全 文 ：　　本文为第一作者在德国的专业进修部分内容。
　　收稿日期: 1999— 01— 15
不同供体原生质体前处理方法对甘蓝与萝卜
属间原生质体融合植株再生的影响
雷开荣1 , U. Ryschka2 , E. Klo cke2 , G. Schumann2
( 1.重庆市农业科学研究所 , 中国重庆　 400055; 2. 德国联邦育种研究中心 , 奎德林堡市　 D- 06484德国 )
摘　要: 用酶法分离甘蓝下胚轴原生质体和萝卜叶肉原生质体 , 对供体原生质体
(萝卜 ) 进行融合前单因素 (酶 EcoRI) 或双因素复合处理 (酶 EcoRI+ UV 0. 035-
0. 105J/cm
2
) , 用 PEG法诱导甘蓝与萝卜属间非对称性原生质体融合。结果表明 ,
( 1)不同处理方法对植株再生率有明显影响 , 对称性融合植株再生率为 8. 5% ,非对
称性融合植株再生率低 3个百分点 ; 单因素处理植株再生率达 11% , 双因素复合处
理植株再生率只有 2. 3%。在双因素复合处理中 ,尽管各处理间植株再生率有显著差
异 , 但紫外线强度与植株再生率间无明显的规律变化 ; ( 2) 双因素复合处理再生植
株具有较低的相对 DNA含量 ,通道数为 41-130,约 30%再生植株的相对 DNA含量
与甘蓝相似 (甘蓝为 43, 萝卜为 32) ; 97. 5%的单因素处理融合再生植株具有较高
的相对 DNA含量 (通道数为 71-220)。初步表明 , 双因素复合处理能够消除更多的
供体遗传物质 , 为蔬菜原生质体非对称性融合提供了一条可资参考的途径。
关键词: 甘蓝 ; 萝卜 ; 原生质体 ; 非对称性融合 ; 再生植株 ; 相对 DNA含量
Effect of different treatment on plant regeneration of
protoplast fusion between cabbage and turnip
LEI kai-rong1 , U . Rysch ka2 , E. Klocke2 , G. Schumann2
( 1. Chongqing Ins ti tu te of Ag ricul tu ral Sciences , Chongqing 400055, China; 2. Fed eral Cent re for Breeding Research on Cult i-
vated Plants, Quedlin burg D-06484 Germany)
Abs tract: Tu rnip mesoph yl l p rotoplas ts w ere treated wi th one-facto r ( en zyme Eco R I) o r two-factor ( enzym e EcoRI+ 0. 035
～ 0. 105 J /cm2 of UV-radiation ) in an ef fort to eliminate as much of th e nuclear material as pos sible. Basi s material of cabbag e
breeding w ere developed f rom protoplas t fusion betw een B . oleracea var. capi tata and R. sat ivus L. 268 regen erated plants
w ere ob tained f rom protoplas t fusion. Rate of regenerat ion of s ymmetric fusion was 35. 3% more th an as ymmetric fusion. In
as ymmetric fusion rate of regeneration w as 11% for one-factor-t reatmen t, on ly2. 3% for tw o-factor-t reatment. Th e nuclear
DN A content of fusion reg enerated plants w ere tested and analys ed by a“ partec cell Analyzer CA-Ⅱ ” . Th e n uclear DN A con-
tent of fusion regenerated plan ts f rom tw o-factor-treatment w ere relativ e low er, channel n umber dis t ributed f rom 41 to 130,
30% of regen erated plan ts had as much DNA con tent as recipient parent cabbage (channel n umber of cabbage was 43, tu rnip
5
1999年 12卷 4期
Vol. 12　　 No. 4　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
Southw es t China Jou rnal of Ag ricul tural Sciences
DOI : 10. 16213 /j . cnki . scjas . 1999. 04. 002
was 32) , 97. 5% of reg enerated plants f rom one-factor-t reatmen t had more relativ e DN A contents (channel number w ere
f rom 71 to 220) . Th e resul ts show ed that tw o-factor-t reatments could eliminate more nuclear material of donor paren t.
Key words: cabbage; turnip; protoplas t fusion; regenerated plant; relative DN A conten t
甘蓝 (Brassica oleracea var. capi tata) 是世界上普遍种植的一种蔬菜作物。近年来 , 甘
蓝的黑腐病、 软腐病、 根肿病等日趋严重 , 成为甘蓝育种和生产的一大难题。栽培种内抗源
材料的缺乏 , 已成为甘蓝抗病育种的制约因素〔1〕 ; 虽然在甘蓝的异源种或野生种中有黑腐病、
软腐病、 根肿病的抗性基因 , 但又难于通过常规的有性杂交方法进行转移。 通过原生质体融
合技术 , 能克服异源种属间的有性杂交障碍 , 实现基因交流、 重组 , 从而创造新的育种新材
料甚至新物种〔2〕。
本研究以甘蓝的生产种为受体 ,以高抗黑腐病、软腐病及根肿病的萝卜野生材料为供体 ,
在原生质体融合前 , 用酶或酶+ 紫外线对供体原生质体进行单因素或双因素复合处理 , 以探
讨不同处理方法对植株再生的影响。 通过对供体亲本进行双因素复合处理 , 实现原生质体非
对称性融合并获得再生植株的工作 , 在国内外均未见报道。
1　材料和方法
1. 1　材料
以甘蓝 (B . oleracea var. capitata L. ) “ Toskama F1”为受体 (种子由德国 Marner GZG
种子公司提供 ) ; 以萝卜 ( Raphanus sativus L. ) 野生材料 “ Neo ro RA 129 /84” 为供体 , 该
材料抗黑腐病、 软腐病、 根肿病等多种病害。
Toskama F1　 6～ 7日龄下胚轴、 Neoro RA 129 /84 3～ 5周龄新鲜叶片分别为受体、供体
原生质体的材料源。
1. 2　方法
1. 2. 1　叶肉原生质体 (萝卜 ) 和下胚轴原生质体 (甘蓝 ) 的准备　叶肉原生质体: 供体植株
植于 MS+ 0. 2mg /L N AA培养基上 , 在温室中 ( 20℃ , 16h光照 )生长 3～ 5周 , 在无菌条件
下取新鲜叶片置于盛有 6ml 1 /2液的培养皿内 , 将叶片切成约 3mm左右的细段 , 室温下暗处
存放 5～ 7h, 之后 , 每培养皿加酶-I贮液 ( 2%纤维素酶、 0. 5% MKC-半纤维素酶、 1%果胶
酶、 0. 5% Driselase) 3ml , 用胶带封口 , 将试样放置于平行振荡器上 , 30rpm、 室温、 黑暗条
件下过夜 (约 18h)。
下胚轴原生质体: 将 6～ 7日龄的受体下胚轴切下放置于盛有 6ml 1 /2液的培养皿中 , 快
速切成 1～ 2mm的细段 ,之后 ,吸去 1 /2液 ,每培养皿加 6ml TV L液 ( 54. 6g /L山梨醇 , 7. 4g /
L氯化钙 , pH5. 6～ 5. 8) , 在室温下 , 暗箱中放置 1h; 小心吸去试样中的 TV L液 , 加 6ml酶
-V贮液 ( 0. 1%果胶酶 , 1%纤维素酶 ) , 胶带封口 , 置于平行振荡器上 , 30rpm, 黑暗条件下
过夜 (约 18h)。
1. 2. 2　原生质体的分离　据德国联邦育种研究中心蔬菜、药用植物与调料研究所的 “原生质
体分离、 纯化及融合程序” 进行〔3～ 5〕。
1. 2. 3　供体原生质体的融合前处理　试验 A: 在供体 (萝卜 )原生质体分离前 , 每培养皿加
入 9μl ECORI ( EU ROGEN TEC, 40000单位 , 浓度 50μ/m l) , 室温黑暗条件下 , 平行振荡器
上 50rpm , 处理 2h, 之后 , 进行过滤、 分离、 清洗、 纯化 , 获得经 EcoRI处理的供体原生质
6 西　南　农　业　学　报 12卷
体 , 供融合用。
试验 B: 首先 , 如试验 A, 供体原生质体经 EcoRI处理 1h, 获得经 EcoRI处理的供体原
生质体后 , 在 10ml离心试管中 , 用 W5液 , 将原生质体液稀释至 1× 106个 /ml , 将原生质体
每份 1. 5ml分置于直径 5cm的无菌培养皿中 , 用紫外线发生仪 “ Bio link BL-254” 对供体原
生质体进行紫外线处理 , 剂量分别为: 0. 035J/cm2、 0. 070J /cm2和 0. 105 J/cm2。以未经酶
( EcoR I) 和紫外线 ( UV ) 处理的供体原生质体为对照。
试验 C: 供体原生质体分离纯化之后 , 在 10ml离心试管中 , 用 W5液将叶肉原生质体稀
释至 8m l, 然后加入 8μ1EcoR I, 在室温、 黑暗条件下 , 置于平行振荡器上 , 50rpm , 1h; 之
后 , 加 W5液至 10m l, 1000rpm离心 5min, 去掉上清液 , 再用 W5液离心清洗 2次 ; 经酶处
理后的原生质体 ,如试验 B再经紫外线处理 ,强度依然为: 0. 035 J/cm2、 0. 070J/cm2和 0. 105J /
cm
2。
处理后的原生质体 , 均在室温下静置 2h, 再进行原生质体融合。
1. 2. 4　原生质体融合　各试验各处理 , 依下列步骤进行原生质体融合:
( 1) 受体、 供体原生质体按 1: 1比例混合 ;
( 2) 混匀后的原生质体转入 5cm直径无菌培养皿中 , 每培养皿 7滴 , 每滴 40μl, 静置 8
～ 10min。
( 3) 60μl PEG-2液 ( 40% PEG1550) 对称地加在每滴原生质体混合液的两边 , 5min后 ,
小心倾斜培养皿 , 吸去 PEG-2液。
( 4) 每培养皿加入 1. 5～ 2. 0mlPEG-3液 ( 13. 3% PEG1550) , 5min后去掉。
( 5) 加入 1. 5～ 2. 0mlPEG-4液 ( 6. 7% PEG1550) , 5min后去掉。
( 6) 加入 2～ 3ml 1 /2液 , 小心清洗 2次。
( 7) 每培养皿加 2ml 1 /2液 , 并用 Nesco胶密封 , 黑暗条件下培养 3～ 5d。
1. 2. 5　愈伤组织的培养及植株再生　试验各处理在融合 2～ 3d后 , 均开始细胞分裂 , 3～ 5d
后 , 10%以上原生质体发生一次或多次分裂。此时 , 每培养皿加入 400μl 2 /2营养补充液 , 并
转入弱光条件下培养 , 视原生质体分裂情况 , 每 3～ 5d加一次 2 /2液 , 一般 2～ 3次 , 当有较
多大型细胞团 ( 20个细胞以上 ) 时 , 将其转移到 3. 10固体培养基或 K3K培养基 ( 0. 2%琼
脂 ) 上。当发育为 1～ 2mm左右的小愈伤组织时 , 分期分批将其转入 4. 1培养基 , 7～ 10d后
移入 5. 1分化培养基。在 5. 1培养基上分化出比较完整的小苗后 ,将其切下 ,移入 MS基本培
养基上 , 待小苗生长基本正常后 , 将其移入 M S+ 0. 2mg /L N AA培养基上进行培养 , 多数幼
苗在 7～ 10d后能正常的生根 , 并发育为正常植株。
1. 2. 6　再生植株的相对 DNA含量分析　以新鲜叶片为材料 , 在细胞分析仪 “ Partec CAⅡ”
( PA) 上完成〔7, 8〕。
2　结　果
2. 1　不同处理方法对植株再生的影响
在 A、 B、 C三个融合试验中 , 共获得甘蓝与萝卜的体细胞杂交后代 268株 , 植株再生率
为 5. 8% , 其中对称性融合后代 23株 , 植株再生率为 8. 5% 。非对称性融合后代 245株 , 植
株再生率为 5. 5% (表 2) ; 与单因素 (酶 ) 处理相比 , 双因素复合处理具有相对较低的植株
再生率 ; 在原生质体分离之前进行酶处理 , 能够产生较多的再生植株 ; 在试验 B中 , 紫外线
74期 雷开荣等: 不同供体原生质体前处理方法对甘蓝与萝卜属间原生质体融合植株再生的影响
强度为 0. 105J/cm2的复合处理未能获得再生植株 (表 1)。
表 1　植株再生率与供体原生质体处理方法的关系
Table 1　 Eff ect of di fferent treatments on rate of regeneration
试验名称 受　体 供体 处理方法 愈伤组织数 再生植株数 再生率%
Experiment Recipient Donor Treatmen t Cal lus n umber Regenerated plants Rate of regeneration
A
甘蓝
cabbage
萝卜
tu rnip
Eco R I 2小时 1540 180 11. 7
B 甘蓝
cabbage
萝卜
tu rnip
E 0+ UV 0. 00
E 1h r+ UV0. 035
E 1h r+ UV0. 070
E 1h r+ UV0. 105
268
460
482
272
23
2
33
0
8. 5
0. 4
6. 8
0
C 甘蓝
cabbage
萝卜
tu rnip
E 1h r+ UV0. 00
E 1h r+ UV0. 035
E 1h r+ UV0. 070
E 1h r+ UV0. 105
120
594
528
460
3
8
12
7
2. 5
1. 3
2. 1
1. 7
图 1　融合亲本及部分后代的相对 DNA含量结构图
Fig. 1　 His tograms of relative nuclear DNA content of fusion’ s parents and a few regenerated plants
注: c) 和 d) 为单因素处理后代 ; e) 和 f ) 为双因素处理后代 ;
Note: c) and d) w ere regenerated plants f rom one -factor-t reatm en t; e) and f ) w ere regenerated plants f rom
tw o-factor-t reatment
8 西　南　农　业　学　报 12卷
2. 2　不同处理方法间再生植株的相对 DNA含量差异
用细胞分析仪对甘蓝与萝卜属间原生质体融合再生植株的相对 DNA含量进行了测定 ,
对不同处理的 205个单株的测定结果表明 ,在酶单因素处理中 ,各再生植株间相对 DNA含量
差异巨大 , 从 41至 220 (通道数 , 表 3, 下同 ) ; 相当大一部分再生植株属于混倍体或多倍体
(图 1)。
表 2　对称性融合与非对称性融合植株再生率的比较
Table 2　Diff erences of rate of regeneration between symmetric and asymmetric fusion
处　　　　理
Treatment
愈伤组织数
Callu s number
再生植株数
Regen erated plants
再生率%
Rate of regeneration
非对称性融合　酶 En zyme 1660 183 11. 0
Asymmetric　 酶+ 紫外线 2696 62 2. 3
fusion　 En zyme+ UV
合计 Total 4356 245 5. 5
对称性融合
Symmetric 268 23 8. 5
fusion
　　在酶+ 紫外线双因素复合处理中 , 再生植株的相对 DNA含量分布于 41至 130之间 , 有
约 30%再生植株的相对 DNA含量与受体亲本甘蓝 ( 43)相近 ,这部分植株是否是体细胞杂种 ,
还有待于用 PCR技术进行鉴定。无论如何 , 已有结果表明 , 通过对供体原生质体进行双因素
复合处理能诱导产生相对 DNA含量较低的再生植株。
表 3　融合后代植株的相对 DNA含量分布
Table 3　 Dis tribution of relative DNA content of fus ion plants regenerated from B . oleracea+ R . sat ivus
试　验
Experiment
处理方法
Treatment
相对 DNA含量 relativ e DN A con tent ( No. of channel)
41- 51- 61- 71- 81- 91- 101-111-121-131-141-151-161-171-181-191-201-211-
合计
Total
A EcoRI, 2小时 10 32 2 6 6 10 2 6 3 11 5 4 7 8 6 118
B E 0+ UV0. 000 7 11 1 1 1 21
E 1h r+ UV 0. 035 1 1 2
E 1h r+ UV 0. 070 1 1 12 18 32
E 1h r+ UV 0. 105 0
C E 1h r+ UV 0. 000 3 1 1 1 6
E 1h r+ UV 0. 035 2 3 5
E 1h r+ UV 0. 070 14 14
E 1h r+ UV 0. 105 1 4 2 7
非对称性融合 酶 En zyme 3 11 32 2 6 6 10 2 6 3 11 5 5 8 8 6 124
Asymmetric 酶+ 紫外线 17 5 5 2 1 12 18 60
fusion Enzym e+ UV
对称性融合 7 11 1 1 1 21
Symmetric
fusion
　　在双因素复合处理试验中 , 原生质体分离后进行酶+ 紫外线复合处理 , 能消除更多的供
体核基因 ,所有再生植株的相对 DNA含量均低于 100 (试验 C) ; 而融合前酶处理+ 紫外线的
90%再生植株的相对 DNA含量在 100至 130之间 (试验 B)。
3　讨　论
对称性原生质体融合再生植株 , 含有受体、 供体两套完整的基因组 , 由于异源基因组的
94期 雷开荣等: 不同供体原生质体前处理方法对甘蓝与萝卜属间原生质体融合植株再生的影响
相互排斥 , 往往出现再生植株高度不育或全不育 , 畸形严重 , 性状稳定性差 , 且随着世代的
递进 , 会出现异源基因组的整体消失 , 出现返祖现象 , 达不到优良基因转移的目的〔2, 6〕。已有
试验表明 , 经过一定的物理或化学方法对供体原生质体进行融合前处理 , 获得的非对称性原
生质体融合再生植株 ,在一定程度上可解决上述问题 ,但也还未能达到育种所要求的条件。本
研究通过物理方法 (紫外线 ) 与化学方法 (酶 ) 的结合 , 对供体原生质体进行融合前复合处
理 , 以实现原生质体的强不对称融合 , 并获得甘蓝与萝卜属间原生质体融合再生植株。对其
他作物原生质体融合工作或许有借鉴之处。
参　考　文　献
1　刘玉梅等 . 我国甘蓝遗传育种的研究进展和预测 . 中国蔬菜 , 1997 ( 6): 1～ 3
2　周长久等编 . 现代蔬菜育种学 . 北京: 科技文献出版社 , 1996. 49～ 65
3　 Glim eliu s K, High grow th rate and regen eration capacity of h ypocotyl protoplas t s of some Brassicaceae. Physiol Plant ,
1984, 61: 38～ 44
4　 Roes t S. and Gili ss en L. J. W. Reg eneration f rom protoplas ts a supplementary review . Acta Bot Neerl , 1993, 42: 1
～ 23
5　 Sundberg E. and Glimelius K. A meth od for p roduction of in terspecifi c h ybrids wi thin th e Brassica via somatic h ybridza-
tion using res ynth esi s of B rassica napus as a medol. Plan t Sci , 1986, 43: 155～ 162
6　 Sundberg E, Land gren M and Glim elius K. Ferti lit y and ch rom osome s tabi li ty in Brassica napus resynthesiz ed by p ro to-
plas t fusion. Th eor. Appl. Genet, 1987, 75: 96～ 104
7　 J. Dolezel , S. Lucret ti et al. Plan t ch romosom e analysis and sorting b y flow cytometry. Cri ti cal Reviews in Plan t Sciences,
1994, 13 ( 3): 275～ 309
8　 J. Dolezel. Flow cytom et ric analysis of nuclear DN A con tent in high er plants. Phytoch emical Analysi s, 1991, 2: 143～
154
(责任编辑　李正华 )
10 西　南　农　业　学　报 12卷