全 文 ：山羊草属二倍体物种亲缘关系的 RAPD分析
蔡从利 ,王建波 ,朱英国
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室 ,湖北武汉 430072)
摘　要:利用 24 个随机引物对山羊草属 12 个二倍体物种的亲缘关系进行了 RAPD分析 ,对扩增出的 304 条带进
行聚类分析。结果发现:(1)Sitopsis 组内各物种的亲缘关系与前人的研究基本一致;(2)Ae.mutica 与 Comopyrum
组的各物种亲缘关系较近;(3)Ae.uniaristata 与同组的另两个物种亲缘关系较远 , 应将其从该组中独立出来;(4)
Ae.caudata 与 Ae.umbellulata 为亲缘关系较近的两个物种。
关键词:山羊草属;二倍体;亲缘关系;RAPD
中图分类号:Q349　　　文献标识码:A　　　 文章编号:0253-9772(2001)03-0229-05
RAPD Analysis on the Relationship among
the Diploid Species in Aegilops
CAI Cong-li ,WANG Jian-bo ,ZHU Ying-guo
(Key Laboratory of MOE for P lant Developmen tal Biology , Wuhan U niversity , Wuhan , Hubei 430072 , China)
Abstract:RAPD analysis was performed by a set of 24 arbitrary primers to 12 diploid species in Aegilops.Results were
observed based on the examination of 304 RAPD fragments.The relationship in the Section Sitopsis is consistent with the
former investig ation.Ae.mutica had a relatively close relationship w ith the species o f the Section Comopyrum.Ae.u-
niaristata had a far relationship with the other two species of the Section Comopy rum , indicating that it should be excluded
from this section.Ae.caudata and Ae.umbellulata had a close relationship.
Key words:Aegilops;diploid species;relationship;RAPD
　　山羊草属(Aegi lops)是禾本科(Poaceae)小麦族
(Triticeae)中的一个重要属 ,该属约有 24 ～ 25种 ,
其中 12个种为二倍体 ,其余的则是由不同二倍体杂
交和多倍化后形成的异源四倍体或六倍体。在小麦
族中山羊草属与小麦属(Tri ticum)亲缘关系最密
切 ,在栽培小麦的起源和进化中起着重要作用 ,是小
麦育种的重要遗传资源 ,研究该属二倍体的亲缘关
系对于认识优良基因的遗传背景和多倍体的起源与
进化都具有重要的意义。Eig 等根据形态和地理分
布的差异将山羊草属分为 6 个组:其中 Ae.spel-
toides 、Ae.bicornis 、Ae.longissima 、Ae.sharonen-
sis等物种属于 Sitopsis 组;Ae.umbel lulata 属于
Polyeides组;Ae.caudata 属于 Cylindropyrum 组;
Ae.comosa 、Ae.heldreichi i 和 Ae.uniaristata 属
于 Comopy rum 组;Ae.mutica 属于 Amblyopy rum
组;Ae.squarrosa 属于 Vertebrata 组[ 1] 。Kihara总
结前人和自己的研究 ,按照该属二倍体物种基因组
的组成和相似程度将它们分为 C 、M 、S 三个类群:
其中 C 类群包括 Ae.caudata 和 Ae.umbel lulata;
M 类群包括 Ae.comosa 、Ae.heldreichii 、Ae.u-
niaristata 、Ae.mutica 和 Ae.squarrosa;S 类群
包括 Ae .speltoides 、Ae.bicornis 、Ae .longissima和
收搞日期:2000-06-19;修回日期:2000-11-13
基金项目:国家自然科学基金资助项目(批准号 39770056)
作者简介:蔡从利(1974-)男 ,硕士 ,研究方向:植物进化遗传学
通讯联系人:王建波(1964-)男 ,博士 ,教授 ,专业:植物遗传学。 Tel:027-87682213 , E-mail:jbwang@w hu.edu.cn
致　　谢:日本京都大学 Taihachi Kawahara博士和中国农科院作物品种资源研究所杨欣明先生提供实验种子 ,在此一并致谢。
遗　传 HEREDITAS(Beijing)23(3):229 ～ 233 , 2001　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　研究报告
DOI :10.16288/j.yczz.2001.03.013
Ae.sharonensis ,每个类群内的物种具有相似的基因
组和较近的亲缘关系[ 2] 。这些分类方法为以后的
研究奠定了基础 ,但是随着更多形态学 、细胞学和分
子生物学证据的积累 ,一些争议相继出现 ,如 Si top-
sis组内各物种的相互关系 、Ae.mutica 的分类地
位 、Ae.uniaristata 与同组的其他物种的相互关系
等 ,很多问题到现在还没有定论 ,有必要进行深入研
究[ 3 ,4 ,5] 。
RAPD技术自其发明后即被广泛地运用于遗传
多样性和系统发育研究。Wei等用该技术研究了小
麦族 22个二倍体物种基因组的相互关系 ,张继益等
用此方法对旱麦草属 11份材料的亲缘关系进行了
研究 ,得到了与其他研究方法基本相同的结论 ,证明
它是研究植物亲缘关系和系统发育的一种有效手
段[ 6 , 7] 。对于山羊草属 ,孔秀英等用这种方法研究
了该属 5个基本基因组的系统发育关系[ 8] ,但对所
有二倍体物种系统发育关系的研究还没有进行 。本
文用 RAPD方法研究山羊草属 12个二倍体物种基
因组之间的相似性及分化程度 ,旨在为进一步明确
这些物种的亲缘关系 ,并为研究该属多倍体物种的
起源与进化打下基础。
1　材 料和 方 法
1.1　材料
本实验所用山羊草属 12个二倍体物种及其相
关特征见表 1。
表 1　实验材料及其主要特征
Table 1　Materials and their major characters used in this study
序　号 　　种　　名 基　因　组 　　分　类　地　位 　　来　　源＊
1 Aegilops bicornis SbSb Sect.Si topsis ICGR Ae4
2 Ae.longissima SlSl Sect.Si topsis ICGR Ae154
3 Ae.speltoides SS Sect.Si topsis ICGR Ae49
4 Ae.searsii SsS s Sect.Si topsis KU 4-6
5 Ae.sharonensis SshSsh Sect.Si topsis ICGR Ae29
6 Ae.squarrosa DD Sect.Vertebrata ICGR Ae46
7 Ae.mu tica T T Sect.Amblyopyrum KU 5521
8 Ae.ca udata CC Sect.Cylindropyrum ICGR Y45
9 Ae.umbel lulata U U Sect.Polyeides ICGR Y137
10 Ae.uniar istata NN Sect.Comopyrum KU 19-3
11 Ae.comosa MM Sect.Comopyrum ICGR Y258
12 Ae.heldreichii M hM h Sect.Comopyrum KU 18-2
　＊　KU 指日本京都大学 , ICG R指中国农业科学院作物品种资源研究所。
1.2　方法
采用 CTAB微量法提取植物总 DNA ,具体操作
参见 Doyle等的方法[ 9] 。
PCR反应在 PE480 型 PCR仪上进行 ,引物采
用Sangon公司的 10bp随机引物。反应体系 25μL:1
×PCR 缓冲液 [ 10mmol/L Tris -HCl(pH 8.3),
50mmol/L KCl , 0.001%gelatin] , 1.5mmol/L MgCl2 ,
0.5μmol/L 随机引物 , 320μmol/L dNTPs ,约 30ng 模
板DNA ,1U Taq 酶 ,超纯水补至 25μL ,上覆 30μL 矿
物油。扩增程序如下:94℃预变性 5min;然后 94℃变
性1min ,36℃退火1min ,72℃延伸 1.5min ,共 40个循
环;最后 72℃延伸 7min。电泳检测:取扩增产物加适
量点样缓冲液后 ,在含有 0.5g/L 溴化乙锭的 1.6%
琼脂糖胶中以1×TAE 为缓冲液电泳2 ～ 3 h(4 ～ 5V/
cm),然后在紫外灯下观察照相。
将重复性好的带用于统计 ,将有带赋值为 1 ,无
带赋值为 0。用 RAPDDIS T 程序计算各样品间的
Nei氏遗传距离 D , D =1-2N xy/(N x +N y), 其中
N x为样品 x 具有带的条数 , N y 为样品 y 具有带的
条数 , N xy为两样品共有带的条数 。用 PHYLIP3.5c
软件包的 Neighbor 程序按 UPGMA 方法(Un-
weighted pair g roup method w ith arithmetic mean)进
行聚类分析 。
2　结 果与 分 析
对 Sangon公司的 140 个 10bp 引物进行筛选 ,
选择能够扩增出清晰 、稳定带的引物(共 24个)进行
正式扩增并参与统计 。这些引物共扩增出 304条
带 ,每个引物扩增出的带在 4 ～ 20条之间 ,平均每个
引物扩增出约 12.3条带。在 304 条带之中 ,仅有
230　　　　　　　　　　　　　　　　　　　遗　传 HEREDITAS(Beijing)2001　　　　　　　　　　　　　　　23卷
17条带为各物种所共有(5.59%),其余的 287条带
都表现出多态性 ,表明山羊草属各二倍体物种之间
的分化程度很高 。图 1分别是引物S250和 S324扩
增产物经电泳所形成的带谱 。
图 1　引物 S250(a)和 S324(b)扩增产生的 RAPD带谱
Fig.1　RAPD patterns generated by primers S250 and S324
Numbers upon the lanes represent the accession listed in Table 1.M indicatesλDNA/ EcoRⅠ +HindⅢ marker.
　　Nei氏遗传距离见表 2 , UPGMA聚类分析所得
的树状图见图 2 。从聚类图看 ,以遗传距离 D =0.
45为阈值 ,山羊草属 12个二倍体物种可分为 A 、B 、
C 三支 。在 A 支里面 , Ae.bicornis 、Ae.sharonen-
sis 、Ae.longissima 和 Ae.searsii 等 4 个物种聚成
一小支;Ae.spel toides 和 Ae.squarrosa 则聚成另
一小支 。B 支由 Ae.comosa 、Ae .heldreichi i 、Ae.
mutica 和Ae.uniaristata等 4个物种组成 ,其中前
两者最先聚在一起 ,它们再和 Ae.mutica 聚在一
起 ,最后和 Ae.uniaristata 聚在一起 。C 支由 Ae.
caudata 和 Ae.umbellulata 2个物种组成 。
表 2　山羊草属 12 个二倍体物种的的 Nei氏遗传距离＊
Table 2　Nei genetic distance between 12 diploid species in Aegilops
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 —
2 0.2169 —
3 0.4861 0.3711 —
4 0.3857 0.3496 0.4385 —
5 0.2046 0.2744 0.4463 0.4231 —
6 0.4780 0.3638 0.2294 0.4155 0.4385 —
7 0.5447 0.5025 0.4861 0.4943 0.5361 0.4005 —
8 0.5447 0.4231 0.5192 0.4155 0.4700 0.4463 0.4463 —
9 0.5447 0.4861 0.4700 0.5621 0.5361 0.5276 0.5108 0.4005 —
10 0.5276 0.4541 0.5192 0.4943 0.5709 0.5276 0.4463 0.4780 0.5447 —
11 0.4541 0.4620 0.4780 0.4700 0.4943 0.5361 0.3216 0.4385 0.4385 0.4385 —
12 0.4780 0.4700 0.4541 0.4620 0.5192 0.4943 0.2744 0.4620 0.4943 0.3857 0.1109 —
　＊　表中各序号与表 1相同
3　讨　论
山羊草属与小麦属亲缘关系非常接近 ,因而有
关该属系统发育的研究非常多 ,但是由于该属各物
种之间的关系非常复杂 ,从形态学 、细胞学和分子生
物学所得的结果还存在许多矛盾 ,因而有必要进行
更深入的研究 。从本研究所得的聚类图看 , 12 个
二倍体物种聚为 A 、B 、C 三支 ,除 Ae.squarrosa 之
外 ,其他各物种在聚类图上的地位与它们在 Kihara
所确定的三个类群中的地位基本相同 , 它表明
RAPD所得的结论与前人的研究基本是相符的 ,但
是在各分支的内部 ,各物种之间的关系还有待讨论。
2313 期　　　　　　　　　　　　　蔡从利等:山羊草属二倍体物种亲缘关系的 RAPD分析　　　　　　　　　　　　　
图 2　根据 RAPD数据用 UPGMA法构建的聚类图
Fig.2　Dendrogram generated based on the
RAPD data using UPGMA methods
　　对 A 支的 6个物种而言 , Ae.speltoides 、Ae.
bicornis 、Ae.longissima 、Ae .sharonensis 和 Ae.
searsii 属于 Sitopsis组 ,而 Ae.squarrosa 属于 Ver-
tebrata 组。在聚类图上 , Ae.bicornis 、Ae.sharo-
nensis两个物种最先聚在一起 , 然后二者和 Ae.
longissima 聚在一起 ,3 个物种遗传距离非常接近 ,
表明它们有密切的亲缘关系;然后这三者和 Ae.
searsii 聚在一起 ,最后和 Ae.speltoides 聚在一起 。
这种聚类关系与 Dvo rak等对该组各物种重复序列
的研究和 Sasanuma 等的 RFLP 分析结果基本一
致[ 3 ,10] , 不过他们的研究表明 , Ae.longissima 和
Ae.sharonensis亲缘关系更近 ,而我们的研究却未
能区分这一点。从核型 、C-带带型 、原位杂交和核
rDNA的 ITS 序列得到的证据表明 Ae .spel toides
与同组其他 4个物种存在明显差别 ,认为应将其从
该组独立出来[ 5 , 11 ,12] ,我们的研究表明它们的确有
差别 ,但并不是太明显 。对于 Ae.squarrosa ,目前
还没有证据表明它和 Ae.speltoides 的亲缘关系较
近 ,二者聚在一起的原因还需进一步研究。对 B 支
的4个二倍体物种之间的亲缘关系 ,前人做了很多
研究 。关于 Ae.comosa 和 Ae.heldreichi i ,二者在
形态 、核型和重复序列等方面都很相似 ,很多研究者
都将二者作为一个种的两个亚种[ 5 , 13] ;但 Tanaka却
认为二者为两个不同物种[ 14] 。在本研究中的所有
的二倍体物种中 , Ae.comosa 和 Ae.heldreichii 最
先聚在一起 ,二者之间的遗传距离为 0.119 ,表明二
者亲缘关系非常接近 ,但也存在一些差别 。关于
Ae.mutica 的分类地位 , 一直存在较大的争议 ,
Ae.mutica 和 Ae.speltoides 是山羊草属二倍体中
仅有的两个异花传粉物种 ,二者都有 B 染色体 ,核
型相似 ,杂交子代染色体配对行为正常 ,从这些特征
来看二者具有较近的亲缘关系[ 4 , 13] ;但 C-带研究
和原位杂交表明 Ae .mutica与 Si topsis组中的 Ae.
bicornis 、Ae.searsii 等物种亲缘关系较近[ 5 , 10 ,15] ;
Dvorak等研究该属重复片段的差异时却发现 Ae.
mutica 与 Ae.comosa 、Ae.uniaristata 等聚在一
起 ,表明它与 Comopyrum 组的物种亲缘关系较
近[ 10] 。从本研究的聚类图上看 , Ae.mutica与 Ae.
comosa 、Ae.heldreichi i构成一支 ,表明它们的亲缘
关系较近 , 支持 Dvorak 等的结论 。关于 Ae.u-
niaristata ,最初的研究认为它与 Ae.comosa 、Ae.
heldreichi i的亲缘关系很近 ,三者同属 Comopy rum
组 ,其基因组是由 M 基因组修饰而来 ,并将其基因
组符号定为 M [ 1 ,2] 。但后来的研究表明 Ae.u-
niaristata 与同组的其他两个物种的基因组在随体
的数目和位置 、C-带带型 、原位杂交图谱等方面存
在很大差异 ,应从 Comopy rum 组独立出来 ,并将其
基因组符号定为 N[ 5 ,11 , 16] 。本研究的结果表明 Ae.
232　　　　　　　　　　　　　　　　　　　遗　传 HEREDITAS(Beijing)2001　　　　　　　　　　　　　　　23卷
uniaristata与 Ae.comosa 、Ae.heldreichii 的遗传
距离已达到 0.4385 ,大于 Ae.mutica 与 Ae.co-
mosa 、Ae.heldreichii 之间的遗传距离 , 应将 Ae.
uniaristata从 Comopyrum 组独立出来。
对于 C支的 Ae.caudata 和 Ae.umbellulata ,
经过多年的研究现在已经有比较明确的结论。 Ae.
caudata具 C 基因组 ,属于 Cylindropy rum 组;Ae.
umbellulata 具 U 基因组 ,属于 Polyeides组 。虽然
两物种分属不同的组 ,但二者亲缘关系较近 , 其核
型 、C-带带型 、原位杂交图谱都比较相似 ,如二者
均具近端部着丝粒 , 1号 、5号染色体具随体 , C-带
主要为中间带等[ 5 , 17 ,18] ;但二者在异染色质含量 、
染色体配对行为等方面也表现出较大的差别[ 19 , 20] 。
从本研究的结果看 , Ae.caudata 和Ae.umbellula-
ta聚为独立一支 ,表明它们关系较近 ,但其分化距
离已达到 0.4005 ,说明二者还是有很大的差别。孔
秀英等对山羊草属 5 个基本基因组系统发育的
RAPD分析和王超等对该属核 rDNA的 I TS 序列的
分析都得到类似的结论[ 8 , 12] 。
参 考 文 献(References):
[ 1] 　Eig A.Monographisch-kritische ǜbersicht der Gat tung Aegilops
[ M] .Rep Spec Nov Reg Vegetabil , Publ Selbverlag Dahlen bei
Berlin.1929 , 55:1～ 128.
[ 2] 　Kihara H.Considerations on the evolution and dist ribution of
Aegi lops species based on the analyser -method[ J] .Cytologia ,
1954 , 19:336～ 357.
[ 3] 　S asanuma T , Miyasita N T.Wheat phylogeny determined by
RFLP analysis of nuclear DNA.3.Int ra-and inter-specific varia-
t ions of five Aegilops species[ J] .Theor Appl Genet , 1996 , 92:
928～ 934.
[ 4] 　Ohta S.Phylogenet ic relationship of Aegi lops mut ica Boiss.with
the diploid species of congeneric Aeg ilops-Tr it icum complex ,
based in the new method of genome analysis using it s B-chromo-
somes[ J] .Mem Coll Agric Kyoto Univ , 1991 , 137:1～ 116.
[ 5] 　Badaeva E D , Friebe B, Gill B S.Genome dif ferentiation in
Aegi lops 1.distribution of highly repetit ive DNA sequences on
chromosomes of diploid species[ J] .Genome , 1996 , 39:293～ 306.
[ 6] 　Wei J Z ,Wang R R-C.Genome-and species-speci fic markers and
genome relationships of diploid perennial species in Triticeae based
on RAPD analysi s[ J] .Genome , 1995 , 38:1230～ 1236.
[ 7] 　张继益 ,董玉琛 ,贾继增 ,等.旱麦草属种质资源的随机扩增多
态性 DNA(RAPDs)分析[ J] .遗传学报 , 1999 , 26:54～ 60.
[ 8] 　孔秀英 ,葛春民 ,贾继增 ,等.山羊草属五个基本基因组系统发
育的 RAPD分析[ J] .植物学报 , 1999 , 41:393～ 397.
[ 9] 　Doyle J T , Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small
quantit ies of f resh leaf t issue[ J] .Phytochemical Bullet in , 1987 ,
19:11～ 15.
[ 10] Dvorak J , Zhang H B.Reconstruct ion of the phylogeny of the
genus Tr it icum from variat ion in repeated mucleotide sequences
[ J] .Theor Appl Genet , 1992 , 84:419～ 429.
[ 11] Badaeva E D , Friebe B, Gill B S.Genome dif ferentiation in
Aegi lops.2.physical mapping of 5S and 18S - 26S ribosomal
RNA gene families in diploid species[ J] .Genome , 1996 , 39:1150
～ 1158.
[ 12] 王　超 ,施苏华 ,王建波,等.山羊草属二倍体物种核 rDNA ITS
区序列及其系统发育关系分析[ J] .植物学报 , 2000 , 42:507 ～
511.
[ 13] Chennaveeraiah M S.Karyomorphologic and cytotaxonomic stud-
ies in Aegi lops[ J] .Acta Horti Gotob , 1960 , 23:85～ 186.
[ 14] Tanaka M.The relationship of the M and Mu genomes of
Aegi lops[ J] .Wheat Inf Serv , 1985 , 60:39.
[ 15] Friebe B, Badaeva E D , Hammer K , et a l.S tandard karyotypes of
Aegi lops uniar istata , Ae.mut ica , Ae.comosa ssp.comosa and
ssp.heldreichi i(Poaceae)[ J] .Plant Syst Evol , 1996 , 202:199 ～
210.
[ 16] Teoh S B , Hutchinson J.Interspecif ic variat ion in C -banded
chromosomes of diploid Aegi lops species[ J] .Theor Appl Genet ,
1983 , 65:31～ 40.
[ 17] Kimber G , Abu-Baker M , The genomic relationship of Trit icum
dichasians and T.umbel lu latum[ J] .Z Pflanzenzucht , 1981 , 87:
265～ 273.
[ 18] Miller T E.Chromosome pairing of intergenetic amphiploids as a
means of assessing genome relationships in the T rit iceae[ J] .Z
Pflanzenzucht , 1981 , 87:69～ 78.
[ 19] Friebe B, Schubert V , Bluthner W D , et al.C-banding pat tern
and polymorphism of Aegi lops caudata and chromosomal const itu-
tions of the amphiploid T.aestivum -Ae.cauda ta and six de-
rived ch romosome addition lines[ J] .Theor Appl Genet , 1992 , 83:
589～ 596.
[ 20] Friebe B, Jiang J , Tuleen N , et a l.Standard karyotype of
Tri ticum umbellulatum and the iden tification of T.umbellu la-
tum ch romat in in common w heat[ J] .Theor Appl Genet , 1995 ,
90:150～ 156.
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