全 文 ：中国油料作物学报
Chinese Journal of Oil Crop Sciences
2013，35(5) :484 － 490
doi:10． 7505 / j． issn． 1007 － 9084． 2013． 05． 004
黑芥 ANS基因的克隆和在芸薹属 B基因组的 PCＲ鉴别
严明理，刘丽莉，向建华，丁素萍，舒佳宾，孙 婵
(湖南科技大学生命科学学院，湖南 湘潭，411201)
摘要:利用同源克隆方法克隆黑芥 ANS基因，获得 2 个 ANS基因拷贝 BnANS1 和 BnANS2，长度分别为 1 366bp
和 1 367bp。这 2 个基因都有 1 个 76bp的内含子。比较 BnANS1 和 BnANS2 基因序列，发现在编码区、5’与 3’非编
码区和内含子区域都有多态性，5’非编码区有 3 个碱基的多态性和 4 个碱基的缺失，编码区有 26 个碱基的多态
性;内含子有 2 个碱基的多态性;3’非编码区有 18 个碱基的多态性和 3 个碱基的插入。这 2 个 ANS 拷贝都编码
356个氨基酸的蛋白，具有其他物种同样的 ANS蛋白保守结构域，属于 2OG － Fe(II)加氧酶超家族。BnANS1 编码
的蛋白质理论分子量为 40 448． 58Da，等电点为 5． 05;BnANS2 编码的蛋白质理论分子量为 40 468． 52Da，等电点为
5． 04。比较这 2 个 ANS基因拷贝编码的蛋白质序列，发现有 9 个多态性位点。这 2 个 ANS拷贝在黑芥的种皮和胚
中均检测到表达。获得了 1 对 ANS引物，能从白菜、黑芥、甘蓝、芥菜型油菜、甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥中，用等
位特异 PCＲ方法特异识别来自芸薹属 B基因组的 ANS基因。
关键词:黑芥;ANS;克隆;B基因组;PCＲ鉴别
中图分类号:S565． 403 文献标识码:A 文章编号:1007 － 9084(2013)05 － 0484 － 07
Cloning of ANS gene in Brassica nigra and PCＲ identification from Brassica B － genomes
YAN Ming － li，LIU Li － li，XIANG Jian － hua，DING Su － ping，SHU Jia － bin，SUN Chan
(School of Life Science，Hunan University of Science and Technology，Xiangtan 411201，China)
Abstract:ANS genes were cloned from Brassica nigra by homology － based clone strategy． 2 copies named
BnANS1 and BnANS2 were obtained． BnANS1 sequence was 1 366bp with a 76bp － intron． BnANS2 sequence gene
was 1 367bp with 76bp intron． Sequence analysis showed polymorphisms in coding regions，intron，5＇－ and 3＇－
noncoding regions of the two genes，including 3 polymorphic bases and a 4 － base deletion in 5＇－ noncoding region，
26 polymorphic bases in coding region，2 polymorphic bases in intron，18 polymorphic bases and a 3 － base inser-
tion in 3＇－ noncoding region． The two copies encoded deduced a polypeptide of 356 amino acids，having the same
conserved domain of ANS as other species，belonging to 2OG － Fe (II)oxygenase superfamily． BnANS1 protein
was predicted to be 40 448． 58Da with pI of 5． 05，while BnANS2 was 40 468． 52Da with pI of 5． 04． Nine poly-
morphisms were found in their protein sequences． ＲT － PCＲ result showed that BnANS1 and BnANS2 expressed in
seed coats and embryos in B． nigra． Compared with published ANS gene sequences of Brassica species，a pair of
primer was obtained based on B genome － specific nucleotide variations loci，which could effectively identify B －
genome origin of ANS in Brassica by allele － specific PCＲ．
Key words:Brassica nigra;ANS;Cloning;Genome B;PCＲ identification
收稿日期:2013-05-13
基金项目:国家自然科学基金(31000723) ;湖南省高校青年骨干教师项目(湘教通 2011 － 388)
作者简介:严明理(1979 －) ，男，湖南洞口人，副教授，博士，主要从事油菜分子育种研究，E － mail:ymljack@ 126． com
原花色素(proanthocyanidins)和花青素(antho-
cyanidins)是植物体内广泛存在的色素，它们属于
类黄酮物质，是一种重要的次生代谢产物。原花色
素和花青素影响植物的花色和种子颜色［1，2］。花青
素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)是类黄酮生
物合成途径中的重要酶，它是酮戊二酸依赖型的双
加氧酶，能催化无色花色素(leucoanthocyanidins)转
变为 3 －羟基花青素(3 － OH － anthocyanidins) ，从
而为花青素和原花色素的生物合成提供前体物质，
花青素合成酶的功能缺失或不表达会影响种皮颜色
的形成［3 ～ 5］，从而产生黄籽。目前已经从拟南芥
(Arabidopsis thaliana)［6］、芥菜(Brassica juncea)［5］、
芥蓝(B． alboglabra)［7］、芜菁(B． campestris ssp． ra-
pa)［8］和紫菜薹(Brassica campestris var． purpurea)［9］
等十字花科植物中克隆到了 ANS 基因，但在黑芥中
(B． nigra)中未见 ANS基因的报道。
在芸薹属中，禹氏三角表明甘蓝型油菜(Brassi-
ca napus，AACC，2n = 38)起源于白菜(Brassica rapa，
AA，2n = 20)和甘蓝(Brassica oleracea，CC，2n = 18) ，
芥菜型油菜来源于白菜和黑芥(Brassica nigra，BB，
2n = 16) ，埃塞俄比亚芥(Brassica carinata，BBCC，2n
= 34)来源于黑芥和甘蓝。有报道表明基因组原位
杂交能够辨别芸薹属杂种后代的 A /B /C 基因
组［10，11］，也有根据基因上的酶切位点来鉴定 A /C 组
的报道［12］。基因组原位杂交操作比较复杂，有多态
性且能被酶切的位点相对有限，虽然有利用 PCＲ 和
FISH等方法检测 B组染色体上的特异序列的报道，
但这样的特异序列也非常有限［13］。
在芸薹属中，基因克隆和功能的相关研究主要
集中在甘蓝型油菜，对黑芥的研究很少报道。黑芥
是禹氏三角中的一个重要二倍体，研究黑芥的 ANS
基因为进一步开展芸薹属物种的类黄酮生物合成机
制和油菜种子颜色形成的研究奠定基础。本研究根
据已经发表的芸薹属物种的 ANS 基因序列设计引
物，利用同源克隆的方法从黑芥中克隆 ANS 基因，对
该基因在黑芥的种皮和胚的表达进行了分析。并根
据黑芥中 ANS 基因特异的核苷酸多态性位点，开发
出一种能够识别来源 B基因组的 ANS的 PCＲ标记。
1 材料与方法
1． 1 材料
6 种芸薹属材料各一份:白菜型油菜(B． rapa，
2n = 20，AA)品种藏油 1 号、黑芥(B． nigra，2n = 16，
BB)材料 0602、甘蓝(B． oleracea，2n = 18，CC)品种
京丰一号、芥菜型油菜(B． juncea，2n = 36，AABB)品
种紫叶芥、甘蓝型油菜(B． napus，2n = 38，AACC)品
种湘油 15 号、埃塞俄比亚芥材料(B． carinata，
BBCC，2n = 34)3H008 － 6。
1． 2 核酸的提取与 cDNA合成
参考文献［14］提供的方法，从 6 份供试植物材
料的叶片中提取总 DNA。DNA 完整性采用 0． 8%
的琼脂糖凝胶检测，浓度及纯度测定采用紫外分光
光度计(岛津苏州公司，UVmini － 1240)检测，合格
的 DNA 稀释为浓度 50ng /μL。黑芥种皮和胚总
ＲNA提取和 cDNA合成参照文献［15］的方法。
1． 3 黑芥 ANS基因的克隆
以黑芥总 DNA 和种子 cDNA 为模板进行基因
全长克隆。参照 NCBI 的 ANS 基因(NM123645，
AY95320，AY228487，AK221622)全长的 5端和 3序
列设计引物 ANSU，序列见表 1，由北京赛百盛基因
技术有限公司(Sbsbio)合成。PCＲ反应体系总体积
为 20μL，含 10 × PCＲbuffer(2． 0μL，含 MgCl2)、dNTP
mix(10mmol·L －1 each，0． 3μL)、10mmol·L －1正向
引物(1μL)、10mmol·L －1反向引物(1 μL)、1U Taq
DNA聚合酶、50ng DNA模板或 1μL反转录产物、无
菌去离子水(补足到 20μL)。以上试剂购自上海
Solarbio生物科技有限公司。PCＲ 扩增程序如下:
94℃预变性 3min;94℃变性 35s，55℃退火 45s，72℃
延伸 90s，循环 36 次;最后 72℃延长 8min。用 1．
0%浓度的琼脂糖凝胶电泳分离 PCＲ 后的产物，然
后采用 Solarbio琼脂糖凝胶回收试剂盒回收 PCＲ产
物，操作步骤按试剂盒说明书。将回收纯化后 PCＲ
产物连接到 pMD18 － T载体(TaKaＲa) ，热激转化到
大肠杆菌 DH5α，进行 Amp 抗性和 X － gal / IPTG 蓝
白斑筛选。选白色菌落做菌落 PCＲ，将检测结果为
阳性的菌落进行 LB液体培养，
表 1 引物的核酸序列及其扩增目标
Table 1 Primer sequences and their amplification targets
引物名称 Primer 序列 Sequence (5→3) 扩增目的 Target
ANSU F:AAAGCTTCTTTACTTACTCTＲ:CTTTGTTACAAATCATACAA
扩增 ANS基因的全长 DNA和 cDNA序列
Full － length cDNA and gDNA of ANS gene
ANS1D F:TTTTCGCTTACCAAGAAGAACAＲ:CCCATTTACCCTCGTAGAACAG
ＲT － PCＲ扩增 BnANS1 的 799bp片段
799bp ＲT － PCＲ product of BNANS1
ANS2D F:TTAGCTTTACAAGAAGTAAGTTＲ:AATAGTTTATCTTCATTTGGAG
ＲT － PCＲ扩增 BnANS2 的 678bp片段
678bp ＲT － PCＲ product of BNANS2
ACT F:GACATTCAACCTCTTGTTTGCGＲ:CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG
ＲT － PCＲ扩增 Actin的 666bp片段
666bp ＲT － PCＲ product of Actin
B － ANS F:GCTTAGCAAAＲAGCGGAAT AGAＲ:TGCAAACCTGGAACCATGTTGT
扩增来源于 B基因组 ANS 800bp片段
800bp PCＲ product of ANS from B － genomes
注:斜体下划线为错配核苷酸 Note:Mismatched nucleotides are Italic － underlined
584严明理等:黑芥 ANS基因的克隆和在芸薹属 B基因组的 PCＲ鉴别
以强碱法提取质粒。以质粒为模板进行 PCＲ 检测。
选取 10 个阳性克隆在 ABI3730 测序仪上进行测序，
并用 DNAMAN 软件分析测序结果。得到序列与
GenBank数据库进行生物信息学分析。在 GenBank
数据库中下载与芸薹属亲缘关系较近的物种的
ANS蛋白序列，应用 ClustalW 2． 0 软件(www． ebi．
ac． uk /Tools /msa /clustalw2)对推导的氨基酸序列进
行多序列比较构建系统树。
1． 4 ANS基因转录水平的分析
根据从黑芥已克隆的 2 个 ANS 基因序列的差
异，设计引物 ANS1D 和 ANS2D(表 1) ，利用半定量
ＲT － PCＲ法分别检测基因 BnANS1 和 BnANS2 的表
达，模板分别为各材料授粉后 15d 和 25d 的种皮和
胚的 ＲNA反转录产物。利用看家基因 Actin 的表达
水平作为内参，其引物序列见表 1。PCＲ 反应体系
总体积为 20μL，含 10 × PCＲ buffer (2． 0μL，含
MgCl2)、dNTP mix(10mmol· L
－1 each，0． 3μL)、
10mmol·L －1正向引物(1μL)、10mmol·L －1反向引
物(1μL)、1U Taq DNA聚合酶、1μL反转录产物、无
菌去离子水(补足到 20μL)。引物 ANS1D的扩增程
序是 94℃预变性 3min;94℃变性 30s，58℃退火 30s，
72℃延伸 30s，循环 30 次;最后 72℃延长 6min。引
物 ANS2D和引物 ACT扩增退火温度分别是 50℃和
54℃，其他同 ANS1D的扩增程序。
1． 5 等位基因特异 PCＲ检测 ANS基因多态性
根据黑芥、甘蓝和白菜 ANS 基因的多态性位
点，参照文献［16 ～ 18］和 ANS 序列的特性，通过多
次设计引物和优化 PCＲ条件，获得了 1 对 B 基因组
特异的引物 B － ANS，在上游引物的 3’的倒数第 3
位引入 1 个碱基的错配，由 C改为 A，引物序列见表
1。PCＲ反应体系总体积为 20μL，含 10 × PCＲ buff-
er (2． 0μL，含 MgCl2)、dNTP mix (10mmol· L
－1
each，0． 3μL)、5mmol·L －1正向引物(1μL)、5mmol
·L －1反向引物(1μL)、1U Taq DNA 聚合酶、50ng
DNA模板、无菌去离子水(补足到 20μL)。PCＲ 扩
增程序如下:94℃预变性 3min;94℃变性 45s，61℃
退火 30s，72℃延伸，延伸时间 50s，循环 35 次;最后
72℃延长 6min。用 1． 5%浓度的琼脂糖凝胶电泳分
离 PCＲ后的产物，在凝胶成像系统(Bio － ＲAD)中
拍照，片段大小用分子量标准进行估计。
2 结果与分析
2． 1 黑芥 ANS基因的克隆
用引物 ANSU 扩增黑芥总 DNA 获得 1 条大小
约 1 400bp左右带，扩增紫叶芥种皮 cDNA获得了 1
条大小约 1 300bp 带。序列分析发现，在黑芥总
DNA 含有 2 条长度分别为 1 366bp (命名为
BnANS1)和 1 367bp(命名为 BnANS2)的序列，在黑
芥种皮 cDNA 中也获得与 BnANS1 和 BnANS2 对应
的序列，长度分别为 1 290bp(命名为 cBnANS1)和
1 291bp(命名为 cBnANS2)的序列。序列比对发现
所获得的 2 个 ANS基因拷贝都含有 1 个内含子(图
1 中下划线序列) ，2 个 ANS拷贝的起始编码子都为
ATG，终止编码子为 TAA。比较这 2 个序列发现，在
编码区、5与 3非编码区和内含子区域都有多态性，
BnANS1 与 BnANS2 相比，5有 3 个碱基的多态性和
4 个碱基的缺失，编码区有 26 个碱基的多态性，内
含子有 2 个碱基的多态性，3非编码区有 18 个碱基
的多态性和 3 个碱基的插入，见图 1。将所克隆的 2
个 ANS基因的 DNA序列在 NCBI 上进行比对，发现
BnANS1 与已公布的芸薹属 ANS和拟南芥 ANS 基因
序列的 E值均为 0． 0，与白菜型油菜(B． rapa)的 2
个 ANS全长序列(EU402414，EU402415． 1)相似性
最高，都为 95%;发现 BnANS2 与已公布的芸薹属物
种的 ANS和拟南芥 ANS基因序列的 E 值均为 0． 0，
BnANS2 与白菜的 2 个 ANS 全长序列(EU402414，
EU402415． 1)和甘蓝的 ANS 全长序列(GU170203)
相似性最高，都为 95%，因此认为，本研究所克隆的
这 2 个基因就是黑芥的 ANS基因。
2． 2 推导 ANS氨基酸序列与分子进化分析
根据黑芥 ANS 基因的 cDNA 序列，利用软件
DNAMAN 6． 0 推导蛋白质序列(图 2)。cBnANS1 和
cBnANS2 都编码 356 个氨基酸，分别命名为 PB-
nANS1 和 PBnANS2。2 个编码的蛋白序列相比，有
9 个多态性位点(图 2)。在线(http:/ /www． iut －
arles． up． univ － mrs． fr)对编码蛋白质分析发现 PB-
nANS1 分子量为 40 448． 58 Da，推测的等电点(pI)
为 5． 05;PBnANS2 分子量为 40 468． 52Da，推测的 pI
为 5． 04。在线(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /
Structure /cdd)进行保守区域分析，结果表明，黑芥
花色素合成酶属于 2OG － Fe(II)加氧酶超家族。
BLASTp分析(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /
blastp)结果表明，黑芥的 2 个 ANS 编码蛋白与许多
其他植物的花色素合成酶有高度同源性，与已公布
的拟南芥和芸薹属物种的 ANS 蛋白的 E 值都为
0． 0，其中 PBnANS1 与白菜(ABY89681)、芥菜型油
菜(ACH58397)和甘蓝(AAO73440)ANS 同源性最
高，为 96%。PBnANS2 与白菜(ABY89681)ANS 同
源性最高为 95%。可以推定在黑芥中，PBnANS1 和
PBnANS2是白菜、芥菜型油菜、甘蓝和拟南芥等物
684 中国油料作物学报 2013，35(5)
注:下划线序列为内含子，黑体为起始编码子 ATG和终止编码子 TAA，－代表缺失的碱基，碱基的小写代表多态性位点
Note:The intron is solid － underlined，bold letters are the start codon ATG and the stop codon TAA，
－ means base deletion，lower － case letters are the base polymorphisms
图 1 黑芥的 2 个 ANS基因的核苷酸序列
Fig． 1 Nucleotide sequence of 2 ANS gene in Brassica nigra
图 2 PBnANS1 和 PBnANS2 氨基酸序列
Fig． 2 Amino acid sequence of PBnANS1 and PBnANS2
种 ANS的同源蛋白。在线(http:/ /www． ebi． ac． uk /
Tools /msa /clustalw2)多序列比较结果表明，黑芥的
ANS与多种高等植物的 ANS 蛋白的氨基酸序列系
统进化上有高度保守性，与白菜、芥菜型油菜和甘蓝
的 ANS基因属于一类(图 3)。
2． 3 ANS基因在黑芥种皮和胚中的表达
分别以授粉 15d和 25d 的黑芥种皮和胚的 cD-
NA为模板，用 ANS1D、ANS2D 和 ACT 引物进行扩
增(表 1) ，结果表明，BnANS1 和 BnANS1 基因在
所有供试材料的种皮和胚中均有表达，BnANS1和
784严明理等:黑芥 ANS基因的克隆和在芸薹属 B基因组的 PCＲ鉴别
BnANS2 在授粉 15d 的种皮中的表达量明显低于授
粉 25d的种皮，但在授粉 15d 和 25d 的胚中无明显
不同，授粉 25d的种皮表达量高于 25d的胚(图 4)。
注:PBnANS1:黑芥;PBnANS2:黑芥;ABY89681:白菜;
ACH58397:芥菜型油菜;AAO73440:甘蓝;AAB82287:紫罗兰;
XP_002867745:玉山筷子芥;NP_194019:拟南芥;
ABB70119:西洋梨;ABX89941:桃树;AEN19292:李;
ADZ54785:甜樱桃;ABW69683:圆叶牵牛;AAT02642:
甜橙;ADD51355:可可树;AEN71543:牡丹;AFI71900:芍药
Note:PBnANS1:Brassica nigra;PBnANS2:Brassica nigra;
ABY89681:Brassica rapa;CH58397:Brassica juncea;
AAO73440:Brassica oleracea;AAB82287:Matthiola incana;
XP_002867745:Arabidopsis lyrata;NP_194019:
Arabidopsis thaliana;ABB70119:Pyrus communis;
ABX89941:Prunus persica;AEN19292:Prunus
salicina;ADZ54785:Prunus avium;ABW69683:
Ipomoea purpurea;AAT02642:Citrus sinensis;
ADD51355:Theobroma cacao;AEN71543:Paeonia
suffruticosa;AFI71900:Paeonia lactiflora
图 3 黑芥 ANS氨基酸序列与其他植物 ANS
氨基酸序列通过 clustalw2． 0 构建的进化树
Fig． 3 Phylogenetic tree generated by clustalw2． 0 of
ANS amino acid sequences from Brassica
nigra and other higher plants
注:S15:授粉 15d种皮;S25:授粉 25d种皮;
E15:授粉 15d胚;E25:授粉 25d胚
Note:S15:5 DAP (days after pollination)
seed coats;S25:25 DAP seed coats;E15:15 DAP
embryos;E25:25 DAP embryos
图 4 ANS基因在黑芥种皮和胚中的转录
Fig． 4 Transcription levels of ANS in seed coats
and embryos of Brassica nigra
2． 4 等位基因特异 PCＲ 检测 ANS 基因的核苷酸
变异位点
根据芸薹属 3 个基本种的 ANS 基因序列的特
征，设计了 B基因组 ANS基因核苷酸变异位点的检
测引物，对供试材料进行 PCＲ 扩增。引物 B － ANS
在禹氏三角的 6 个芸薹属物种中的 PCＲ 产物显示
了其在 B基因组特异性扩增(图 5) ，即只在含 B 基
因组材料中扩增出目的带，说明可以利用引物 B －
ANS区分 B基因组来源的 ANS 基因。通过 PCＲ 检
测 ANS基因序列中核苷酸的变异位点，可以有效地
鉴别芸薹属植物的 ANS的基因组来源。
注:M:分子量标准;A:白菜;B:黑芥;C:甘蓝;AB:芥菜型油菜;
AC:甘蓝型油菜;BC:埃塞俄比亚芥;N:空白对照
Note:M:Molecular marker;A:B． rapa:;
B:B． nigra;C:B． oleracea;
AB:B． juncea;AC:B． napus;BC:B． carinata;N:Negative control
图 5 PCＲ检测来自芸薹属不同基因组的 ANS基因
Fig． 5 ANS specific PCＲ from different Brassica genomes
3 讨论
本研究从黑芥中克隆获得 2 个 ANS 基因全长
序列，序列分析表明，ANS基因在芸薹属物种中具有
高度的序列保守性。这 2 个基因在供试的黑芥的种
皮和胚中都表达，BnANS1 和 BnANS2 在授粉 15d 种
皮中的表达量明显低于授粉 25d 的种皮，但在授粉
15d和 25d的胚中没有明显的不同，25d的种皮中的
表达量明显高于同期胚中的表达量。在芥菜型油菜
黑籽中的组织化学分析表明种皮中原花色素含量高
于胚，本研究的黑芥种皮是黑色的，而胚是黄色的，
由于 ANS 是合成原花色素所必需的酶［4，5］，根据
ANS的表达和参考近缘种中的研究结果，可以推断
在黑芥中 ANS 的表达量与原花色素的含量成正相
关，且种皮的原花色素含量会高于胚。在芥菜型油
菜四川黄籽种皮中 ANS 基因不表达致使后续的花
色素和原花色素不能合成［5］，就不能产生原花色素
等有色物质，导致种皮透明而呈现黄籽性状;而紫叶
芥等黑籽芥菜型油菜种皮中 ANS 基因能检测表达。
洋葱鳞茎［19］、萝卜地下茎［20］、葡萄果皮［21］、大豆种
皮［22］、大丽花的花冠［23］、芍药的花冠［24］、水稻下胚
轴等［25］组织器官的颜色形成都需要 ANS的表达，这
些物种中的 ANS基因表达受阻或突变，都会表现出
无色或白色等性状，可以推断 ANS 基因表达是部分
植物器官颜色形成的关键。本研究的黑芥种皮中的
ANS基因也能检测到表达，且种皮为黑色，这个与芥
菜型油菜的 ANS 基因的表达与种皮颜色的关系相
符［5］，由于 ANS基因的表达是合成原花色素所必需
的，可以推断在植物中，原花色素合成和种皮颜色的
产生有着共同的机制。
对比已公布的芸薹属的 ANS 序列，在黑芥
BnANS2 的 5的非编码序列中有 agtt 碱基的插入，
BnANS1 的 3的非编码序列中有 tcg 碱基的插入，我
们在设计用来检测 B 基因组特异引物时引入这些
884 中国油料作物学报 2013，35(5)
位点，只能在黑芥中扩增到，但在芥菜型油菜和埃塞
俄比亚芥中未能获得扩增产物(数据未显示) ，同时
也发现在甘蓝(AY228485)中的 3’的非编码序列与
芥菜型油菜和白菜的差异远大于编码区。在芥菜型
油菜原花色素合成的结构基因 DFＲ(dihydroflavonol
4 － reductase) ，ANS 等基因序列在黄黑籽中没有差
异，认为这些基因表达是转录因子与非编码区结合
来调节的［5，15］。由于 ANS 受许多转录因子基因
(MYB和 bHLH 等)的调节［2，26，27］，转录因子结合位
置是在非编码区，考虑到目前在自然界还未发现黑
芥和甘蓝的黄籽材料，我们推断可能是由于黑芥和
甘蓝的 ANS基因的非编码区有许多原花色素合成
转录因子基因的结合位点，从而促进 ANS 的表达而
合成原花色素，因而在黑芥和甘蓝中未能天然地产
生黄籽。在拟南芥中，ANS 的表达基因受其他基因
的调节［2，28］。在黑芥中，ANS 基因被调控的模式如
何，对植物器官颜色有何影响，还需进一步研究。
由于芸薹属的几个物种在进化和遗传上的高度
同源性，不同类型油菜中 A /B /C基因组的快速鉴别
是芸薹属植物分类研究者遇到的一个难题。芸薹属
中的 3 个基本种和 3 个异源四倍体物种都具有十分
丰富的亚种、变种和地方种变异，它们之间的杂种后
代由于变异类型的多样性和形态的相似性，有时从
形态学鉴别非常困难，目前虽然有基因组原位杂交
方法来辨别，但操作比较复杂，一般的实验室不易实
现［13，29］，寻找一种简便的辨别芸薹属杂种后代基因
组来源的方法很有必要。本研究结果证实，基于黑
芥 ANS基因序列的等位基因特异 PCＲ 可以准确地
识别 B基因组。用 PCＲ 技术检测的黑芥 ANS 基因
的特异序列，可以判定 ANS序列是否源于 B 基因组
或黑芥，为区分形态相似、变异复杂的芸薹属植物提
供了一种可靠的手段，为芸薹属的分子系统学研究
提供依据。在芸薹属的远缘杂交育种中，常常需要
鉴别真假杂种，可以利用本研究开发的 ANS 基因识
别位点，通过检测 B基因组 ANS 基因的有无来鉴别
真假。在转基因芸薹属植物的基因漂移分析中，尤
其是在缺少筛选标记的情况下，不同物种杂交率的
检测是一个难题，本研究提供 B 基因组的 ANS 识别
位点可以为解决该难题提供有效手段。随着芸薹作
物远缘杂交和转基因研究的进行，ANS 基因可用作
为芸薹属花粉传递的候选标记，也可为转基因油菜
花粉漂移检测时提供依据，为基因漂移风险分析提
供新方法［12］。
ANS基因在拟南芥中只有 1 个拷贝，芸薹属基
本种的基因组大小约是拟南芥的 3 倍，理论上每个
基因组来源同源基因应该有 2 个或更多拷贝［30，31］，
但结合白菜基因组测序的结果(http:/ /brassicadb．
org /brad /)［32］和本研究的结果发现 ANS 基因在芸
薹属物种的拷贝数并没有预测的那么多，在已测序
的白菜中 ANS 也只有 2 个拷贝，我们在黑芥的 ANS
基因克隆过程中，挑选 10 个阳性菌落测序也只获得
了 2 个拷贝，这可以推断功能基因的拷贝数与基因
组的大小不一定有相关性，为物种基因组中功能基
因的拷贝数的发掘提供了参考，但在黑芥中 ANS 基
因究竟有几个拷贝还需要通过基因组测序或 DNA
文库筛选测序等方法才能确定。
4 结论
通过同源克隆在黑芥获得了 2 个 ANS 基因拷
贝 BnANS1 和 BnANS2，长度分别为 1 366bp 和1 367
bp。这 2 基因都含有 1 个内含子，都编码一个 356
个氨基酸的蛋白，具有其他物种中已有的 ANS 蛋白
保守结构域，属于 2OG － Fe(II)加氧酶超家族;ANS
在黑芥的种皮和胚中均检测到表达;比较 2 个 ANS
基因拷贝 BnANS1 和 BnANS2，发现在编码区、内含
子、5和 3非编码区都有多态性。与 BnANS2 相比，
BnANS1 的 5有 3 个碱基的多态性和 4 个碱基的缺
失，编码区有 26 个碱基的多态性，内含子有 2 个碱
基的多态性，3有 18 个碱基的多态性和 3 个碱基的
插入，编码的蛋白有 9 个多态性位点。通过多次设
计引物和优化 PCＲ条件，获得了 1 对能检测 B 基因
组 ANS基因的引物，利用等位特异 PCＲ可以区分来
自芸薹属 B基因组的 ANS基因。
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(责任编辑:郭学兰)
094 中国油料作物学报 2013，35(5)