全 文 ：2012 年 22(3) 生 物 技 术
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正交设计优化紫萼藓科植物的 ISSR － PCR反应体系
刘卓，沙伟* ，于冰
(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘要:目的:建立紫萼藓科(Grimmiaceae)植物 ISSR － PCR 反应的最佳体系。方法:通过 L16(4
5)正交试验，研究了 dNTP 浓
度、镁离子浓度、模板 DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度这 5 个因素在 4 个水平上对 ISSR － PCR的影响。结果:建立了
紫萼藓科 ISSR － PCR 反应的最佳反应体系，其中 dNTPs 浓度为 0. 8mmol /L、Mg2 +浓度为 3. 0mmol /L、模板为 15ng、引物浓度为
1. 4 μmol /L、Taq酶量 2U，总体积为 25μl。反应程序为:扩增程序为:94℃预变性 5min;94℃变性 30s，48 ～ 52℃退火 1min，72℃延
伸 2min，共 40 个循环;72℃延伸 10min;4℃保存。采用引物 UBC812 等均能够得到有效扩增。结论:该优化体系的建立为下一步
对紫萼藓进行 ISSR分子标记奠定了基础。
关键词:紫萼藓科;正交设计;ISSR － PCR
中图分类号:Q781;Q949 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2012． 03． 69
Study on Optimization for ISSR － PCR Reaction System
of Grimmiaceae using Orthogonal Design
LIU Zhuo，SHA Wei* ，YU Bing
(College of Life Science and Agriculture Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)
Abstract:Objective:Develop the most suitable ISSR － PCR system for Grimmiaceae. Method:The effects of various factors on ISSR －
PCR reaction，such as concentration of dNTPs，Mg2 + and DNA template，primers and Taq DNA polymerase，were investigated to optimize
the ISSR － PCR reaction system. Result:The most suitable ISSR － PCR system for Grimmiaceae was established，namely 25μl reaction sys-
tem containing 3. 0mmo1 / L Mg2 +，0. 8 mmo1 /L dNTPs，10ng DNA template，1. 4μmo1 /L primer，and 2 U Taq DNA polymer-
ase. Amplification procedure by PCR was pre － denaturation at 94℃ for 5 min，40cycles of denaturation at 94℃ for 30s，annealing at 48 －
52℃ for 1 min and extension at 72℃ for2min，and a anal extension at 72℃ for 10min. Using the optimized reaction，Grimmiaceae materials
were easy amplified with primer UBC812. Conclusion:The optimized system laid the groundwork for ISSR molecular analysis of Grimmi-
aceae.
Key words:Grimmiaceae;orthogonal design;ISSR － PCR
收稿日期:2011 － 12 － 12;修回日期:2012 － 03 － 17
基金项目:国家自然科学基金项目(“紫萼藓科植物耐旱特征及分子进
化的研究”，No. 31070180)资助
作者简介:刘卓(1985 －) ，男，黑龙江省齐齐哈尔人，硕士生，从事植物
遗传学方面的研究，Email:liuzhuoqd@ 163. com。* 通讯作者:沙伟
(1963 －) ，女，黑龙江省齐齐哈尔人，教授，博士生导师，从事植物学、
植物遗传学方面的研究，发表论文 130 余篇、论著 4 部，Email:shw1129
@ 263. net。
0 引言
紫萼藓科(Grimmiaceae)植物性极耐旱，能生长在向阳的
裸岩上，久旱不丧失生活力。为典型的旱生植物［1］。在国内，
关于该科植物的研究，主要集中于经典分类、形态解剖学等方
面等方面的研究［2 － 5］，但是分子水平的研究还尚存不足。本
研究主要通过 ISSR － PCR的分子标记技术为紫萼藓科植物遗
传多样性的前期研究提供分子数据的支持。
简单序列重复间区(inter － simple sequence repeats，ISSR)
是由 Ewa Zietkiewicz［6］等于 1994 年创建的一种新型的分子标
记技术［7，8］，该技术检测的是两个 SSR(simple sequence re-
peats，SSR)之间的一段短 DNA 序列的多态性。ISSR 技术简
易、快捷，同时兼备 AFLP(扩增酶切片段多态性)、SSR(简单
序列重复)和 RAPD(DNA 随机扩增多态性)等分子标记方法
的优点。引物设计无需预知基因组序列，只要是目标区域的
长度在可扩增范围内，就能扩增出微卫星重复序列间的 DNA
片段［9］。由于扩增的各种因素以及不同的反应程序都会影响
ISSR的结果，因此对其各个因素和扩增程序进行优化，是非常
有必要的。本试验主要是通过正交设计 ISSR反应体系中 5 个
因素在 4 个水平上对扩增结果的影响，优化筛选出了紫萼藓
科植物 PCR的最佳体系，为进一步对紫萼藓科植物进行 ISSR
遗传多样性分析奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
本实验以 16 种紫萼藓科植物(见表 1)为研究对象。正交
设计以 13 号标本(Racomitrium japonicum)为实验材料，提取其
基因组 DNA并进行 ISSR － PCR扩增。本实验所需药品如:IS-
SR引物、TaqDNA聚合酶酶、Buffer以及 Mg2 +均购于上海生工
生物工程技术有限公司;dNTPs、Marker DL2000 购自北京鼎国
16
生 物 技 术 2012 年 22(3)
生物技术有限责任技术。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA的提取
参照柴华［10］改良的 CTAB方法，略有改动。提取了 16 个
紫萼藓科植物基因组的 DNA。提取 DNA 样品的质量和浓度
采用 NanoDrop 2000 超微量紫外光检测，并采用琼脂糖凝胶电
泳法检测基因组 DNA条带，用凝胶成像系统照相记录。
1. 2. 2 ISSR － PCR的正交设计
参照王助文［11］的 ISSR － PCR反应体系，经预实验初步确
定出本次正交实验的固定引物为 UBC808，并以 13 号标本
(R. japonicum)的 DNA作为模板。根据 L16(4
5)正交表进行了
正交实验，从而分析各个因素对 ISSR － PCR 反应的影响。正
交设计见表 2，共 16 组，为保证体系的稳定性，每组都做了重
复实验。在总体积为 25μl的体系中，除表中主要因素外，还加
有 10 × buffer(不含 Mg2 +)以及去离子水。反应在美国 PE －
9600 型 PCR仪上进行扩增。扩增程序为:94℃预变性 5min;
94℃变性 30s，52℃退火 1min，72℃延伸 2min，共 40 个循环;
72℃延伸 10min;4℃保存。
表 1 标本材料
Table 1 Specimen materials
序号(No. ) 种名(Species) 采集地(Locus) 标本凭证(Voucher) 采集日期(Date)
1 陈氏连轴藓(Schistidium chenii Lin) 新疆巴尔鲁格山 买买提明 14391 2009 － 07 － 24
2 粗疣连轴藓(S. strictum) 四川汶川县 贾渝 J06895 2002 － 08 － 25
3 长枝紫萼藓(Grimmia elongata Kaulf) 甘肃迭部县 赵遵田等 20060059 2006 － 07 － 25
4 阔叶紫萼藓(G. laevigata Brid. ) 四川汶川县 贾渝 J06984 2002 － 08 － 24
5 高山紫萼藓(G. montana Bruch. et Schimp. ) 四川汶川县 刘阳 676 2002 － 08 － 26
6 毛尖紫萼藓(G. pilifera P. Beauv. ) 四川贡嘎山 曹同等 90947 2009 － 06 － 30
7 后边紫萼藓(G. unicolor Hook. ) 新疆青河县大青河 买买提明 14198 2010 － 07 － 19
8 无齿紫萼藓(G. anodon Bruch et Schimp. ) 新疆昆仑山叶城县 买买提明 12266 2009 － 07 － 20
9 垫丛紫萼藓(G. pulunata (Hedw. )Sm. ) 新疆昆仑山孜塔格峰 买买提明 11537 2008 － 08 － 5
10 黄砂藓(Racomitrium anomodontoides Card. ) 福建省德化县戴云山 王幼芳 305 2010 － 07 － 4
11 硬叶砂藓(R. barbuloides Card. ) 四川贡嘎山 曹同等 90169 2009 － 06 － 26
12 短尖砂藓(R. carinatum Card. ) 福建省德化县戴云山 王幼芳 272 2010 － 07 － 3
13 东亚砂藓(R. japonicum) 重庆云阳县 于宁宁 02403 2008 － 07 － 29
14 偏叶砂藓(R. subsecundum) 四川贡嘎山 曹同等 90211 2009 － 06 － 26
15 簇生砂藓(R. aquaticum) 广西猫儿山山顶 ZQ，WYF 929 2007 － 07 － 15
16 异枝砂藓(R. heterostichum (Hedw. )Brid. ) 广西猫儿山山顶 ZQ，WYF 656 2007 － 07 － 15
表 2 ISSR － PCR的正交设计表
Table 2 Orthogonal array for ISSR － PCR amplified system
序号
No.
5 个主要因素 Five major factors
Mg2 +
(mmol /L)
dNTPs
(mmol /L)
引物
(μmol /L)
Taq酶
(U /25μl)
模板 DNA
(ng /25μl)
1 1. 8 0. 8 1. 0 0. 5 7. 5
2 1. 8 1. 0 1. 2 1. 0 15
3 1. 8 1. 2 1. 4 1. 5 30
4 1. 8 1. 4 1. 6 2. 0 60
5 2. 4 0. 8 1. 2 1. 5 60
6 2. 4 1. 0 1. 0 2. 0 30
7 2. 4 1. 2 1. 6 0. 5 15
8 2. 4 1. 4 1. 4 1. 0 7. 5
9 3. 0 0. 8 1. 4 2. 0 15
10 3. 0 1. 0 1. 6 1. 5 7. 5
11 3. 2 1. 2 1. 0 1. 0 60
12 3. 0 1. 4 1. 2 0. 5 30
13 3. 6 0. 8 1. 6 1. 0 30
14 3. 6 1. 0 1. 4 0. 5 60
15 3. 6 1. 2 1. 2 2. 0 7. 5
16 3. 6 1. 4 1. 0 1. 5 15
1. 2. 3 ISSR － PCR最优体系的验证
采用筛选出的 ISSR 引物和 16 种材料提取的 DNA，在正
交实验所得的最优体系下进行 PCR验证。PCR扩增程序中退
火温度采用筛选的各个引物的退火温度，其他程序不变。
1. 2. 4 ISSR － PCR产物的检测
ISSR － PCR反应产物经 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，在
100V电压下电泳 40min 左右。然后，在紫外凝胶成像系统
(UVP GDS － 8000)下观察并照相记录。
2 结果与分析
2. 1 基因组 DNA的提取结果
提取的 16 种材料的 DNA 电泳检测结果见图 1。浓度采
用 NanoDrop 2000 超微量紫外光检测，结果 OD260 /OD280的值均
在 1. 8 ～ 2. 0 之间。说明所提取的 DNA 可以用于 ISSR － PCR
反应。
2. 2 ISSR － PCR正交设计结果及分析
正交结果由图 2 可知，在正交试验设计中，体系 1、4、8、
14、15、16 无条带;体系 3、13 扩增出 1 条带;体系 6、7、10 扩增
出 4 条带;体系 11、12 扩增出 5 条带;体系 2、5 扩增出 7 条带，
但条带较模糊;体系 9 扩增出了 8 条带，且条带较清晰。重复
试验结果相同，这样紫萼藓科植物的 ISSR － PCR 最佳反应体
系基本确定为 9 号体系。其反应体系为:引物为 1. 4μmol /L、
dNTPs为 0. 8mmol /L、Mg2 +为 3. 0mmol /L、Taq酶量为 2U、模板
量约为 15ng，其余为 buffer和去离子水，共 25μl。
26
2012 年 22(3) 生 物 技 术
2. 3 ISSR － PCR最优体系的验证分析
将其他已筛选出的 ISSR 引物，在最优反应体系下进行
PCR验证，结果扩增出的多态性条带在凝胶电泳图中都很清
晰。例如随机采用引物 UBC812，对表 1 中的 16 种材料的
DNA进行扩增，退火温度控制在 50℃，扩增结果见图 3。在电
泳图中可以清晰看到 16 种材料均能有效的扩增出多态性条
带，说明所筛选出的体系适用于紫萼藓科植物的 ISSR扩增。
图 1 DNA凝胶电泳图
1 ～ 16 为材料编号。
Fig. 1 The gel Electrophoresis image of DNA
1 － 16:The number of 16 materials.
图 2 ISSR － PCR正交实验电泳图
1 ～ 16 为处理序号，见表 2;M为 DL2000。
Figure 2 The gel Electrophoresis image of ISSR － PCR orthogonal design
1 － 16，Treatment number，showed in the Table 2;M，DL2000 marker.
2. 4 模板 DNA对 ISSR － PCR的影响
DNA是遗传信息的载体，其质量的高低是 ISSR － PCR 反
应的关键。质量高的 DNA模板，其 ISSR － PCR扩增的多样性
好，条带的清晰度高。本实验的一些材料是年代较远采集的
标本材料，如 2、3、4、5 号材料是 2002 ～ 2006 年间采集的，其提
取的 DNA电泳条带较暗(见图 1) ，说明提取的 DNA 浓度较
低。但是在 ISSR － PCR 反应中同样扩增出了条带(见图 3) ，
说明其 DNA的完整性较好，仍然可以用于 ISSR － PCR 反应。
分析原因:标本材料存放年代较久远，DNA 难免发生部分降
解，会有一些损失，但经紫外检测发现存放年代较久远材料的
DNA虽然浓度较低，但其 OD260μm /OD280μm的值都在 1. 8 ～ 2. 0
之间，说明其中所含杂质较少，DNA 纯度较高，因此也可以扩
增出条带来。
2. 5 体系中其它因素对 ISSR － PCR的影响
为了建立 ISSR － PCR反应的最优体系，对影响其反应的
各种因素如 Mg2 +浓度、dNTPs 浓度、引物浓度、以及 Taq 酶量
都做了对比试验。结果表明，Mg2 +浓度是影响 ISSR － PCR 的
主要因素。DNA聚合酶只能识别 Mg2 +与 dNTP 以及 DNA 模
板结合形成复合体。dNTP的浓度与 Mg2 +的浓度应成比例同
时提高，否则造成自由 Mg2 +浓度偏低，影响聚合酶的活性［12］，
本实验 Mg2 +浓度在 2. 4mmol /L ～ 3. 0mmol /L 效果最好(见图
2)。dNTPs是 ISSR － PCR 的底物，其浓度过低会造成反应条
36
生 物 技 术 2012 年 22(3)
图 3 引物 UBC812 的 ISSR扩增电泳图
1 ～ 16 为 16 种材料编号;M为 DL2000。
Figure 3 The gel Electrophoresis image of ISSR amplified with primer UBC812
1 － 16，The number of 16 materials;M，DL2000 marker.
带数少，浓度过高又会螯合镁离子，从而使 Taq 酶的活性降
低，本实验 dNTPs 浓度为 0. 8mmol /L 时最为合适(见图 2)。
Taq酶的量合适时会促进整个 PCR 的反应，酶量过高或多低
不但不会促进反应的进行反而会降低酶在反应中的作用，本
实验 Taq酶的量达到 2U 时效果最好(见图 2)。本实验引物
浓度在 1. 0mmol /L ～ 1. 6mmol /L时均能扩增出条带，说明引物
浓度在此范围内对该反应的影响不大。根据正交实验确定引
物浓度为 1. 4mmol /L。
2. 6 退火温度的确定
采用正交设计筛选出的最佳反应体系，对各个引物进行
退火温度的筛选，温度设置从 48℃ ～ 56℃。结果发现:当退火
温度较高时，扩增出的 DNA条带数较少，但条带清晰度高;当
退火温度较低时扩增出的 DNA 条带数较多，但许多都较模
糊，条带之间较难区分。分析其可能在较低退火温度时，引物
与模板结合的要求也较低，因此扩增的条带数较多;随着退火
温度的提高，引物与模板结合的要求也随之增高，因此扩增的
条带数也较少。但由于引物与模板在高水平下结合，所以扩
增产物的条带也比较清晰、明亮。在考虑尽量扩增出较多条
带数且保证条带清晰度的情况下，确定了各个引物的最适退
后温度(见表 3) ，如选择 UBC812 的最适退后温度为 50℃。
表 3 ISSR － PCR最适退火温度(Tm)
Tab. 3 The suitable annealing temperature (Tm)of ISSR － PCR
引物名称
Primer Name
引物序列
Primer Sequence
理论退火温度
Academic Tm(℃)
最适退火温度
Suitable Tm(℃)
UBC807 (AG)8 C 52. 18 50
UBC808 (AG)8 T 52. 18 52
UBC810 (GA)8 T 52. 18 52
UBC812 (GA)8A 52. 18 50
UBC814 (CT)8A 52. 18 51
UBC824 (TC)8G 54. 59 48
UBC834 (AG)8YT 53. 88 50
UBC848 (CA)8RG 56. 16 48
注:R代表 A和 T，Y代表 G 和 C。
Note:R stands for A and T;Y stands for G and C.
3 讨论
ISSR － PCR是一个受综合因素影响的反应，每一种因素
的变化都有可能导致结果不同，因此确定一个理想的最优体
系对 ISSR － PCR 反应是很重要的。DNA 模板是 ISSR － PCR
反应中的一个重要因素，本实验发现质量较高且杂质较少的
DNA模板，即使浓度较低也可扩增出条带。这对于年代较为
久远的标本材料也可用于分子实验提供了有力的证明。其他
因素如 Mg2 +浓度、dNTPs浓度及 Taq 酶量对于该反应也很重
要，Mg2 +浓度过高易螯合 dNTPs，使 dNTPs 消耗殆尽，无延伸
反应;dNTPs浓度过高又会抑制 Mg2 +，从而又会抑制 Taq酶的
活性［13］。因此三者的浓度比例只有在一定范围时，才能使反
应达到最佳的效果。
ISSR标记以其高多态性，已在遗传多样性、基因标记、基
因图谱和进化生物学以及遗传学和植物育种等领域发挥着重
要的作用［14］。ISSR标记技术早已应用于被子植物的研究中，
然而，近年来苔藓植物的研究中也有所涉及。汪琛颖［15，16］等
建立了适用于狭边大叶藓(Rhodobryum ontariense)以及真藓科
(Bryacae)植物的遗传多样性研究的 ISSR － PCR 反应标准化
程。关于紫萼藓科植物遗传多样性的研究，在国内还未见报
道。本实验通过正交设计，最终建立了紫萼藓科植物 ISSR －
PCR 反应的最优体系:3. 0mmol /L 的 Mg2 +、0. 8mmol /L 的
dNTPs、1. 4μmol /L的引物、2U 的 Taq 酶量以及 15ng 的 DNA
模板，其它成份为双蒸水，反应总体系共 25μl。该体系的建立
为进一步对紫萼藓科植物进行 ISSR 遗传多样性分析奠定了
基础。
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发酵法生产紫杉醇的检测分析
金涛1，2，3，周东坡1，孙宇石1，刘利群4，邹积宏1，平文祥1，阎秀峰3*
(1. 黑龙江大学生命科学学院、微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080;
2. 农业微生物技术教育部工程研究中心博士后科研工作站，黑龙江 哈尔滨 150500;
3. 东北林业大学博士后科研流动站，黑龙江 哈尔滨 150086;
4. 黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150001)
摘要:目的:采用高效液相色谱法对发酵液中的紫杉醇进行测定。方法:将紫杉醇产生菌发酵产物经乙酸乙酯萃取得测定样
品，高效液相色谱分析方法为苯基柱(250mm × 4. 6mm，5μm) ，流动相乙腈 － 甲醇 － 水(36 ∶ 4 ∶ 60) ，流速 1mL /min，检测波长
227nm，进样体积 20μL，柱温室温。结果:紫杉醇与干扰物可达到基线分离，在 2. 2 ～ 110μg /mL 范围内，紫杉醇的峰面积与浓度
线性关系良好，相关系数 0. 9996，平均回收率为 99. 55%，RSD为 0. 60%。结论:与使用 C18柱色谱条件相比，该分析方法灵敏度
高，不需要复杂的样品前处理过程，仪器配置不复杂、操作方便、准确性高，可有效地检测发酵液中紫杉醇的含量。
关键词:检测;发酵;紫杉醇
中图分类号:O652. 63;Q503 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2012． 03． 70
Detection of Taxol Produced by Fermentation
JIN Tao1，2，3，ZHOU Dong － po1，SUN Yu － shi1，LIU Li – qun4，
ZOU Ji － hong1，PING Wen － xiang1，YAN Xiu － feng3*
(1. Laboratory of Microbiology，College of Life Science，Heilongjiang University，Harbin 150080;
2. Postdoctoral Research Working Station of Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology，Ministry of Education，Harbin 150500;
3. Postdoctoral Research Station，Northeast Forestry University，Harbin 150086;
4. Heilongjiang Provincial Institute For Food＆Drug Control，Harbin 150001，China)
Abstract:Objective:The content of taxol in fermentation broth was detected by HPLC. Method:The analytic samples were obtained from
ethyl acetate extract of fermentation product of taxol producing strain. The HPLC separation was performed with benzene analytical column
(250mm ×4. 6mm，5μm)in the flow rate of 1mL /min，the mobile phase was acetonitrile － methol － water(36∶ 4∶ 60) ，the injection volume
was 20mL，the column temperature was room temperature. Result:Taxol and interfering substances can reach baseline separation. The cali-
bration curve of peak area and taxol concentration was linear in the concentration range of 2. 2 － 110μg /mL with good correlation coeffi-
cient (r = 0. 999 6). The average recovery rate was 99. 55%，RSD 0. 60%. Conclusion:The convenient analytical method on benzene col-
umn with high sensitivity and high accuracy did not require complicated sample pretreatment and complex instrument configuration，could
be used to determine the content of taxol in fermentation broth effectively，compared to chromatographic condition on C18 column.
Key words:detection;fermentation;taxol
0 引言
紫杉醇是来源于红豆杉植物中的一种二萜类药物，对卵
巢癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤具有突出的疗效［1］，市场需求量
日益增大。国内外学者积极研究开发紫杉醇的新药源，目前
的方法主要有红豆杉人工栽培、寻找红豆杉的替代植物、化学
全合成和半合成、组织与细胞培养、微生物发酵等途径，其中
微生物发酵法具有较大的潜在优势，已经成为当前紫杉醇药
源开发中的热点，具有重大的社会意义和经济价值。有些学
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