全 文 ：芸薹属作物遗传转化研究的现状及
在育种上的应用前景＊
罗　静1 ,2　陈　伟1 , 2　庄　木2＊＊　李艳红1
(1.首都师范大学生命科学学院 ,北京　100037;2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ,北京　100081)
摘 要
　　本文从再生体系的建立 ,转化的方法 , 导入的目的基因以及外源基因表达效率这几个方面综述了这些年来芸
薹属作物遗传转化的现状 ,并对其在育种上的应用进行了展望.
关键词:芸薹属 , 再生体系 , 遗传转化 , 表达效率.
中图分类号:Q 949.748.3
收稿日期:2006-09-13
＊本项目由国家自然科学基金项目资助(30471189)
＊＊通讯作者
　　芸薹属作物包括许多重要的蔬菜和油料作物 ,
其中有大白菜 、小白菜 、甘蓝 、芜菁 、芜菁油菜等 ,它
们在人类的生活和农业生产上有着极其重要的作
用.目前在该属作物上 ,人们主要通过常规育种的手
段以获得更好的产品品质 ,并提高产量.但是这种传
统的育种技术由于种质资源的短缺 、远缘杂交引起
的杂交不亲和以及不良性状的连锁累赘等因素的限
制 ,阻止了育种工作的进一步发展.20世纪发展起
来的遗传转化技术 ,由于可以克服远缘杂交的限制 ,
从而更大程度地利用杂种优势.因此 ,人们期望它能
弥补常规育种的不足.本文对芸薹属作物的遗传转
化的现状及遗传转化技术在育种上的应用前景等问
题进行了概述.
1　芸薹属作物遗传转化研究的现状
1985年 ,Ooms[ 1]利用农杆菌介导法在甘蓝型油
菜上获得了第一株芸薹属的转基因作物 ,由于芸薹
属作物在农业经济上的重要性 ,因此对芸薹属作物
的遗传转化的研究越来越多.迄今为止 ,已经在甘
蓝 ,甘蓝型油菜 ,芜菁等多种作物上建立了各自独立
的转化体系.但总的来讲转化频率还很低 ,分析原因
关键在于以下几个方面.
1.1　再生体系的选择
Takasaki等在 1997年报道 ,转化率依赖于品种
的高再生力和高侵染率.大量研究表明 ,选择合适的
基因型是转化成功的一个非常重要的因素.基因型
不同 ,芽的再生频率存在着较大的差异.蔡林等[ 2] 在
探讨影响甘蓝再生频率的因素时发现即使转化的材
料都为甘蓝 ,但因为基因型的不同 ,使得其再生频率
存在着显著的差异.研究结果表明甘蓝 24-5-3和 21-
3的芽的再生频率很高 ,分别可达到92%和90%,而
8282和 23202-1的再生频率仅为 73%和 48%.对于
不同种的作物来说 ,再生频率的差异就更为显著.在
结球白菜 、埃塞俄比亚芥 、甘蓝型油菜 、芥菜这几个
种中 ,以下胚轴作为再生的外植体 ,外植体的出芽率
从结球白菜的 10%到甘蓝型油菜的 83.61%均不
等 ,而甘蓝型油菜 、埃塞俄比亚芥 、芥菜的出芽率均
高达 70%.根据每一个外植体的出芽数来统计 ,不
同品种的结球白菜显示出了很大的差异性 ,最高可
达到 5.64%,最低仅为 1.33%[ 3] .研究表明 ,甘蓝及
其变种(B .oleracea)较白菜种(B.Campestris)容易再
生 ,白菜种的菜心(B .parachinensis Bail)芽再生频率
低 ,易在愈伤组织上先形成根而抑制芽的生成[ 4] .可
见 ,基因型对再生频率的影响是很大的 ,因此 ,选择
一个较好的基因型是转化成功的基础.
另外选择合适的转化受体也非常重要.转化受
体往往来自于植物的原生质体和组织器官(叶片 、下
胚轴 、子叶 、根 、茎的皮层组织 、叶柄 、花粉和花梗
等).良好的受体必须具有高效稳定的再生能力 、较
35
　
第 28 卷　第 4 期
2007 年 8月
首都师范大学学报(自然科学版)
Journal of Capital Normal University
(Natural Science Edition)
　
No.8
Aug., 2007
高的遗传稳定性和自身的稳定性 ,并且要具备对选
择性抗生素敏感 、对农杆菌或其他转化方式敏感等
特性.
对各种外植体的再生能力研究发现 ,对于相同
的基因型来说 ,不同外植体的再生频率有很大差别.
同样是甘蓝型油菜 ,Radke[ 5] 等采用下胚轴作为转化
受体 ,其再生频率为 23%;Narasimhulu and Chopra[ 6]
等报道子叶再生频率为 26%;Klimaszewska and
Keller
[ 7]的实验中花梗的再生率是 45%～ 80%;O′
neill
[ 8] 的实验中茎段的再生频率是 50%～ 60%.Tang
等[ 3] 在研究甘蓝型油菜时对不同的外植体(花梗 、子
叶 、下胚轴 、具柄子叶)进行了比对 ,实验发现 ,子叶
的出芽率相对比较高 ,可达 56.67%,但其出芽数却
相对较低 ,仅为 1.57;花梗的出芽率最低 ,但它的出
芽数可达 3.00.Kuginuki 、Tsukazaki[ 9] 等检查了 36个
结球甘蓝和大白菜在组织培养时再生能力的差异.
结果发现不同材料在下胚轴和子叶柄的再生苗频率
上的差异很大.
研究表明 ,具柄子叶比子叶的再生能力强 ,因
为子叶柄切面上的薄壁细胞具有广泛的分裂活性 ,
很容易受农杆菌浸染[ 10] ,而且出芽数相对较多.需
要注意的是在取材的时候要避免切到它的生长点.
取材时以 4 ～ 5 d苗龄的植株为宜 ,如果苗龄过高 ,
子叶柄切面上的细胞难以脱分化 ,降低细胞的分裂
能力 ,从而使不定芽的再生能力降低.下胚轴对农杆
菌也比较敏感 ,外植体出芽数也很多 ,目前选用这两
种外植体作为转化受体的比较多 ,不足之处在于它
们都是多细胞结构 ,其再生植株嵌合体的偏高 ,后代
容易发生性状分离.虽然小孢子培养可以避免这些
问题 ,但是转化起来很困难 ,存在着感受态差和不易
再生苗的问题[ 11] .花梗的再生率较高 ,不易发生倍
性变异 ,但需要的时间长.当然 ,外植体的再生情况
还受到培养基 、苗龄 、乙烯抑制剂等一些因素的影
响.在分化培养基中加入一定量的 AgNO3 ,可以抑制
外植体在生长过程中产生乙烯 ,从而有利于芽的再
生.也有试验证明 ,用 Ag2S2O3比用AgNO 3的效果要
好[ 3] .
1.2　转化方法的选取
1.2.1　农杆菌介导的遗传转化方法
农杆菌介导的转化是目前应用最为广泛的一种
方法 ,也是研究得较为清楚的一种方法 ,其转化技术
也很成熟.农杆菌有根癌农杆菌和发根农杆菌两种 ,
根癌农杆菌用得较多.一般是取 5 ～ 6 d苗龄的外植
体预培养 2 d后放入农杆菌中浸染 ,然后将外植体
转移到培养基上共培养 2 d ,再将其转移到含有抗生
素和抑菌素的选择分化培养基上 ,待长出苗后 ,将其
转移到生根培养基上 ,使其再生为植株.Mets 等用
根癌农杆菌感染花梗 、子叶和下胚轴 ,建立了良好的
青花菜和甘蓝转化体系 , 外植体最高转化率是
10%;国内张七仙(2001)等在甘蓝上的转化率达
20%.利用发根农杆菌介导法进行转化的实验相对
很少 ,因为由转化根再生为植株不仅非常困难 ,而且
时间也长.但是 Hosoki(1989)等和何玉科(1990 ,
1991)等利用发根农杆菌分别获得了羽衣甘蓝和甘
蓝的转基因植株.
由于农杆菌介导的再生植株的转化效率不是很
高 ,近年来采用一些物理方法进行辅助介导 ,如超声
波 、低能离子束 、基因枪 、负压与农杆菌介导相结合 ,
都有助于提高转化效率.Bidney 等[ 12] 人用基因枪轰
击烟草和向日葵顶端分生组织 ,使之形成小的伤口 ,
再进行农杆菌侵染 ,这样转化效率比刀切等方法提
高了约 100倍.Kohler[ 13] 和 Benediksson 分别报道先
用电离射线或非电离射线处理受体植物细胞 ,然后
再进行转基因处理 ,转化效率提高了 3 ～ 7倍.
1.2.2　子房注射法
在植物授粉后将目的基因用微玻针注入胚囊
中 ,这时目的基因就会进入卵 、合子或早期胚胎细
胞 ,整合到其核基因组中 ,然后收获其种子 ,进行抗
生素筛选 ,最后得到转化植株.这种方法避免了用子
叶 ,下胚轴等外植体转化而形成嵌合体.但是这种直
接转化的方法容易使多拷贝的基因产生基因沉默.
林良斌(2002)等成功地采用此方法将 Bt 杀虫蛋白
基因整合到油菜基因型中 ,转化频率为 2.66%,比
采用农杆菌介导法效率高一倍左右.
1.2.3　PEG法
PEG法是将原生质体悬浮在目的 DNA中 ,通过
PEG介导 ,使目的基因转入到原生质体中 ,从而获得
转化细胞.薛红卫等(1997)已在夏光甘蓝上成功获
得再生转基因植株.其相对转化频率为 1 ～ 3%.这
种方法操作简单 ,但是对原生质体的培养而言 ,不同
时间的处理对转化的影响很大 ,不易控制.
1.2.4　脂质体介导法
由于 DOTMA的存在 ,使得脂质体带正电荷 ,带
正电荷的脂质体便与带负电荷的 DNA 自发地形成
复合体 ,因为这种复合物与植物细胞膜的结构相似 ,
所以可以高效的转化植株细胞.薛红卫等(1996)在
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首都师范大学学报(自然科学版) 2007年
夏光甘蓝上运用脂质体介导法成功的获得了再生转
基因植株.该方法的不足之处在于它虽然能得到高
度的纯合体 ,但其再生和分化能力低 ,转化效率不
高 ,操作复杂.
1.2.5　基因枪注射法
这是一种将载有目的 DNA 的金弹或钨弹经机
械动力进入靶组织的转化方法.这种转基因技术简
单实用 ,赵军良(1995)等将 GUS基因导入了甘蓝细
胞并进行了瞬时表达.熊兴华(2003)等运用基因枪
法将反义 FAD2 转到甘蓝型油菜中 ,并得到了转化
株 ,PCR阳性率为 25%.
1.2.6　花粉介导法
花粉介导法既是利用花粉作为载体 ,结合超声
波处理 ,介导外源基因对植物进行转化.该方法避免
了组织培养技术 ,转化方法简单易行 、转化率高 、费
用低 ,具有很强的实用性.杜春芳[ 14] 将 GUS 基因转
入油菜中 ,其转化频率为 2.8%.
此外 ,人们还尝试了很多其它的方法试图获得
较高的遗传转化频率.Guerche(1987)等利用电击法
将含卡那霉素抗性基因 npt Ⅱ成功的导入甘蓝型油
菜中.激光穿刺法[ 15] 的频率低 ,只能穿刺一小部分
的小孢子(小于 1%).in planta法不受宿主植株基因
型的限制 ,操作比较简单 ,无需繁杂的组织培养过
程 ,短时间内就可以获得大量的转化植株 ,但是转化
效率还是不高.在徐光硕[ 16] 的 inplanta 方法转化甘
蓝型油菜中 ,平均转化率为 0.1%左右.真空渗入转
化法简单快速 ,具有很好的应用前景.张广辉[ 17] 等
利用真空渗入法 ,以白菜型油菜子叶为受体进行转
化 ,得到其转化株 ,转化率为 2.11%.
尽管人们尝试过很多的转化方法 ,也获得了较
好的转化效率 ,但目前应用最多的还是农杆菌介导
法.另外 ,如果能有机组合不同方法 ,充分利用它们
的优点 ,将有助于提高转化率.吴珊等[ 18] 在研究茶
树外源基因转化时发现农杆菌介导与基因枪结合使
用比单独使用两种方法更能提高茶树转化的效率.
1.3　导入的外源基因以及基因表达效率的问题
1.3.1　导入的外源基因
目前 ,在芸薹属作物上已经成功转化的目的基
因种类也越来越多 ,主要有抗病基因 、抗除草剂基因
和雄性不育基因等(表 1).目前在生产上只有转基
因油菜的种植面积逐年大幅增长 ,但也只局限在对
抗虫和抗除草剂基因的利用上 ,而对其它农艺性状
进行改良的报道还很少见.
表 1　导入芸薹属作物中的常用基因
品种 目的基因 作用 参考文献
甘蓝型 crsl-1 抗除草剂 Blackshaw[ 19](1994)
油菜 AroA Christ &Sinclair[20](1992)
Bar De Block[ 21]等(1989)
Bxn Zhong 等[ 22](1997)
phbA、phbB、phBc or
bktB 、 phbB 、phbC 合成 PHB Houmiel等
[ 23](1999)
几丁质酶 抗病原真菌 Broglie 等[ 24](1991);
Grison[25] 等(1996)
正义或反义非编码
区 抗Tumv Zaccomer 等
[ 24](1993)
金属硫蛋白 耐镉 Misra&Gedamu[24](1989)
KCS 提高脂肪酸含量 Wang 等[ 26](2005)
FAD2 提高油酸含量 熊兴华等[27](2002)
ω-6-去饱和酶 Reiter 等[24](1994)
12∶0 ACP硫脂酶 提高月桂酸含量 Voelker 等[24](1992,1996)
棕榈酰-ACP硫脂酶 提高棕榈酸含量 Jones等[ 28](1995)
反义硬脂酰-ACP 硫
脂酶 提高硬脂酸含量 Knutzon等
[24](1992)
3-酮脂酰-ACP 合成
酶 改变C18酸比率 Verwoert 等
[24](1995)
Garm FatAl
增加 ACP 酶的活
性 Facciotti等
[29](1999)
溶血磷脂酸酰基转
移酶
提高三芥酸三酰
甘油含量 Lassner 等
[30](1995)
反义 napin基因 提高 Cruciferin Kohno-Murase[31](1994)
反义Cruciferin基因 提高 napin Kohno-Murase 等
[ 24]
(1995)
2S白蛋白 提高甲硫氨酸 Denis等[ 32](1995)
DapA 提高赖氨酸 Falco 等[ 24](1995)
色氨酸脱羧酶 降低吲哚类硫苷 Chavedej等[ 24](1994)
CrtB
提高类胡萝卜素
含量 Shewmaker 等
[33](1999)
barnase 诱导雄性不育 Mariani等[ 34](1990)
TA29-Barnase 何业华等[35](2003)
barstar 恢复雄性育性 Mariani等[ 36](1992)
S位点基因 自交不亲和 Nishio 等[ 24](1992)
反义绒毡层特异
A9基因
对雄性育性无影
响 Turgut等
[24](1994)
毒素A 链 增强授粉能力 Kandasamy等[24](1993)
脑啡肽(神经肽) 医药 Vanderkerckhove 等
[ 24]
(1989)
PhaH 、phaC 塑料 Poirier等[ 24](1995)
油体蛋白(oleosin) 将蛋白导入油体 Lee等[ 24](1991)
蛭素+油体蛋白 VanRooijen & Moloney(1995)[ 24]
木聚糖酶+油体蛋
白
Parmenter 等[24](1996);
Liu等[ 24](1997)
油体蛋白墓因 启动子调节 Plant等[24](1994)
低温反应基因 White等[ 24](1994)
s位点糖蛋白基因 Sato等[ 37](1991)
甘蓝 水蛭肽基因 抗血栓 王大力等[38](2002)
IGF-I 医药 张应华等[39](2005)
Bt基因 抗虫性 Bai等[40](1993)
Metz等[ 41](1995)
37
第 4期 罗　静等:芸薹属作物遗传转化研究的现状及在育种上的应用前景
续表 1
品种 目的基因 作用 参考文献
毛慧珠等[ 42](1996)
卫志明等[ 43](1998)
蔡林等[ 2](1999)
Jin等[ 44](2000)
Bhattacharya等[ 24](2002)
BT-CpTI 杨广东等[ 45](2002)
半胱氨酸蛋白酶抑
制剂基因 雷建军等
[ 46](2002)
生长素合成酶基因 提高生长速度 He等[ 47](1994)
TA29-Barnase 诱导雄性不育 沈革志等[ 48](2001)
ALS的突变基因 抗除草剂 Christey等[ 20](1992)
马铃薯 Y 病毒 CP
基因 抗病性 Radchur等
[ 49](2000)
花椰菜 Bt基因 抗虫性 华学军等[ 50](1992)
尤进钦等[ 51](1996)
蔡荣旗等[ 52](2000)
CpTI 吕玲玲等[ 53](2004)
Bt-CpTI 徐淑平等[ 54](2002)
胰蛋白酶抑制剂 Ding等[ 55](1998)
S-腺苷甲硫氨酸水
解酶基因 延熟 Wagoner 等
[49](1992)
Lat52-Bcp 花粉败育 Bhalla等[ 49](1998)
抗菌肽基因 抗病性 Braun等[56](2000)
花椰菜花叶病毒CP
基因和反义基因 Passelegue 等
[49](1996)
Bar 抗除草剂 De Block等[ 21](1989)
酵母金属硫蛋白基
因 耐镉 Hasegawa等
[ 49](1997)
青花菜 Bt 抗虫性 Metz等[ 41](1995)
尤进钦等[ 51](1996)
ACC氧化酶反义基
因 延熟
Henzi等[ 57](1999)
徐晓峰等[ 58](2003)
S-腺苷甲硫氨酸水
解酶基因 Wagoner 等
[49](1992)
ipt Chen等[ 59](2001)
ACC解氨酶基因 李贤等[ 60](2001)
SLG 反义基因 自交亲和 Torigama等[ 49](1991)
CYPB6MF反义基因 诱导雄性不育 黄科等[ 61](2005)
几丁质酶 抗病原真菌 Mora等[ 62](2001)
镉结合蛋白基因 耐镉 陈淑惠等[ 63](1998)
大白菜马铃薯蛋白酶抑制剂基因 抗虫性 张军杰等
[ 64](2004)
抗菌肽基因 抗病性 王关林等[ 65](2002)
TuMV-CP 朱常香等[ 66](2001)
TA29-Barnase 诱导雄性不育 余沛涛等[ 67](2000)
小白菜慈姑蛋白酶抑制剂基因 抗虫性 张智奇等
[ 68](1999)
CryIB 秦新民等[ 69](1999)
1.3.2　外源基因的表达效率
虽然在芸薹属作物上成功导入的外源基因很
多 ,但是对于这些基因的表达效率来说 ,大部分没有
得到预期的表达 ,而且不同外源基因的表达差异也
很大.这些基因的差异性表达不仅受到不同强度启
动子的调控 ,而且转录水平的抑制和转录后 mRNA
的积累也会造成基因沉默[ 70] .
对于启动子来说 ,它与外源基因的有效表达紧
密相关.目前在芸薹属作物上采用的一般都是来自
花椰菜花叶病毒的 35S启动子 ,它的缺点在于使得
外源基因在植物体内持续高效的表达而造成不必要
的浪费 ,因为在植物工程上 ,我们往往需要的是让外
源基因在特定的时间特定的组织部位进行表达.如
果外源基因过量表达 ,可能会在植物生长过程中产
生毒素而不利于植物的生长.对于转化方法来说 ,采
用直接转化法 ,例如:PEG法 、脂质体介导法 、基因枪
注射法 、电击法等 ,导致插入的基因拷贝数很高 ,这
样容易引发基因转录后沉默.虽然农杆菌转化法产
生的基因拷贝数要相对低些 ,但是它经常会在单一
位点上以反向重复的结构出现 ,这样引发基因沉默
的几率更大.通过筛选单一拷贝数的转化株 ,尤其是
对于农业上的一些难以转化的作物来说 ,是不切实
际的[ 71] .所以如何控制外源基因沉默并提高外源基
因表达效率是当前转基因工作面临的重要任务.目
前研究表明 ,构建含MARs的表达载体 、选择特异性
或诱导性的启动子 、建立位点特异的重组体系 、利用
引导肽定位外源基因的表达产物 、利用线粒体和叶
绿体的转化以及对目的基因的改造等方法均在一定
程度上可以提高基因的表达效率.
2　在育种上的应用前景
综上所述 ,芸薹属作物的遗传转化虽然在一定
程度上取得了较大进展 ,但是与其它作物相比 ,其发
展速度较慢.由于外源基因在转化体中的命运还很
难控制 ,可能存在基因插入失活 ,或整合位置不当而
发生基因沉默现象;或者由于产生嵌合体 ,导致后代
性状发生分离的频率较高 ,因此所期望的基因表达
的强度及性状与实际结果还存在较大的差距.在此
基础上 ,尽管人们尝试过多种方法 ,但基因的转化效
率仍然很低 ,因此很难得到一个大的转化群体 ,那么
能筛选到基因稳定表达的纯合系的可能性就很低 ,
这严重制约了良好的转基因种质资源的获得.目前 ,
对于芸薹属的一些作物来讲 ,获得一个有应用价值
的稳定转基因系所需要的时间比传统育种获得一个
新品种还要长 ,这种较长的周期性限制了其在育种
上的应用.
尽管如此 ,遗传转化方法由于理论上能创造自
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首都师范大学学报(自然科学版) 2007年
然界没有的种质资源 ,尤其在抗病毒育种 、创造优良
的雄性不育的种质资源等方面具有独特的优势 ,再
加上人们对转化系统的不断探索 ,将来无抗生素标
记的转化技术也有望在该属的遗传转化上得到应
用 ,同时针对该属作物遗传转化效率低的问题 ,加强
外源基因在植物体内整合机理的研究 ,有望进一步
在提高转化频率上有所突破.因此进一步摸索改进
并完善转化系统 ,并试图得到对人类有益的种质资
源 ,以便其真正在育种上得到应用并体现其价值.笔
者现在就甘蓝的一些骨干自交系 397等进行病毒相
关基因的转化 ,已得到了抗病毒植株(未发表),为今
后甘蓝抗病毒育种工作提供良好的种质资源.
参 考 文 献
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Research on the Livability Detection of Plant Protoplast
and the Staining Method of Protoplast Nucleus
Huang Jing
1　Zhao Qi1　Li Nan1　Zhao Yujin2　Zhang Shihuang2
(1 College of Life Science , Capital Normal University , Beijing　100037;
2 Maize Research Center Institute of Crop Sciences , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Bei jing　100081)
Abstract
In this paper , the coloration effects of different dyes were compared for livability detection of plant protoplast and the
staining protoplast nucleus as materials of tobacco mesophyll protoplasts and tobacco suspension protoplasts.The result
showed that the coloration effect of FDA was high clear and convenient observation for protoplasts livability.MTT staining
was suitable for quantitative analyzing protoplasts livability.The coloration effect of DAPI dye was better than the other
cell nucleus dyes for protoplast nucleus from different source , which make protoplasts observed and counted clearly.This
research would be of some referential value for observing protoplasts.
Key words:tobacco , protoplast , nucleus , dye.
作者简介　黄静(1982-),女 ,汉族 ,籍贯北京 ,首都师范大学生命科学学院在读硕士研究生.专业:航天生物学.
(上接第 41页)
Progress in the Genetic Transformation of Brassica Vegetable
Crops and its Application Prospects in Breeding
Luo Jing
1 , 2　Chen Wei1 , 2　Zhuang Mu2＊　Li Yanhong1
(1 College of Life Science , Capital Normal University , Beijing　100037;
2 Insititute of Vegetables and Flowers , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing　100081)
Abstract
This paper reviews brassica vegetable crops in terms of the construction of regeneration system , transformation
methods , exogenous genes and expression efficiency and discusses the application prospects in breeding.
Key words:Brassica campestris , regeneration system , genetic transformation , expression effiency
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第 4期 黄　静等:烟草原生质体活力检测和细胞核染色方法的研究