全 文 ：果 树 学 报 2013，30（5）: 725～731
Journal of Fruit Science
41份苹果属植物亲缘关系的 AFLP分析
李 佳 1，石琰璟 1*，沙广利 2*，黄 粤 2，马荣群 2，孙吉禄 2
（1青岛科技大学化工学院，山东青岛 266042； 2青岛市农业科学研究院，山东青岛 266100）
摘 要：【目的】探究 41 份苹果属内种质资源类型的亲缘关系，验证以往亲缘关系分类，补充传统分类学的不足。 【方
法】利用 AFLP 技术，通过 DNA 提取、酶切连接、预扩增、选择性扩增、引物选择、数据分析等，对 41 份苹果属内种质
资源类型进行亲缘关系分析。 【结果】 从 64 对引物中筛选出 11 对多态性较好的引物，11 对引物平均多态率为
86.72%。 UPGMA 聚类结果显示，41 份供试材料的遗传相似系数为 0.575 4～1.000 0，并在 0.755 处将 41 份种质分为 6
大类群，揭示了它们之间的亲缘关系，大部分种质的分类结果与传统的分类方法一致，说明该方法的准确性。 【结论】
通过此次聚类明确了部分新发现类型的分类地位归属，解释了新类型的起源，为苹果属植物种质资源的分类提供了
新的分子生物学依据。
关键词： 苹果属； 亲缘关系； AFLP
中图分类号：S661．1 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2013)05－0725－07
The genetic relationship of 41 Malus germplasm resources revealed by
AFLP analysis
LI Jia1， SHI Yan-jing1*， SHA Guang-li2*， HUANG Yue2， MA Rong-qun2， SUN Ji-lu2
（1College of Chemical Engineering， Qingdao University of Science and Technology， Qingdao，Shandong 266042 China； 2Qingdao Institute of
Agricultural Science Research， Qingdao，Shandong 266100 China）
Abstract: 【Objective】The objectives of the study were to analyze the genetic relationship of 41 Malus
germplasm resources and test the traditional classification method. 【Method】The genetic relationship of 41
accessions belonging to Malus genus were analyzed by AFLP technique. 【Result】 The amplification prod-
ucts of 11 primers pairs in 64 primer pairs showed polymorphism among the 41 species. The average poly-
morphic rate of 11 pairs of primers was 78.5%. UPGMA clustering analysis indicated that the genetic simi-
larity coefficient of the 41 Malus materials ranged from 0.575 4 to 1.000 0， the 41 species could be divid-
ed into 6 categories at coefficient value of 0.755. 【Conclusion】The classification results of most of the
species are consistent with the traditional classification method， suggesting the accuracy of the method.
And our clustering results also clarified the classification of some new identified apple species. The results
provided molecular basis for classification of Malus germplasm resources.
Key words: Malus； Genetic relationship； AFLP
苹果属（Malus Mill. ）是蔷薇科（ Rosaceae） 中经
济价值较高的一属植物，主要分布于亚洲、欧洲、和
北美洲，约为 35 种，我国就占 27 种，有 15 个特有
种，是世界上最大的苹果属起源与多样性中心 [1]。 传
统的苹果属分类依据是， 叶在芽内的状态和叶全缘
或浅裂、花柱数目和花蕊颜色、萼片脱落或宿存， 果
肉有无石细胞等植物学性状， 以及染色体、 植物化
学成分、同工酶等实验分类学证据。经过 250多年的
研究， 苹果属植物的分类系统与亲缘关系已越来越
清楚，但属内分类系统尚需进一步完善，还存在很多
问题需要更多的证据来解决[2]。
在品名记载、 分类、 命名过程中常出现同物异
收稿日期： 2013－05－02 接受日期: 2013－07－06
基金项目： 国家现代苹果产业技术体系（CARS-28）；农业公益性行业科研专项（201203075-03）；山东省农业良种产业化工程专项
作者简介： 李佳 ，女，在读硕士生，主要研究方向：植物基因工程。 Tel: 15908948047，E-mail: emmalijia2013@163.com
觹 通讯作者 Author for correspondence． Tel: 0532-87891009，E-mail: syj99@163.com； E-mail: guanglisha@126.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2013.05.024
果 树 学 报 30 卷
表 1 供试苹果资源类型
Table 1 Apple resource types used in this study
名、同名异物等现象，形态学受环境影响较大，细胞
学研究不够深入、同工酶多态性较低、所以结合分子
标记技术是至关重要的。 近几年分子标记技术如
SSR[3]、RAPD[4]、AFLP[5]等已经广泛被用于苹果亲缘
关系及遗传多样性方面的研究， 分子标记可以为
研究植物亲缘关系提供更加丰富的信息 [6]。 AFLP
（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段
长度多态性）与其他分子标记相比，分布比较均匀，
多态性水平高， 是进行植物资源研究的一种较理想
的分子标记。 王涛等[7]利用 AFLP 研究了 20 个苹果
砧木间的亲缘关系与遗传差异。Coart等[8]利用 AFLP
与 SSR 分析了原产比利时与德国的野生苹果、栽培
苹果、观赏海棠之间的亲缘关系。我们利用 AFLP技
术，将 41 份苹果属材料进行了聚类分析，揭示了其
不同类型之间的亲缘关系， 诠释及补充传统分类学
上的不足，为苹果属植物资源的开发利用提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料与采集
供试材料（表 1）于春天采自位于崂山区北宅的
青岛市农业科学研究院苹果砧木资源圃的幼嫩叶
片，-70℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA 的提取与浓度测定 41 份苹果属材料
幼嫩叶采用 CTAB 法提取 DNA，参考刘卫国等 [9]和
余英 [10]的方法并加以优化。 提取到的 DNA 用 ND-
1000紫外分光光度计测定其浓度，稀释 DNA 至 200
mg·L-1，保存于-20℃备用。
序号
Number
资源材料
Resources
学名
Scientific name
原产地
Origin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
小金海棠 3
小金海棠 2
小金海棠 1
小金海棠 4
山荆子
小金海棠 5
山荆子 2
崂山奈子
崂山海棠 2 号
崂山海棠 3 号
崂山海棠 4 号
平邑甜茶
新疆野苹果
土库曼苹果
塞威士苹果
东方苹果
道生苹果
红肉苹果
湖北海棠
锡金海棠
毛山荆子
森林苹果
丽江山荆子
西蜀海棠
扁果海棠
沧江海棠
乔劳斯基海棠
褐海棠
变叶海棠
滇池海棠
草原海棠
楸子
槟子
海棠花
多花海棠
沙金海棠
窄叶海棠
毛山荆子 2
蒙阴大果 2
蒙阴小果 1
蒙阴小果 2
Malus sp.
Malus sp.
Malus sp.
M. xiaojinensis Cheng et Jiang
M. baccata （L.） Borkh.
M.xiaojinensis Cheng et Jiang
M. baccata （L.） Borkh.
M. prunifolia Borkh
Malus sp.
Malus sp.
Malus sp.
M. hupehensis var. pinyiensis Jiang
M. sieversii (Led.) Roem.
M. turkmenorum (Juz. et. Pop.) Likh.
M. sieversii (Led.) Roem.
M. orientalis Uglitz
M. sylvestris var. praecox (Pall.) Ponom
M. sieversii f. neidzweizkyana (Dieck.) Langenf
M. hupehensis (Pamp.) Rehd.
M. sikkimensis (Wenzig.) Koehne.
M. mandshurica (Komorov.) Likh.
M. sylvstris (L.) Mill.
M. rockji （Schneid.） Rehd.
M. prattii (Hemsl.) Schneid.
M. platycarpa Rehd.
M. ombrophila Hand.-Mazz.
M. tschonoskii (Maxm.) Schneid.
M. fusca (Raf.) Schnerd.
M. toringoides (Rehd.) Hughes.
M. yunnanensis (Franch.) Schneid.
M. ioensis (Wood.) Brit.
M. prunifoiia (Willd.) Borkh.
M. asiatica var. binzi Li Y N
M. spectabilis(Ait.) Borkh.
M. f loribunda Siebold
M. sieboldii (Rehd.) Asami
M. angustifolia (Ait.) Michx.
M. baccata. subsp. mandshurica (Komorov.) Likh.
M. hupehensis Rehd
M. hupehensis Rehd
M. hupehensis Rehd
中国四川 Sichuan ，China
中国四川 Sichuan ，China
中国四川 Sichuan ，China
中国四川 Sichuan ，China
中国辽宁 Liaoning，China
中国四川 Sichuan ，China
中国内蒙古 Neimenggu，China
中国山东 Shandong，China
中国山东 Shandong，China
中国山东 Shandong，China
中国山东 Shandong，China
中国山东 Shandong，China
中国新疆 Xinjiang，China
土库鲁斯坦 Turkmenistan
中亚 Central Asia
高加索 Caucasus
南欧 South Europe
中亚 Central Asia
中国四川 Sichuan ，China
中国四川 Sichuan ，China
中国辽宁 Liaoning，China
东欧 Eastern Europe
中国四川 Sichuan ，China
中国四川 Sichuan ，China
北美 North America
中国四川 Sichuan ，China
日本 Japan
北美 North America
中国四川 Sichuan ，China
中国四川 Sichuan ，China
北美 North America
中国四川 Sichuan ，China
中国 China
中国华北 Huabei，China
中国河南 Henan， China
日本 Japan
北美 North America
中国辽宁 Liaoning，China
中国山东 Shandong，China
中国山东 Shandong，China
中国山东 Shandong，China
726
5 期 李 佳等: 41 份苹果属植物亲缘关系的 AFLP 分析
引物
Primer
有效条带总数量
Total bands
多态性带数量
Polymorphic bands
多态性比率
Percentage of polymorphic loci/％
E-ACC/M-CTT
E-ACC/M-CTG
E-AAG/M-CTG
E-ACG/M-CTG
E-ACA/M-CAG
E-AGG/M-CTG
E-ACG/M-CAG
E-ACC/M-CAT
E-ACG/M-CAT
E-AAC/M-CTT
E-AAC/M-CTG
平均 Average
40
36
25
36
39
37
30
30
26
24
24
31.55
31
29
21
31
38
34
26
26
24
21
20
27.36
77.50
80.56
84.00
86.11
97.44
91.89
86.67
86.67
92.31
87.50
83.33
86.72
表 2 AFLP 引物扩增结果
Table 2 Amplified results of AFLP primers
1.2.2 AFLP 分析 AFLP 分析参照刘淑君等[11]的方
法，选用六碱基内切酶 EcoRI 和四碱基内切酶 MseI
对基因组 DNA 进行切割，用 T4DNA 连接酶连接，酶
切和连接一步完成，PCR仪上 37℃ 4 h。连接完成的
DNA 样品稀释 10 倍后，用 Mse I-C 和 EcoR I-A 引
物对其进行预扩增；PCR 扩增程序：94 ℃ 2 min；94
℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30 个循环 ；72 ℃10
min，反应完成后稀释，-20℃保存。 将预扩增产物稀
释 10 倍后， 用 EcoR I-primer 和 Mse I-primer 进行
选择性扩增， 选择性扩增程序：94℃ 2 min；94℃ 30
s，65 ℃ （每次循环降低 0.7 ℃）30 s，72 ℃ 1 min，12
个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，24 个循
环；72℃ 10 min，完成后-20℃保存。
1.2.3 电泳分析 在选择性扩增后的 DNA 样品中
加入 5 μL Loading buffer 变性缓冲液混匀后，95 ℃
变性 5 min。取 5 μL变性混合液点样在 6%变性聚丙
烯酰胺凝胶中进行电泳，50 W 恒功率约 1.5 h，电泳
结束后采用银染方法染色[12]。 胶板干燥后记录并照
相。
1.2.4 数据分析 按照电泳图谱中同一引物不同位
置上 AFLP 条带的有无进行统计， 清晰且可重复出
现的条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”，形成
0/1 矩阵图。 利用 NTSYSpc2.1 遗传分析软件对 11
对引物条带进行分析，获得遗传相似系数，并根据遗
传相似系数 UPGMA 法对材料进行聚类分析， 并绘
制成树状图。
2 结果与分析
2.1 引物筛选
从 64对引物组合中筛选出 11对分辨能力强的
AFLP 引物组合（表 2），用于对 41 份供试苹果属植
物材料的 DNA进行扩增， 共扩增出 347 条有效带，
其中多态性带 301 条。 平均每对引物扩增出 31.55
条带，多态性条带平均为 27.36 条，多态位点百分率
达 86.72 %（表 2）。 可见，供试材料之间在 D N A 水
平上酶切位点的分布具有广泛的差异， 其遗传多样
性极为丰富。 图 1 是引物 E-ACG/M-CTG 对 4 1 份
材料的扩增结果。
2.2 聚类分析
供试材料间遗传相似系数为 0.575 4～1.000 0，
采用 UPGMA 法进行聚类分析，构建了 41 份供试材
料基因型间的亲缘关系树状图（图 2），其中遗传相
似系数最低的是小金海棠 4 和乔劳斯基海棠，2 者
的亲缘关系最远， 塞威士苹果与土库曼苹果的相似
系数最高为 1.000，2 者可能是一个类型， 或者是由
于引物少、多态性不明显，没能将 2者分开。
在遗传相似系数为 0.765 处，可将 41 份供试材
料分为 6类。
第Ⅰ类：小金海棠 3、小金海棠 2、湖北海棠、崂
山海棠 2 号、崂山海棠 3 号、崂山海棠 4 号、蒙阴小
果 1、蒙阴小果 2、平邑甜茶、蒙阴大果 2、毛山荆子、
毛山荆子 2、多花海棠、山荆子、山荆子 2、锡金海棠。
这一类除了多花海棠、小金海棠 3、小金海棠 2，其他
的都为传统的山荆子组[13]。此类在 0.800 处又可以分
为 3 个亚组 A、B、C，即湖北海棠亚组、山荆子亚组、
锡金海棠亚组，与江宁拱等 [14]对山荆子组的分类一
致。A组将蒙阴系列样本与平邑甜茶聚在一起，其中
蒙阴系列样本采自山东省蒙山北坡的蒙阴县百花
峪、凌云宫，平邑甜茶分布于蒙山南坡，本研究将蒙
阴系列的大果类型与平邑甜茶聚在一起， 说明 2 者
的亲缘关系很近，同为湖北海棠的变种，也佐证了平
邑甜茶为湖北海棠变种的说法[15]。 图 1中 622 bp 分
727

622bp
700bp
404bp
480bp
380bp
350bp
 
 

41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
图 1 E-ACG/M-CTG 引物组合 AFLP 分析
从右到左依次为 1~41 苹果资源编号 （同表 1），下同； DNA marker (PBR322DNA)
Fig. 1 The AFLP fingerprint of Primer E-ACT/M-CTG
From right to left 1 to 41 Refer to the Malus germplasm resources listed in Table 1, the same below. DNA marker (PBR322DNA)
700
622
480
404
380
350
bp
果 树 学 报 30 卷
子量处为湖北海棠组的特有的带。 崂山海棠为采自
青岛崂山上的野生类型，关于其分类与分布情况，尚
没有文献报道， 本研究将它们与蒙阴系列的小果类
型聚在一起，反映了他们之间较近的亲缘关系，为确
定崂山海棠的分类地位提供了参考。
第Ⅱ类：崂山奈子、东方苹果、道生苹果、森林苹
果、新疆野苹果、西蜀海棠、扁果海棠、土库曼苹果、
塞威士苹果、红肉苹果、丽江苹果、褐海棠、槟子、楸
子、海棠花。
这些类型大部分为传统中的苹果组， 另外还包
括了滇池海棠系的西蜀海棠、 山荆子系的丽江山荆
子[10，13]。此组又在 0.815 处分成了 D、E、F 3个亚组，D
组中含东方苹果与森林苹果 2个野生种， 其他的为
栽培种。 E组中除了褐海棠与槟子是栽培种，其他均
为苹果属野生种。 张宁等 [16]应用 AFLP 分析显示塞
威士苹果与土库曼苹果的遗传相似系数最高， 并且
与新疆野苹果亲缘关系也很近，李育农 [13]也认为塞
威士苹果与新疆野苹果有同祖的关系 。 陈景新
（1986） 把槟子列为花红与楸子的杂种。 高源等[17]也
通过 SSR 分析显示楸子与绵苹果的相似系数超过
0.9，然后又与新疆野苹果合并在一起，证实了绵苹
果起源于新疆野苹果的结论。 F组只有海棠花，说明
海棠花与其他材料相比，有自己的独特特征。
第Ⅲ类包括了小金海棠 1、小金海棠 5、变叶海
棠、沙金海棠、小金海棠 4。 同属花楸苹果组，沙金海
棠属三叶海棠系， 小金海棠、 变叶海棠属陇东海棠
系。 梁国鲁等[18]根据小孢子染色体减数分裂研究将
变叶海棠与小金海棠归于此组。 高源等 [17]也证明变
叶海棠与湖北海棠关系较近， 显示出了各个方法的
差异性。 石胜友等[19]研究表明小金海棠是变叶海棠
物种分化及陇东海棠种质渗入所形成的多倍体杂
种。 电泳图（图 1）中 700 bp 位置处有此类的特征条
带，除了这 5 份材料多花海棠也含有此条带，与 Re-
hder A 的分类一致。
第Ⅳ类：沧江海棠、滇池海棠。 同属花楸苹果组
中的滇池海棠系 （Ser. Yunnanese）[13]。 电泳图（图 1）
中 480 bp 为 2者的特征条带。
第Ⅴ类：乔劳斯基海棠。 原产日本，野生分布于
富士山下。 属多胜海棠组（Sect. Docyniopsis） ，乔劳
斯基海棠单独归为一类，取决于独特的地理分布，表
明其起源与遗传背景和其他材料有一定的差异 [13]，
其特征条带在图 1中 350 bp处。
第Ⅵ类：草原海棠、窄叶海棠，原产自北美，属绿
苹果组，此组果实为绿黄色，花药呈紫色，与其他苹
果属的黄色有明显区别[13]，2者的特征条带在图 1 中
380 bp 处。虽然褐海棠与扁果海棠也来源于北美，但
728
图 2 41 份苹果属植物亲缘关系树
图中编号同表 1
Fig. 2 Dendrogram based on AFLP data of 41 Malus germplasm resources
The code same Tabele 1
0.64 0.73 0.82 0.91 1.00
Coefficient
1
2
19
9
10
11
40
41
12
39
21
38
35
5
7
20
8
32
16
17
22
13
24
25
14
15
18
23
28
33
34
3
6
29
36
4
26
30
27
31
37
F
E
D
C
B
A
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
李 佳等: 41 份苹果属植物亲缘关系的 AFLP 分析5 期
与草原海棠和窄叶海棠分在了不同的类群中且相似
系数只有 0.600 左右，说明利用 DNA 水平进行遗传
分类可以提高准确性。
3 讨 论
本研究用 AFLP 的方法，将 41 份苹果属植物材
料分为 6大类群，揭示了它们之间的亲缘关系，分类
结果大部分与传统的分类方法一致 [13]，有些类型也
不尽相同，既说明了本方法的准确性，也为探讨某些
传统分类学未能解决的问题提供了新思路。 本研究
明确了部分新类型的分类地位归属， 为探讨部分资
源类型的起源提供了分子生物学证据。
第Ⅰ类：余英等 [10]利用 AFLP 技术进行苹果属
植物的分类中证明多花海棠具有三叶海棠的特征谱
带，并将三叶海棠系取消移入了山荆子系。Robinson
等 [20]通过 matK 和 ITS 序列研究也证明三叶海棠系
729
果 树 学 报 30 卷
与山荆子系的关系较近，而李育农 [13]根据 Rehder 的
原始分类则将三叶海棠归在了花楸苹果组中。 本研
究结果虽将多花海棠归入山荆子系， 但多花海棠也
含有花楸苹果的特征条带， 所以对于多花海棠的分
类地位还有待进一步讨论。
第Ⅱ类：西蜀海棠与丽江苹果被分到了此类中，
与以往分类不同，钱关泽等 [21]通过叶面、花柄、花柱
等形态特征指出了 2 种新变种： 光果西蜀海棠与裸
柱丽江山荆子，对此还需进一步研究。褐海棠与扁果
海棠也存在争议，余英 [10]通过 AFLP 标记对苹果属
植物进行聚类分析中也将褐海棠与扁果海棠归在了
苹果组中， 并且扁果海棠显示出了森林苹果的特征
谱带。在亚组分类中将海棠花单独分了出来，李晓磊
等 [22]通过花粉性状形态观察，聚类显示海棠花与山
荆子系亲缘关系更近一些， 此次聚类中海棠花与山
荆子系中的锡金海棠等相似系数高达 0.781，但与山
荆子系的相似系数平均值为 0.751，而与苹果系的平
均相似系数为 0.799，并在 0.800 处与苹果系其他材
料合并在了一起， 表明与山荆子组也有一定的相似
性，但与苹果组关系更近一些。对于海棠花的分类还
要结合形态学等方法进一步更准确的分析。
第Ⅲ类：5 份小金海棠材料分在了 2 个类群里，
小金海棠主要分布地区是物种分化及种质渗入十分
活跃的地带。 虽然该地区是变叶海棠多样化的分化
中心，但也有湖北海棠、垂丝海棠、三叶海棠等种类
的分布[19，23]。 小金海棠的形态特征、细胞学特征和分
子生物学特征与变叶海棠有明显的区别 [19]。 形态上
三叶海棠与湖北海棠、小金海棠、山荆子一样具有花
瓣完全开放后内卷的特征 [24]，并且小金海棠不同分
布群体也存在遗传多样性差异 [25]，小金海棠与湖北
海棠具有一定的遗传相似性。 小金海棠 1、小金海棠
2 与小金海棠 3 是在小金海棠原产地采取种子。 实
生繁殖分离出来的类型；小金海棠 4、小金海棠 5 是
作为小金海棠资源保存样本， 在原产地采取接穗通
过嫁接繁殖的。此次分类小金海棠 1，小金海棠 4、小
金海棠 5，与变叶海棠聚在一起，反映出它们之间较
近的亲缘关系，支持石胜友等[19]的研究结论。 小金海
棠 2 与小金海棠 3聚在湖北海棠类， 表明小金海棠
在长期的进化过程中， 通过其本身具有的兼性无融
合生殖特性 [13，26]，渗入了湖北海棠的遗传物质，为研
究小金海棠的起源提供了参考，也可能是采种时，误
采了湖北海棠的种子。
李晓磊等 [22]通过观察花粉形态特征，进行聚类
分析，将丽江苹果、槟子、西蜀海棠、海棠花聚在了一
组，与此次聚类结果相符；但是，他的聚类结果把森
林苹果从赛威士、新疆野苹果等组中分离了出来，然
而李育农[13]分类中森林苹果同塞威士等同属传统苹
果组。 表明单靠植物学特征说明亲缘关系是非常困
难的，需要结合遗传学、细胞学、孢粉学、分子生物学
等的结果， 进行综合分析才会更加全面透彻的了解
种质资源之间的亲缘关系 [27]，为充分利用种质资源
提供参考。
分子标记虽然在诠释植物类型之间的亲缘关系
方面具有巨大的优势，但也只是对传统分类学和进
化研究的深化和完善，并不依据此排除传统分类的
合理性和有效性，如何弥补、解释分子标记分类与
传统分类之间的差异是下一步资源分类工作的重
点[28]。
4 结 论
利用 AFLP 技术将 41 份苹果属植物分为 6 大
类，与传统分类结论基本一致，也明确了部分新发现
类型的归属，弥补了一些传统分类学上的不足，为苹
果属分类学研究提供了分子生物学依据。
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