全 文 ：几种香茶菜属二萜类化合物的抗氧化作用＊
王　筠　戈士文　王　毅　叶启霞　张覃沐
(河南省医学科学研究所药理室 , 郑州　450052)
2003 02 21收稿 , 2003 04 11修回
＊国家自然科学基金资助课题 ,No 39700178
作者简介:王 　筠 , 女 , 33 岁 , 硕士, 助理研究员。 Fax:0371-
6912677 , E-mail:jw jwang@hotmail.com;
张覃沐 ,男 , 70岁 ,教授
中国图书分类号　R 282.71;R 284.1;R 329.24;R 340.5;
R 914.4;R 979.9
文献标识码　A　文章编号　1001-1978(2003)09-1009-04
摘要　目的 　了解香茶菜属二萜类化合物冬凌草乙素
(Pon)、香茶菜醛(Ame)、毛叶香茶菜醇(Iso)是否具有抗氧化
作用。方法　用分光光度法测定 Fenton 反应体系中细胞色
素 C(Ⅱ)的含量 , 了解清除·OH 的能力;用紫外分光光度法
测定 N -2 的含量 , 了解清除 O-·2 的能力 , 用 DTNB 法测定
GSH 的含量。结果　Orid 、Pon、Ame、Iso , 50 、100、200 μmol·
L-1可清除 H2O 2-Fe2+反应体系中产生的·OH , 且呈剂量依
赖关系。Orid 、Pon 、Ame、Iso , 400 、800 μmol·L-1可清除黄嘌
呤-黄嘌呤氧化酶系统产生的 NO-2 。 Orid、Pon、Ame、Iso ,
1 、2 μmol·L-1可明显的减少 LPS 刺激巨噬细胞产生的
NO-2 。Orid 、Pon 、Ame、I so , 2 、4 μmol·L-1可明显抑制 CCl4
造成的 GSH 含量降低 ,具有剂量依赖性。结论　Orid、Pon 、
Ame、Iso 能有效地清除羟自由基和一氧化氮 , 抑制脂质过氧
化而产生抗氧化作用。
关键词　二萜类化合物;谷胱甘肽;抗氧化作用;羟自由基;
超氧阴离子自由基;一氧化氮
　　二萜类化合物是唇形科香茶菜属植物中提取的
有效成分 ,香茶菜属植物中的资源在我国极为丰富 ,
从中已提取百余种二萜成分 ,但其中仅有极少数进
行过药理学研究 ,我们对该属植物冬凌草中有效成
分冬凌草甲素的抗肿瘤作用及其作用机制进行了深
入研究 ,发现冬凌草甲素不仅具有抗肿瘤 、抗致突变
及抗致畸作用 ,且进一步的研究证明它可清除氧自
由基(O-·2)和羟自由基(·OH),提示冬凌草甲素具有
抗氧化作用[ 1～ 4] 。冬凌草乙素为从冬凌草中提取
的二萜成分 ,香茶菜醛 、毛叶香茶菜醇则是从同属植
物中提取的二萜成分 ,化学结构与冬凌草甲素相似 ,
它们是否与冬凌草甲素一样具有抗氧化作用 ,特进
行此研究。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂　冬凌草甲素(Oridonin , Orid)郑
州化学制药厂生产 ,批号 841123;冬凌草乙素(Poni-
cidin , Pon),香茶菜醛(Amethystonal , Ame),毛叶
香茶菜醇(Isodonoiol , Iso)由中国科学院昆明植物
所孙汉董教授 、河南医科大学化学教研室赵清治教
授惠赠 ,药物的赋型剂均为丙二醇 ,用前以 Tris-HCl
缓冲液(pH7.4)稀释至所需浓度。细胞色素 C
(Cy tc),脂多糖(LPS), 4-羟基香豆素购于 Sigma公
司;其余均为国产 AR试剂。
1.2　动物　SD大鼠♂,体重 200 ～ 250 g ,昆明种小
鼠♂,体重 22 ～ 25 g ,由河南省实验动物中心提供 。
1.3　方法
1.3.1　·OH 的生成及测定[ 5] 　Orid 、Pon 、Ame 和
Iso ,50 、100 和 200 μmol·L-1与 1% H2O2 、FeSO4
500 μmol·L-1 、cy tc 500 μmol·L-1各 1 m l混匀 ,
25℃孵育 90 min ,用紫外分光光度计测定 550 nm
下透光率 T 或吸收率 A ,按A=ε·L·C(朗伯-比耳
定律)计算·OH生成。
1.3.2　O·2 的生成及测定[ 6] 　总体积为 4 ml的反
应体系中含黄嘌呤 375 μmol·L-1 ,羟胺 500 μmol·
L -1 ,NaH2PO4·12H 2O/NaH2PO4·2H2O 100 mmol·
L -1并分别加入 Orid 、Pon 、Ame、Iso , 200 、400 、800
μmol·L-1在 37℃水浴中预热 5 min ,再加入黄嘌呤
氧化酶(0.1 IU)触发反应 ,37℃孵育30 min ,冰浴终
止反应 。然后取上清 1 ml加入对氨基苯磺酸 ,α-萘
胺和磷酸二氢钠缓冲液各 1 ml ,混匀室温下静置 20
min ,在 721分光光度计 530 nm 处测定吸光度。
1.3.3　药物对 NO 生成的影响[ 7]
1.3.3.1　巨噬细胞的获取　取♂小鼠 5只 ,腹腔注
射 5%熟淀粉 4 ml。3 d后断头处死 ,腹腔穿刺抽取
腹腔液 ,用 Tris-NH4Cl缓冲液纯化分离巨噬细胞 ,
调整细胞数为 1×109·L-1 ,置 37℃ 5% CO2 培养
箱 。
1.3.3.2　NO 含量测定[ 8] 　上述细胞培养 4h 后 ,
更换培养液 , 再分别加入不同浓度的 Orid 、Pon 、
·1009·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin 　2003 Sep;19(9):1009～ 12
Ame、Iso 和 LPS(LPS 终浓度为 3 mg·L-1), 24 h后
取上清按文献方法测定 NO-2 ,丙二醇作溶媒对照 。
1.3.4　药物对 GSH 含量的影响
1.3.4.1　肝细胞的分离和培养　按文献[ 9]所载的
方法进行 。
1.3.4.2　GSH 含量测定[ 10] 　肝细胞培养 24 h 后
加不同浓度的药物 ,药物终浓度为 1 μmol·L-1 ,再
加入 CCl4 使终浓度至 50μmol·L -1 ,培养 48 h后取
上清按文献方法测定 GSH 的含量。
1.4　统计学处理　各组数据采用 x ±s ,组间比较
采用 t 检验。
2　结果
2.1 　药物对 H2O2-Fe2+体系产生·OH 的影响 　
H2O2经 Fe2+催化生成·OH , ·OH 将还原型细胞色
素C(Cy tc Ⅱ)氧化成氧化型细胞色素 C(Cytc Ⅱ),
抗氧化剂与·OH 反应 ,阻断·OH 与 Cytc(Ⅱ)反应 ,
使Cytc(Ⅱ)消耗降低 。药物清除·OH 的能力以还
原型细胞色素 C 的量表示 ,Cy tc(Ⅱ)的 C 值越大 ,
表示药物清除·OH 的能力越强 。结果表明与·OH
生成组比较 ,Orid 、Pon 、Ame 、Iso 都能有效地清除该
体系产生的·OH 。按清除率计算 ,各药清除·OH 的
能力依次为:Orid>Ame>Pon>Iso(Tab 1)。
Tab 1　Scavenging effect of diterpenoid compounds on free
hydroxyl radicals produced by Fe2+-H2O2( x ±s , n=5)
Group
Dose
/μmol·L -1
CytcⅡ
/μmol·L -1
Inhibitory
rate/ %
Cont rol / 8.64±1.45 /
Orid 50 14.90±3.85＊＊ 76.53
100 16.02±3.41＊＊ 90.22
200 16.82±3.93＊＊ 100
Pon 50 10.92±1.79 27.87
100 12.02±1.96＊ 41.32
200 13.62±2.31＊＊ 60.88
Ame 50 10.90±0.94＊ 27.63
100 12.80±0.94＊＊ 50.86
200 14.52±0.83＊＊ 71.64
Iso 50 10.38±1.85 21.27
100 11.22±1.13＊ 31.54
200 12.00±0.93＊＊ 41.08
　　＊P <0.05 , ＊＊P<0.01 vs cont rol
2.2　药物对黄嘌呤 -黄嘌呤氧化酶系统产生 O·2
的影响　各药在低浓度(200 μmol·L-1)和中浓度
(400μmol·L -1)时清除O·2的能力很低 ,高浓度(800
μmol·L -1)与对照组相比差异有显著性(P <0.01)
(Tab 2)。
2.3　药物对 LPS刺激巨噬细胞产生 NO的影响　
NO的半衰期极短 ,很快代谢成 NO-2 和 NO-3 。在
细胞培养液中 NO-2 占绝大部分 ,因此测定 NO-2 能
够较确切地反映 NO的生成情况。Orid 、Pon 、Ame、
Iso各浓度组均能明显减少 NO-2 的产生 ,与 LPS组
相比差异均有显著性(Tab 3)。
Tab 2　Scavenging effect of diterpenoid compounds on superoxide
anion produced by xanthine-xanthin oxidase stystem( x ±s , n=5)
Group
Dose
/μmol·L -1
Superoxide anion
/μmol·L-1
Inhibitory
rate/ %
Cont rol / 56.46±9.75 /
Orid 200 50.08±7.21 11.30
400 44.04±6.09＊ 22.00
800 36.32±6.77＊＊ 35.67
Pon 200 52.46±12.22 7.08
400 46.00±1.11＊ 18.53
800 36.94±8.22＊＊ 34.57
Ame 200 50.34±2.98 10.81
400 43.40±2.36＊ 23.13
800 37.32±1.06＊＊ 33.90
Iso 200 51.09±7.34 8.08
400 44.88±4.90＊ 20.51
800 38.56±5.92＊＊ 31.70
　　＊P<0.05 , ＊＊P <0.01 vs con trol
Tab 3　Effect of diterpenoid compounds on NO-2
in macrophages induced by LPS( x ±s , n=5)
Group
Dose
/μmol·L -1
NO -2
/μmol·L-1
Inhibitory
rate/ %
Cont rol / 1.79±0.08 /
Orid 0.5 1.75±0.10 4.04
1 1.45±0.10＊＊ 34.34
2 1.13±0.12＊＊ 66.67
Pon 0.5 1.67±0.17 12.12
1 1.47±0.16＊＊ 32.32
2 1.27±0.18＊＊ 52.53
Ame 0.5 1.70±0.14 9.09
1 1.61±0.13＊ 18.18
2 1.31±0.14＊＊ 48.48
Iso 0.5 1.72±0.14 7.07
1 1.56±0.13＊ 23.23
2 1.25±0.15＊＊ 54.55
　　＊P<0.05 , ＊＊P <0.01 vs con trol
2.4　药物对 CCl4 引起的肝细胞 GSH含量变化的
影响　在 CCl4 损伤组 ,肝细胞中 GSH 含量下降 ,各
用药组 GSH 水平有不同程度的回升 ,其中 Orid 4
μmol·L-1时 GSH 含量明显升高 ,显示有很强的自
由基清除能力(Tab 4)。
·1010· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin 　2003 Sep;19(9)
Tab 4　Effects of di terpenoid componnds on GSH content
in liver cell damaged by CCl4( x ±s , n=5)
Group Dose/μmol·L -1 GSH/mg·L-1
Cont rol / 10.50±1.20
CCl4 / 3.90±0.60
Orid 1 5.40±0.80＊
2 6.30±0.90＊＊
4 7.50±0.70＊＊
Pon 1 5.00±0.70＊
2 5.90±0.50＊
4 6.80±0.60＊＊
Ame 1 5.00±0.80＊
2 6.20±0.90＊＊
4 7.20±0.90＊＊
Iso 1 4.50±0.70
2 5.70±1.00＊＊
4 7.70±0.70＊＊
　　＊P <0.05 , ＊＊P <0.01 vs cont rol
3　讨论
机体在代谢过程中产生的·OH 、O·2 、H2O2 统称
为活性氧 ,当这些活性氧代谢失衡 ,可导致自由基 、
脂质过氧化作用增强 ,进而诱发一系列的损伤过
程[ 11] ,自由基对生物大分子的损伤是其对机体最直
接的危害 。
实验发现 Orid 、Pon 、Ame、Iso 对 Fentons反应
中产生的·OH 有明显的清除作用 ,但清除 O-·2 的能
力不是很强 ,这一方面可能是因为 O·2 的反应性不
强 ,另一方面可能因为这些药物是从香茶菜属植物
提取的带有羟基的不饱合化合物 ,羟基易发生氧化
反应 ,生成醌类化合物;另外双键发生加成反应 ,双
键打开 ,因此能有效地与强氧化剂·OH 起反应 ,保
护细胞膜和线粒体膜中的不饱和脂肪酸不被氧化 ,
维持膜的完整性和功能。
CCl4在 P450 作用下 ,裂解为 CCl3 , 后者与 O2
起反应产生三氯甲基过氧化基团(CCl3O-2 ),这些自
由基通过与细胞大分子化合物结合或增强膜脂质过
氧化而破坏细胞并通过消耗大量 GSH , 破坏肝细
胞。
过长时间的 NO 生成不仅可造成低血压休克 、
细胞损伤及 DNA 破坏等病理损害 ,而且还可与同
时产生的 O-·2 生成许多衍生物 ,它们都是自由基 ,对
机体造成更大的危害 。
NO 几乎可在所有哺乳动物细胞内产生 ,是一
种相对稳定的气体自由基 ,带有一个不配对的电子 ,
严格说来 NO应写成 NO- ,所以又可在体内与许多
生物分子如 O-·2 发生生化反应 ,形成许多产物 ,其中
不乏新的自由基生成 ,如 NO-2 ,这些自由基一方面
在直接作用于机体组织 ,另一方面又可引发体内自
由基连锁反应 , 加强自由基反应 。如 NO +O-·2 ※
ONOO-(过氧化亚硝酸根)有强氧化性 ,ONOO-※
ONOOH 。
本实验结果表明 ,各药物在 1 μmol·L-1时 ,
NO
-
2 的形成即明显减少 , 2 μmol·L-1时抑制率增
加 ,提示药物作用具有浓度依赖性 。另外 , Orid 、
Pon 、Ame 、Iso能明显增加肝细胞中 GSH 的含量 ,因
此对CCl4造成的肝损伤具有保护作用 ,增强机体清
除脂质过氧化物和过氧化氢的能力。
从我们的实验看出 ,上述药物具有不同程度的
抗氧化作用 ,此作用是通过直接清除自由基 ,提高体
内 GSH 含量而实现的 。
参考文献
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·1011·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin 　2003 Sep;19(9)
Studies on the antioxidant effect of diterpenoid compounds
WANG Jun ,GE Shi-Wen ,WANG Yi ,YE Qi-Xia ,ZHANG Tan-Mu
(Dept of Pharmacology , Henan Inst itute of Medical Sciences , Zhengzhou 　450052)
ABSTRACT　AIM　To study the scavenging f ree
radicals and antioxidant ef fect of di terpenoid com-
pounds.METHODS　Reductive cy tochrome C (cy tc
Ⅱ)in fenton reaction system was detected by spec-
trophotometer to indicate the scavenging capability of
the test compounds scavenging .The NO-2 content
w as measured by spect rophotometery .DNTB method
w as used to measure the content of GSH.RESULTS
　oridonin (Orid), ponicidin (Pon), amethystonal
(Ame), Isodonoiol(Iso)50 , 100 , 200 μmol·L-1
could scavenge hydroxy l radicals(·OH)in Fenten六s
reaction.Orid , Pon , Ame , Iso 400 , 800 μmol·L-1
could scavenge superoxide anion(O-·2 )in xanthine/
xanthine oxidase system.Orid , Pon , Ame , Iso 2 ,4
μmol · L-1 decreased the content of NO-2 , in
macrophages stimulated by LPS and also inhibited the
decrease of GSH content in liver cell caused by CCl4.
CONCLUSION　Orid , Pon , Ame , Iso all have an-
tioxidative ef fect through scavenging ·OH , NO-2 and
inhibiting lipid peroxidation.
KEY WORDS　di terpenoid compounds;glutathione;
antioxidant effect;hydro xyl radical;superoxide an-
ion;nitric o xide
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