全 文 ：RP-HPLC法测定千金藤属植物中 7种生物活性生物碱
黄建明 郭济贤＊ 段更利＊＊
(上海医科大学药学院生药学教研室;＊＊药物分析教研室 ,上海 200032)
摘要 用 RP-HPLC 法测定了中国千金藤属(Stephania)25种植物 68 个样品中 7 种生物活性生物碱
千金藤定碱 、青风藤碱 、异紫堇定碱 、左旋四氢巴马汀 、克斑宁 、防己诺林碱和粉防己碱。固定相为
ODS ,流动相以甲醇—水—三乙胺系统作梯度洗脱 , 检测波长 282 nm。本法简便 、灵敏 、分离度好 ,并提供
了新的考察提取率的方法。根据含量测定的结果 ,尤其是一些新种的含量结果 , 为生产和临床扩大药源
提供有用的信息。
关键词 千金藤属;生物碱;高效液相色谱法
防己 科 (Menispermaceae)千 金 藤 属
(Stephania)植物全世界约 60余种 ,我国有 39
种 ,分布于长江流域及其以南各省区 ,以云南和
广西种类最多[ 1] 。该属中可供药用的植物种
类较多 ,主要有解热 、镇痛 、抗菌消炎 、止血等功
效。本属植物富含生物碱 ,有生物活性的达 20
余种 ,其中一些已应用于临床。朱兆仪等曾用
TLC及薄层扫描法测定了 18种植物中若干生
物碱的存在与含量[ 2] ;阮德 等通过 HPLC 测
定了 9 种植物中 8种异喹啉类生物碱的含量 。
该法采用 CN 柱 ,每个样品需用两种流动相分
别测定易洗脱与难洗脱的生物碱 ,而且对照品
的峰形与分离度欠佳[ 3] 。有关本属植物资源
利用的研究尚不充分 ,尤其是对于近年来发现
的新种。
本文建立了良好的 RP-HPLC 法 ,并测定
了千金藤属 25种植物 68个样品中的 7种活性
生物碱 千金藤定碱(stepholidine)、青风藤
碱(sinoacutine)、异紫堇定碱(isocorydine)、左旋
四氢巴马汀(l-tet rahydropalmatine)、克斑宁
(crebanine)、防己诺林碱(fangchinoline)和粉防
己碱(tet randrine)。
本文于 1997年 10月 15日收到。
＊联系人
实 验 部 分
1 仪器与材料
高效液相色谱仪 洗脱液泵Gilson 302/5 s ,
注射阀 Rheodyne 7125/20 μl , 检测器:Gilson
Holochrome , 记录仪:Gilson N2 , 色谱处理机:
Gilson 620 ,系统控制器:Apple II 。
试剂 甲醇(色谱纯 ,天津四友生物医学技
术开发公司),三蒸水(实验室自制),三乙胺(分
析纯 ,上海试剂三厂)。
对照品 青风藤碱 、克斑宁和粉防己碱由
中国科学院上海药物研究所劳爱娜教授提供;
千金藤定碱由该所陈 教授提供;异紫堇定碱 、
左旋四氢巴马汀和防己诺林碱由上海市金山县
药品检验所杨鹤鸣主任药师提供 。所有对照品
均经光谱鉴定 ,HPLC法检测无杂质干扰。
植物样品 均由上海市金山县药品检验所
杨鹤鸣主任药师鉴定并提供 ,未注明植物部位
的样品均为植物的地下部分 。
2 分析方法的建立与评价
2.1 色谱条件 色谱柱:Lichrosorb RP-C18(5
μm)150 mm×4.6 mm 。流动相以A和 B作梯
度洗脱 , A 为甲醇 —水 —10%三乙胺(甲醇液)
(50∶50∶0.5),B为甲醇—10%三乙胺(甲醇液)
·528· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1998 , 33(7)∶528～ 533
DOI :10.16438/j.0513-4870.1998.07.009
(100∶0.5),起始流动相为 5%B ,线性递增至 8
min为 15%B ,至 28 min为 75%B ,28 min后维
持 75%B 4 min ,再返回至起始流动相 。流速:
1.0 ml·min-1 。检测波长 282 nm 。灵敏度
0.02 AUFS 。室温 18 ～ 25℃。
2.2 分离情况 7 种生物碱对照品的色谱图
见图 1。各生物碱分离良好 ,分离度均>1.5 ,
峰形对称 ,拖尾因子 T(0.95
析要求。
2.3 标准曲线及线性范围 精密称取 7 种对
照品各约 2 ～ 5 mg ,加甲醇溶解并定容至 5 ml ,
分别吸取各对照品溶液 0.3 ～ 2 ml置 10.0 ml
量瓶中 ,配成含 7种生物碱的储备液。精密吸
取储备液 0.05 , 0.1 , 0.25 , 0.5 , 0.75 , 1.0 ml ,
分别加甲醇至 1.0 ml ,进样 10 μl ,作 HPLC 分
析。以峰高对浓度进行回归处理。表 1的数据
表明 ,在一定的浓度范围内 , 7种生物碱对照品
的峰高与浓度均呈良好的线性关系 。
Fig 1 HPLC chromatogram of seven alkaloids.
1.Stepholidine;2.Sinoacutine;3.Isocory-
dine;4.l-Tetrahydropalmatine;5.Crebanine;
6.Fanchinoline;7.Tetrandrine.
Tab 1 Data for cal ibration graphs
Alkaloid Regression equation γ Lineari ty range (μg·ml-1)
S tepholidine H=0.05349C-0.04156 0.9994 7.71～ 154.2
Sinoacutine H=0.05076C-0.1474 0.9993 7.365～ 147.3
Isocorydine H=0.07696C+0.04095 0.9992 4.507～ 90.14
l-Tetrahydropalmat ine H=0.05291C+0.08591 0.9996 7.405～ 148.1
C rebanine H=0.2608C-0.004010 0.9994 1.577～ 31.54
Fanchinoline H=0.02767C-0.04779 0.9996 12.007～ 240.14
Tet randrine H=0.03705C+0.03610 0.9996 10.98～ 219.6
2.4 精密度 取储备液 0.1 , 1.0 ml ,分别加
甲醇至 1.0 m l ,进行 HPLC 分析。每个浓度天
内测定3份 ,天间测定 3 d。生物碱天内及天间
测定的 RSD为 0.58%～ 3.95%。
2.5 累积溶出实验 样品溶液的制备:精密称
取白线薯 Stephania brachyandra Diels 、齿叶地
不容 S .denti fol ia Lo et M.Yang 和粉防己 S .
tetrandra S.Moore 3 种植物样品粉末约 200
mg 各 2份 ,精密加入甲醇 5.0 ml ,超声 30 min
(250 mA)。静置 1.5 h ,吸出 3.0 ml ,作为样品
第1测定点溶液;立即加入甲醇 3.0 ml ,再超声
10 min ,静置 50 min ,吸出 3.0 ml ,作为样品第
2测定点溶液;同法每隔 1 h 取样 ,共取 5 点 。
共浸泡 23 h后 ,超声 30 min ,静置 30 min ,取第
6点。各样品溶液经微孔滤膜(0.45 μm F 膜)
过滤后进行 HPLC 分析 。若生物碱浓度超过
线性范围则稀释适当的倍数 。
各样品的动态累积溶出曲线
Cn =Cn+ΔV/V总 ∑n-1
n=1Cn
式中 Cn :各测定点累积浓度;Cn:各测定点浓
度;V总:溶液总体积;ΔV:吸出或加入的体积 。
mn%=Cn ×V总/m
式中 mn%:累积含量%;m:生药样品质量。
根据 3种植物样品中生物碱的存在与否 ,
·529·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1998 , 33(7)∶528～ 533
考察了以下生物碱在各样品粉末中的溶出情
况:白线薯 Stephania brachyandra Diels 中的
青风藤碱 、异紫堇定碱和左旋四氢巴马汀;齿叶
地不容 S .denti fol ia Lo et M .Yang 中的千金
藤定碱 、左旋四氢巴马汀 、克斑宁和防己诺林
碱;粉防己 S .tetrandra S.Moo re 中的防己诺
林碱和粉防己碱 。结果 ,第 6测定点时 ,各生物
碱的累积溶出量已趋于稳态(图 2),其值可作
为溶出率考察中 100%的参照值 。
Fig 2 Dissolution profiles for three alkaloids in
S .brachyandra Diels.◆ — ◆ Sinoacutine;■ — ■
Isoco rydine;★ — ★ l-Tetrahydropalmatine.
2.6 提取率 精密称取 2.5中的 3种样品粉
末约 120 mg 各 2份 ,精密加入甲醇 5.0 ml ,超
声30 min(280 mA),浸泡 23 h ,再超声 10 min ,
放置 50 min ,取出上清液 ,经微孔滤膜(0.45
μm F 膜)过滤后进行 HPLC 分析 。以 2.5中第
6点的累积含量为 100%计算提取率 ,各生物碱
的提取率均大于 95%。
2.7 加样回收率 精密称取粉防己 S .
tetrandra S.Moo re 粉末约 120 mg 3 份 ,精密
加入对照品储备液 0.8 ml ,再加甲醇 4.2 ml ,
同2.6制备分析试液 ,进行 HPLC 分析。结果
见表 2。加样回收率在 96.9%～ 104.7%之间 。
Tab 2 Recovery of alkaloids(n=3)
Alkaloid Recovery (%) RSD(%)
Stepholidine 101.4 2.29
Sinoacutine 99.27 2.53
Isocorydine 104.7 1.05
l-Tet rahydropalmatine 101.6 0.90
Crebanine 97.23 1.11
Fanchinoline 102.9 1.10
Tetrandrine 96.85 0.85
结 果
按照 2.6中的提取步骤制备样品各 2份进
行 HPLC 分析 ,测定了千金藤属 25种植物 68
个样品中 7种生物碱的含量 ,结果如表 3。部
分样品的谱图见图 3。
Fig 3 HPLC chromatogram of S tephania
kuinanensis Lo et M .Yang (A) and S .
lincangensis Lo et M.Yang (B).3 , 4 , 5 , 6 ,
7.See Fig 1.
含量测定结果显示 , 7种生物碱在千金藤
属植物中均有一定的分布 ,其中左旋四氢巴马
汀分布最广 。根据含量结果 ,寻找出含此 7种
生物碱较高的植物种类(表 4)。表 4列出 18
种和 1变种植物中有 14种和 1变种是近 20年
来发现的新种或新变种 ,其中 6种和 1 变种在
文献[ 2 ,3]中未作过含量分析 。
讨 论
与文献[ 3]比较 ,本法样品处理简便 、易行 ,
选择常用的 ODS 柱 ,一次可同时测定极性差别
较大的 7种生物碱 ,峰形与分离度良好。
本实验以超声为提取手段 ,并设计了一种
新的考察提取率的方法 。此法的优点有:①克
·530· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1998 , 33(7)∶528～ 533
Tab 3 Alkaloid contents in samples of Stephania plants from different habitats
Species Habitat Content(%)
1 2 3 4 5 6 7
S.delavayi Diels(stem) Yangbi , Yunnan - 0.086 - - - - -
S.longa Lour.(stem and leaf) Nanning , Guangxi 0.073 0.040 0.37 0.25 0.013 0.12 -
S.tet randra S.Moore Zhejiang ＊ - - - - - 0.37 0.49
S.cepharan tha Hayata Duan , Guangxi - 0.035 0.025 - 0.007 0.30 0.12
S.de n ti fol ia Lo et M.Yang Genma , Yunnan 0.76 0.43 - 0.077 1.18 4.24 0.40
Cangyuan , Yunnan 0.70 0.59 - 0.028 1.41 1.26 0.045
Genma , Yunnan＊ 0.42 0.98 - 0.30 2.41 4.54 0.17
S.ep igaea Lo Honghe , Yunnan 0.51 - - - 0.004 Trace 0.65
Yongsheng , Yunnan 0.020 - - - - Trace 0.56
Zhongdian , Yunnan 0.016 - - 0.093 - - 0.29
Yunnan 0.038 - 0.011 0.017 - Trace 0.81
S.intermedia Lo Baoshan , Yunnan 1.20 - - 0.77 - - -
Baoshan , Yunnan 0.52 - - 1.67 - - -
S.sinica Diels Emeishan , Sichuang - - - - - - 0.069
S.brachyandra Diels Honghe , Yunnan＊ - 0.27 2.65 0.31 - - -
Honghe , Yunnan - 0.089 3.53 0.062 - - -
S.dicentrini fera Lo et M .Yang Honghe , Yunnan - 0.15 0.039 0.11 - 0.63 -
S.dielsiana Y.C.Wu Nama , Guangxi - 0.046 - 0.35 0.12 1.61 0.099
Guangdong - 0.75 - 0.028 0.42 2.66 0.11
Guizhou - 0.10 - 0.023 0.068 0.35 0.045
S.dol ichopoda Diels Napo , Guangxi - - - 0.41 0.16 0.99 0.040
Napo , Guangxi - - - 0.26 0.19 1.52 0.061
Napo , Guangxi - - - T race 0.006 0.064 0.045
Xishuangbanna , Yunnan - - - 1.35 0.006 - -
S.excen tr ica Lo Dongling , Guangxi - - - - 0.010 0.068 -
Damiaoshan , Guangxi - - - - - - -
S.hainanensis Lo et Y.T soong Yaxian , Guangdong 0.55 0.061 - 1.73 0.045 0.28 0.039
S.kuinanensis Lo et M.Yang Longzhou , Guangxi Trace Trace - 0.72 0.042 0.65 0.026
Longzhou , Guangxi 0.033 0.035 - 0.58 0.076 1.98 0.17
Longzhou , Guangxi 0.078 0.037 - 0.69 0.17 0.50 0.088
Longzhou , Guangxi 0.065 0.043 - 0.56 0.11 0.33 0.30
S.kwangsiensis Lo Tiandong , Guangxi 0.050 0.24 - 1.38 - 2.94 Trace
Jingxi , Guangxi 0.064 0.13 0.036 0.21 - 0.86 Trace
Napo , Guangxi 0.043 0.10 - 1.72 - 2.80 0.082
Napo , Guangxi Trace Trace - 0.91 - 1.77 0.10
Napo , Guangxi - 0.031 - 1.59 - 2.72 Trace
S.linca ngensis Lo et M.Yang Lincang , Yunnan - - 0.89 2.59 0.004 1.34 -
Lincang , Yunnan - 0.047 0.56 1.65 0.007 2.03 -
S.longipes Lo Genma , Yunnan 1.58 0.45 - 0.090 1.95 5.23 0.29
Genma , Yunnan 0.39 0.77 - 0.062 0.58 2.30 0.16
Chuxiong , Yunnan 0.077 0.093 - 0.59 0.16 0.52 0.029
S.macrantha Lo et M.Yang Yangbi , Yunnan 1.17 0.92 T race 3.33 - - -
Yangbi , Yunnan 0.13 0.26 2.89 1.85 - 0.21 -
Yangbi , Yunnan 0.14 0.15 1.10 1.45 - 0.18 -
S.mashanica Lo et B.N.Chang Duan , Guangxi 0.090 0.79 0.028 0.059 - 1.21 0.039
Mashan , Guangxi - 1.49 0.017 0.78 - 4.29 Trace
Mashan , Guangxi - 0.66 - 0.12 - 2.43 0.046
Yishan , Guangxi Trace 1.07 0.011 0.086 - 1.22 0.057
·531·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1998 , 33(7)∶528～ 533
Continued
Species Habitat Content(%)
1 2 3 4 5 6 7
Mashan , Guangxi 0.068 0.98 - 0.028 - 2.78 0.055
Duan , Guangxi 0.059 0.41 - 0.11 - 2.13 0.053
Mashan , Guangxi 0.098 0.80 - 0.29 - 3.28 0.071
S.micran tha Lo et M.Yang Longzhou , Guangxi 0.038 0.18 - 0.99 - - -
Longzhou , Guangxi - 0.59 - 1.26 - - -
S.of f icinarum Lo et M.Yang Genma , Yunnan - 0.21 2.77 0.81 - 0.11 -
Genma , Yunnan - 0.073 3.25 1.25 - 0.13 -
Genma , Yunnan - 0.17 2.35 1.33 - 0.14 -
Genma , Yunnan - 0.10 1.57 0.62 - 0.05 -
S.succi fera Lo et Y.Tsoong Yaxian , Guangdong 0.27 0.055 - 0.23 Trace 1.62 -
S.viridi f lavens Lo et M .Yang Duan , Guangxi - - - 2.23 0.004 - -
Duan , Guangxi - 0.052 - 3.41 - - -
Duan , Guangxi - Trace - 0.96 0.005 - -
Duan , Guangxi - - - 2.66 0.006 - -
Duan , Guangxi - 0.064 - 4.84 - - -
Bama , Guangxi - - - 2.46 0.004 - -
Duan , Guangxi - 0.078 - 2.88 0.007 - -
(stem and leaf) Bama , Guangxi 0.20 0.050 0.050 2.52 - 2.77 -
S.yu nnanensis Lo Gejiu , Yunnan 0.019 0.28 0.011 0.023 0.043 1.05 0.065
S.yu nnanensis var t richocalyx nanjian , Yunnan 0.091 1.54 - 0.041 2.06 0.49 0.11
Lo et M.Yang
1.Stepholidine;2.Sinoacutine;3.Isocorydine;4.l-Tetrahydropalma tine;5.Crebanine;6.Fanchinoline;
7.Te trandrine.＊The samples used in 2.5 , 2.6 and 2.7.T race:content of the alkaloid below detection limit.
Tab 4 Stephania species with high content of seven alkaloids
Species
Alkaloid
1 2 3 4 5 6 7
S.tetran dra S.Moore +
S.epigaea Lo +
S.den ti fol ia Lo et M.Yang ＊ + + + + +
S.intermedia Lo ＊■ + +
S.brachyandra Diels +
S.dielsiana Y.C.Wu + + + +
S.hainanensis Lo et Y.Tsoong ＊■ + +
S.kuina nensis Lo et M.Yang ＊ + + + +
S.kwangsiensis Lo ＊ + +
S.l incangensis Lo et M.Yang＊■ + + +
S.longipes Lo ＊■ + + + + +
S.macran tha Lo et M.Yang ＊■ + + + +
S.mashanica Lo et B.N.Chang＊ + + +
S.m icrantha Lo et M .Yang ＊ +
S.of f icinarum Lo et M.Yang ＊■ + + +
S.succi fera Lo et Y.Tsoong ＊ + + +
S.viridi f lavens Lo et M.Yang ＊ +
S.yunnanensis Lo ＊ + + +
S.yunnanensis var tr ichocalyx Lo et M.Yang ＊■ + + + +
1.Stepholidine;2.Sinoacutine;3.Isoco rydine;4.l-Tetr ahydropalmatine;5.Crebanine;6.
Fanchinoline;7.Tetrandrine.＊:New species found in recent 20 years;■:Species w ithout
content data in references
[ 2 ,3] ;+:Alkaloids w ith high content.
·532· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1998 , 33(7)∶528～ 533
服了单纯延长超声或浸出时间至含量不再增加
就认为提取充分的弊病。 ②各次测定液中的成
分均能在线性范围内被检测出 ,避免了因检测
限不够低 ,第 1次浸出液完全取出后 ,第 2次浸
出液的成分难以检测出 ,就推断第 2次提取基
本完全的缺陷。 ③动态累积溶出曲线给出了在
一定条件下 ,植物中的成分趋于完全溶出的量 ,
为提取率考察提供了参照值 ,克服了从几种方
法中筛选得率最高者而带有的盲目性。
千金藤属中不同种植物所含生物碱成分的
种类和含量有显著的差异。同种植物不同产
地 、不同采集号或同种植物同产地 、不同采集号
的样品 ,其生物碱的存在比较稳定 ,但生物碱的
含量有一定的差异 ,这与采收地点和时间等多
种因素有关 。
致谢 劳爱娜 、陈 教授提供对照品;杨鹤鸣主任
药师提供并鉴定样品。
参 考 文 献
1 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.
第三十卷.第一分册.北京:科学出版社 , 1996∶40
2 朱兆仪 ,冯毓秀.中国防己科千金藤属植物资源利
用研究.药学学报 , 1983 , 18∶460
3 阮德 , 张雪梅 , 赵春景 , 等.千金藤属植物生物碱
的高效液相色谱定量分析.云南植物研究 , 1991 , 13
∶225
DETERMINATION OF 7 BIO-ACTIVE ALKALOIDS
IN STEPHANIA PLANTS BY RP-HPLC
Huang Jianming(Huang JM), Guo Jixian(Guo JX)and Duan Gengli(Duan GL)
(Department of Pharmacognosy , School of Pharmacy , Shanghai Medical
Universi ty , Shanghai 200032)
ABSTRACT Seven bio-active alkaloids (stepholidine , sinoacutine , isocorydine , l-
tetrahydropalmatine , crebanine , fanchinoline and tet randrine)in S tephania plants were determined
by RP-HPLC , using UV detection (282 nm)and g radient elution.The reversed phase sy stem
consisted of ODS column and methanol — water — triethylamine as mobile phase.The f low rate was
1.0 ml·min-1 .Good linearity between peak heights and concentrations of the alkaloids w as obtained
in the concentration range.The HPLC method proved accurate , precise and sensitive.The results
showed that there were some dif ferences in the occurrence and content of the alkaloids between various
species and betw een the same species f rom dif ferent habitats and collecting t ime.Based on the results ,
some species w ith high content of the 7 bio-active alkaloids were selected.The study provided some
useful info rmation for the utilization of medicinal plant resources in the genus S tephania.
KEYWORDS S tephania;Alkaloid;HPLC
·533·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1998 , 33(7)∶528～ 533