全 文 ：芸蔓属作物体细胞杂交研究
浙江农业大学农学系 俞志华
自C o ck i n g ( 19 6 0) 首创原生质体技术 以来 , 目前植物原生质体培养和体细胞杂 交
技术 已进入实际应用阶段。 已有大量的植物甚至包括单子叶的禾谷类作物如玉米 、 水稻
(W eb b
, 1 9 8 8) 均可 由原生质体再生植株 , 并在分类上不同程度趋异的植物种 、 属间
产生了 70 多种体细胞杂种或胞质杂种的愈伤组织和植株 ( A m ar 等 , 19 8 7) , 包 括 谷 类
作物的水稻 + 稗的杂种 ( T e r a d e , 1 9 5 7 ) 、 甘蔗 + 美洲狼尾草等杂种 ( L 6 r z等 , 1 9 8 8 ) 。
在这些植物 中 , 十字花科植物特别适用 于原生质体技术 , 因为该科中许多物种其原生质
体易于培养 , 如芸墓属作物就属于最早应用原生质体和体细胞杂交技术的一 类 作 物 之
一 , 自70 年代中期通过叶肉细胞形成愈伤组织和再生植株 ( K ar t h a 等 , 1 9 7 4) 以来 ,
目前芸蔓属作物几乎所有的种都可 由原生质体再生植株 ( V a m h n g 等 , 1” 0) , 并 通过
体细胞杂交技术已产生了种间 、 属间 、 族间的许多体细胞杂种 。 这表明应用原生质体培
养和体细胞杂交技术进行种 、 属间基因转移 , 以改 良芸蔓属作物的某些性状 已 成 为 可
能 , 并且应用该技术首次有可能对那些有性杂交中严格表现单亲遗传的种开展细胞器遗
传学的研究 。
一 、 种间体细胞杂种
芸蔓属 ( B r a s s i e a ) 有三个基本种 , 即黑 芥 菜 ( B . 0 1夕 , a , Z n = 1 6 ) 、 甘 蓝 ( B .
。 l e r a C e a , Z n = 1 8 ) 和 中国油菜 ( B . e a 。 户。 s t , ·` s , Zn = 2 0 ) 。 应用芸墓属的一些 基 本
种产生体细胞杂种 , 最初的 目的并非直接注重于作物的改 良 , 而主要是揭示芸蔓属各个
栽培种的起源 , 以证实各个多倍体种和基本种的亲缘关系 , 或产生新种如 A ar ib d o b犷a -
名 s ic a ( G l e b a等 , 1 98 0) 。 尽管可通过有性杂交如利用甘蓝 x 中国油莱 产 生 欧 洲 油 菜
( B
. o a P su )
, 或用中国油菜 火 欧洲油莱产生双二 倍体 新 种 ( B 。 ne P oc a 。 户se tr `s) ,
但其杂交后代在结实上极不稳定 , 有时几乎不能结实 , 为产生成功的杂种需应用胚培养
技术 , 并且迄今为止 , 应用有性杂交尚不能将芸墓属三个基本种的基因组 ( A , B , C )
重组在一起 。 显然 , 通过常规 的杂交技术进行种 、 属间基因转移改 良油菜的遗传变异性
仍然是有 限的 。
应用原生质体培养和体细胞杂交技术则可越过种 、 属间有性杂交中所具有 的障碍 ,
为将不同种 、 属间的基因组重组一起产生新种 , 或进行有利基因转移架 起 了 桥 梁 。 目
前 , 在芸签属种间通过原生质体融合已成功地产生了那些用有性杂交很难得到的异源多
倍休 , 而且也证 明最难形成 的三基因组杂种 B . o P 。 爪 gr a ( n = A B C ) 为可育 的 真 杂
种 , 具有 54 条预期的馨色体数 , 且具有亲本种典型 的同功酶谱 。 其双三倍体 B · 。 。 p 。 。 -
J e r a o e o ( n = A C C ) 及 双 四 倍 体 B . n a P o j u n e e a ( n = A A B C ) 和 B . , a P o e a , i , a t a
( n 二 A B C C ) 均易于从杂种愈伤组织高频再生 , 所获得的大量植株具有预期的 染色体
数 , 且具有相当高的育性 。 应用体细胞杂交技术表明了这些基因组间的高度亲和性 。
更具有实际生产意义的是 , 进行抗油菜气肿性碳疽病 ( 由 p h o m a h n g a m病原菌引
起 ) 基因的转移 。 已发现 B . n:’ g r a、 阿比西尼亚油菜 ( B . c ari o t a, Z n = 3 4 ) 、 白芥菜 -
( B
.
j “ n c ea
, Z n = 36 ) 的某些材料对该病害具有高度抗性 , 其抗性基因可能位于 B 基
因组中 ( S j6 id n 等 , 19 8 ) , 由于其抗性基因所在的基因座的正确位置尚未确 定 , 因此
应 用体细胞杂交 , 将上述这些种内的抗性基因转入 B . an P su 可能是有 效途 径 。 为 此 ,
jS
o id n 等 ( 1 9 8 9) 利 用这些抗病材料与感病的 B . , 。 p us 进行 了 体 细 胞 杂 交 , 即 B .
j 。 , e e a + B
· n a户u s , B . n ` g r a + B . 、 a 户。 : , B . 。 a r `n a *。 + B . 。 a户u s 。 并在原生质体融 .
合杂交前 , 应用 X 一射线对抗病的供体原生质体进行辐射处理 , 以提高体细胞杂种 中 染
色体片 段间的重组频率 , 然后将形成 的愈伤组织在加有 P L毒素的培养基中培养再 生 植
株 , 并进行抗病性筛选 , 结果由抗 p h o m a的不对称杂种产生的某些后代具有抗 病性状 ,
这表明应用体细胞杂交 , 并在培养基中再生植株的过程 中施加选择压 , 已使抗病基因在 ’
种间得到转移 。 因此 , 在芸蔓属作物中 , 目前已可将不 同种间的原生质体融合一步产生
异源多倍体新种 , 并可进行种间的基因转移 , 从而避免 了有性杂交后代所必需的加倍过
程 , 也避免了由加倍可能引起的遗传变异性减少的现象。
二 、 属间体细胞杂种
与自然界自发形成 的异源多倍体作物不 同 , 大多数人工创造的属间新物种或多或少 ,
存在着一些 问题 。 如由芸蔓属和萝 卜属合成 的萝 卜甘蓝 ( R a p h a n o bar s s i ca ) 是一 种比
较有希望的饲料作物 , 但 由于其结实率低而限制了其农用价值 。 因此 , 利用体细胞杂交 ,
技术产生属间体细胞杂种更主要的是改 良栽培作物的某些性状而不是直接利用其 创造的
新物种 。 例如将十字花科中其它属如花生属 ( E r u ca ) 的抗早性和抗蚜虫性 、 欧白芥属 -
( S i n a p i。 ) 的抗病性 、 二行芥属 ( D i p l o t a x i s ) 的细胞质雄性不育 ( CM S ) 等 性状导
入油菜 , 这在生产上具有重要意义 。 可喜的是在芸蔓属作物 中通过体细胞杂交技术已经
产生 了许多属间体细胞杂种 。 这些供体亲本属包 括 : 萝 卜属 ( R a p h a n u s) 、 E r u ce 、
D i p l o t a x i s
、
S i n a p i s和 M o r i e a n d i a属 。 例 如 , E r u e e 、 S i n a p i。和 D ip l o 七a x i s 分 别与
B
. , a P us 和 B . j o n o e a 通过体细胞杂交 , 所有组合均产生 了可育的体细胞杂种 , 其中有 `
的具有各属的整套染色体组 , 但大多数杂种则具有不对称染色体数 。 F a hl e阳 n ( 1 9 8 8) -
的 B 。 。 a P su 十 E . sa lt’ o a (花生 ) 的试验结果表明 , 该组合产生体细胞杂种比 较容易 ,
尽管大多数杂种具有不对称染色体数 , 但在育性上并无克服不了的严 重 问 题 。 iS k d a r
( 1 9 9 0 ) 从 B · u] 、 ae 十 E . sa 叮v a组合中产生了 18 1个再生植株 , 对其中63 个植株 的 分
析表明 , 有 n 个为真杂种 ( Zn = 58 ) , 有 10 个具有不对称染 色 体 数 ( Z n = 50 一 56 ) , 杂 4
种的花粉育性为 0一 82 . 9% , 结实率为 O一 50 % 。 由E r u co b ar 8 ic a体细胞杂种回交 两 代又
所产生的后代已进行 了田间试验 , 由于该组合所用 的油菜品种其芥子酸含量较低 , 相反
E r u c a的芥子酸含量很高 , 因此 杂种中高的芥子酸含量就可作为基 因转入的标志 加 以选
择 , 并可根据性状间的相关 , 选择具有 E r u ca 所提供的其它农艺性状的植株 。
但也有些属间杂交组合所产生的体细胞杂种其染色体变异较少 , 例如 M or `c a 。 成 a
a r v e ” 5 1 5 + B · O l e r a e e a ( T o r i y a m a , 2 9 5 7 ) 其杂种中双亲染色体组都是完整的 , 同功
酶谱分析也表明其是真杂种 , 尽管杂种是雄性不育的 , 但用. B . ol o ar ce a 授粉可以结实。
这些试验表明 , 芸蔓属与M or ic a n id a属的亲缘关系可能是比较近的 。
为提高属间体细胞杂种的育性 , 就必须尽可能减少杂种的染色体数的变异和对外源
一 j . 8 一
染色体组的排斥 , 这就需要 了解杂种染色体数变异的原因 , 以便采取相 应 的 对 策。 对
此 , K ir st in a等 ( 1 9 9 1 ) 曾作了分析 , 其主要原因可概括为 : ( 1 ) 在原生质体融合过程
中由于重复融合导致较高的染色体数 ; ( 2 ) 双亲组织其细胞所处的分裂期不同 , 由此分
离和融合的杂种有可能出现不对称的染色体数 , ( 3 )杂种核内双亲核 D N A复制速 率 上
有差异 ; ( 4 ) 离体细胞培养中的体细胞克隆变异 。 因此 , 为减少杂种染色体数的变异 ,
有 必要针对不同情况 , 应用适当 、 适时供试材料 , 采取最适融合和培养方法及外界条件 。
三 、 族间体细胞杂种
芸墓属作物除了可与不同种 、 属植物杂交产生体细胞杂种外 , 与不 同族 的植物也易
于进行体细胞杂交 。 早在 80 年代初 , 就有族间体细 胞 杂 种 的 报 道 , 如 月 ar 杭 d o P抓 :
t a l i a o e (拟南芥菜 ) + B 。 e a 二 P e : t r ` s的体细胞 杂 种 ( G l e b a 等 , 1 9 9 0 ) , K r i o t i n a 等
( 1 9 9 1 ) 报道 了他们用十字花科不同族植物如用山芥属的山芥 ( B ar b a : e a v lu g二`: ) 、
薪莫属的穿叶薪黄 ( T hl a s P` P er ` f ol iat o m ) 作为供体亲本 , 分别于 B . o P us 进 行 了
体细胞杂交 , 用于转移 B ar b ar 殷中的抗寒性和 T h l a SP i中可用作润滑剂的高含 量的廿 四
烯酸和脂肪酸等性状 。 他们的试验表明 , 由融合后原生质体产生 的愈伤组织很易诱导出
芽 , 离体培养也很容易生长 , 尽管在形成根和芽转移到温室中还存在一定问题 。 杂种组
织 的同功酶和 R P L P分析也表明获得了具有不对称染色体数的体细胞杂种 T hl a印 ob ar -
s s i e a 和 B a r b a r e o b r a s o i e a , 某些 T h z a s p o b ; · a 。 。 i e a不对称杂种用刀 . 二 。夕。 : 回交可以产生
种子 , 这就有可能对杂种的遗传组成和转移性状的遗传进行进一步研究 。
, 四 、 胞质杂种
体细胞杂交技术不仅是种 、 属间转移基因的一条有效途经 , 也是一种研究高等植物
细胞器遗传学的新途经 。 因为原生质体融合可使双亲的细胞器组合 , 产生具有某一特定
的核基因组与外来叶绿体和 /或线粒体基因组组合的体细胞胞质杂种植株 , 这无论对于农
艺性状的改进还是进行核一细胞器基因组间的遗传互作研究都是重要的 。
在芸墓属作物 中进行体细胞杂交的另一 目的是转移一些由细胞质遗传且农艺上重要
的性状 。 P le le 认 er 等 ( 1 9 8 3 ) 利用具有萝 卜雄性不育细胞质的甘蓝的油菜细胞质雄性不
育系 ( C M S ) 的原生质体与正常的油莱品系 的原生质体融合 , 选择到了 5 株具有雄性不
育的花 、 正常的叶绿素含量和花蜜产量的胞质杂种植株 , 这就克服了原有 CM S系在低温
下表现缺乏叶绿素 、 花蜜产量减少的缺限 。 其进一步的分析表明 , 这 些植株在油莱核背
景下 , 只具有油菜的叶绿体 D N A 和一种含萝 卜线粒体 D N A 的重组型 线 粒 体 D N A 。 此
外 , . 他们把一个甘蓝型油菜 (萝 卜细胞质 ) C M S系的原生质体与另一个甘蓝型油菜 (白
菜型油菜细胞质 ) 的抗秀去津品系的原生质体融合 , 并选择到一植株 , 该植株在油莱核
背景下 , 具有 白菜型油菜的叶绿体 D N A (与抗隽去津有关 ) 和含有 某些 萝 卜线 粒 体
D N A (与 C M S性状有关 ) 的重组型线粒体 D N A , 这些植株已被油菜和甘蓝的育种家所
利用 , 目的是导入 C M S和抗芳去津性状 , 以供商用 F l 杂交 种子 的 生 产 。 J o u r d a n 等
( 1 9 8 9 ) 也通过体细胞杂交技术 , 产生了含有来 自不同双亲的线粒 体 ( 由 B 。 ol er cQ 。
提供 , 与 C M S有关 ) 和叶绿体 ( 由B 。 ca o P se t八 s提供 , 与抗芬去津有 关 ) 的 胞 质 杂
种 。 这种属间 、 种间胞 .质杂种用有性杂交很难产生 , 唯一的办法是通过体细胞杂交 , 以
提供体细胞杂种或胞质杂种后代中叶绿体 、 线粒体和核基因组独立分离和重组的机会 。
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