株
矮小。在湘油 15×萝卜的 F1中 ,有些植株的叶片
形状既不像母本湘油 15,也不像萝卜 (图 1),叶缘
有较规则的锯齿 ,叶片主脉微带紫色 ,叶柄较短;但
是有的植株完全像母本湘油 15。在 681A ×萝卜的
F1中 ,植株基本上偏向于母本 681A。
2. 2　F1杂种植株的 SSR分子鉴定
用双亲及其 F1 DNA作模板对 55对 SSR引物
进行筛选 ,结果表明 , 19、21、24、35、39、42号引物能
够区分两组合的双亲 。其中 21号引物 AF05 Sense
5TCC GAA AGT GGG GAA AGG 3, An tisense 5
GTCA GAAA GCGA GAAG GAGT G 3在琼脂糖凝胶
电泳系统中特别清晰 。能够在双亲间扩增出明显的
差异带。用该对引物对所有再生植株进行鉴定 ,发
现由湘油 15×萝卜得到的 21株 F1再生植株 ,其中
有 10株同时扩增出父母本的特征扩增带 ,表现出父
母本扩增带的综合 ,没有扩增出父母本没有的新扩
增带 ,只是在有些主带的亮度上有些差异 , 表明这
10株杂种是真杂种(图 2)。另外的 11株仅扩增出
母本的特征扩增带 ,没有父本的特征扩增带 ,表明这
11株杂种为假杂种。由 681A ×萝卜得到的 11株
F1再生植株 ,经鉴定全为假杂种 ,可能是由于油菜
花粉污染造成的 ,因为 ,尽管 681A不育不彻底 ,但
同样进行了剥蕾去雄。
3　小结
本研究表明 ,萝卜与油菜的属间杂交存在高度
不亲和 ,但仍存在一定的亲和性 ,属间杂交可获得少
量种子 ,采用子房培养能够提高杂种的获得频率 。
477胡大有等:甘蓝型油菜与萝卜属间杂种的获得及分子鉴定
图 1　双亲及杂种叶片
F ig. 1　　The leaves of two paren ta l lines and hybr id
1:湘油 15(母本);2:樱岛大根萝卜(父本);3～ 17:湘油 15×萝卜 F1;M:Marker(2000bp分子量标记 , D2000)
1:Xiangyou15 ( fem ale paren t);2:Y ingdaodagen luobo(m ale paren t);3 ～ 17:F1 ofX iangyou15×Y ingdaodagen luobo;
18:M arker(2000bpDNA Ladder, D2000)
图 2　引物 AF05在亲本湘油 15、萝卜及其 F1中的 SSR扩增结果
F ig. 2　　SSR profile s generated from AF05 in the tw o paren tal lin es
(X iangyou15 and Y ingdaodagen luobo) and F1 popu lation
　　本试验中 ,得到了湘油 15×萝卜的 10株杂种 ,
其形态有的完全不同于双亲 ,有些极相似于其母本 。
经 SSR分子鉴定发现 ,形态上相似于母本的 F1植株
亦是真杂种 。由此看来 ,不能仅凭 F1植株表型判断
杂种真伪。
研究表明近缘种可以共享或部分共享 SSR引
物 ,目前芸薹属作物上已经设计的 SSR引物有 400
多对。本试验利用了 55对 SSR引物进行研究 ,表
明该技术具有多态性百分率高 ,重复性好以及呈共
显性等特点 ,并且像油菜等许多物种已有现成的 、商
品化的 SSR引物 , 对于一般的实验室而言 ,只需利
用现成的 SSR引物进行 PCR扩增 , 技术操作难度
低 、成本不高 ,是十分理想而有效的杂种鉴定的分子
标记方法 。在进行大规模杂种鉴定时 ,可在苗期去
除一部分假杂种 ,减轻工作量 。
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Production and mo lecular indentification of intergeneric hybr ids
between Brassica napus and Raphanus sativus
HU Da - you
1 , WANG A i- yun2 , LI Xun2
(1. Y iyang Vocational and Technolog ica lCollege, Y iyang 413000, China;
2. Hunan Agriultura lUniversity , Changsha 410128 , China)
Abstract:Incompatibility of in tergeneric cross be tw een Brassica napus and Raphanus sativus was overcome
and more intergeneric hybrids we re ob tained by successive bud po llination and ovary cultu re. Tw e lve, 28 and 18
seeds w e re produced and 21 , 11 and 0 plants we re ob tained from X iangyou15×Y ingdaodagen luobo, 681A ×Y ingd-
aodagen luobo and 742×Y ingdaodagen luobo, respectively. Some plan tsw ere very sim ilar to the female paren tX ian-
gyou15 and 681A , and the o thers differed from two paren tal lines. SSR analysis demonstrated that 10 F1 plan ts o f
21 p lants obta ined from X iangyou15×Yingdaodagenluobo shared cha racte ristic SSR fragments of bo th pa rents and
did not gene ra ted new SSR fragments, which ind ica ted the 10 F1 p lantsw ere intergene ric hybrids.
Key words:Raphanus sativus;B rassica species;Inte rgene ric hybrid;SSR mo lecu larmarkers
479胡大有等:甘蓝型油菜与萝卜属间杂种的获得及分子鉴定