全 文 ：中国农学通报 2012,28(16):176-179
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
苹果属(Malus Mill.)隶属蔷薇科(Rosaceae)苹果亚
科(Maloideae)，为北温带重要树种。全世界共有 40
种，中国约 25种，为重要果树或观赏树[1]，随着分子生
物学的发展国内外已对苹果属的系统发育进化、遗传
育种等开展了大量的研究[2-4]。提取基因组DNA是进
行一切分子生物学实验的前提，用来提取植物基因组
DNA的试验材料多为新鲜幼嫩叶片或硅胶干燥标本，
基金项目：国家自然科学基金项目“苹果属（蔷薇科）植物杂交起源研究”(31070619)；国家自然科学基金项目“苹果属（蔷薇科）植物分类修订”
(31170178)；山东省自然科学基金项目“中国野生苹果砧木资源遗传多样性及嫁接亲和性差异的分子机理研究”(ZR2011CM045)。
第一作者简介：丁芳兵，女，1983年出生，山东威海人，博士研究生，主要从事森林资源及植物分类研究。通信地址：210037江苏省南京市龙蟠路159
号南京林业大学09级博士班，Tel：025-85427650，E-mail：dfbi@yahoo.cn。
通讯作者：钱关泽，男，1965年出生，山东莒县人，教授，博士，主要从事种子植物分类学研究。通信地址：252059山东省聊城市聊城大学生命科学学
院109，Tel：0635-8539619，E-mail：qianguanze@lcu.edu.cn。
收稿日期：2012-02-07，修回日期：2012-05-04。
从苹果属腊叶标本中提取DNA的改良CTAB法研究
丁芳兵 1，刘连芬 2，汤庚国 1，吴瑞姣 2，钱关泽 2
（1南京林业大学森林资源与保护学院，南京 210037；2聊城大学生命科学学院，山东聊城 252059）
摘 要：为了探求从保存年代较长，并富含多糖多酚的苹果属植物腊叶标本中提取基因组DNA的方法，
在传统CTAB法的基础上加以改良，无液氮研磨材料后加入预冷CTAB free缓冲液和提高沉淀时盐浓
度，所得模板直接用于扩增nrITS区和 cpDNA matK基因。经紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳检测，结
果表明用改良方法提取的DNA在质量和产量上优于常规方法并能满足后续扩增反应的要求。该方法
不需要液氮研磨，节省了人力和成本，提前加入除杂缓冲液对去除多酚的效果良好，增加沉淀时盐的浓
度能有效去除多糖，表明改良CTAB法适合苹果属腊叶标本叶片总DNA的提取。
关键词：DNA提取；多酚；多糖；苹果属；腊叶标本
中图分类号：Q946.2 文献标志码：A 论文编号：2012-0279
DNA Extraction from Malus Leaves of Dried Specimens
Based on the Modified Methods of CTAB
Ding Fangbing1, Liu Lianfen2, Tang Gengguo1, Wu Ruijiao2, Qian Guanze2
(1College of Forest Resources and Environment, Nanjing Foresty University, Nanjing 210037;
2Life Science College of Liaocheng University, Liaocheng Shandong 252059)
Abstract: In order to find methods for total DNA extraction from Malus herbarium specimens stored for many
years and enriching polysaccharides and polyphenolics, modified CTAB methods were studied based on the
conventional methods. The DNA templates were used directly in amplifying the whole nrITS region and cpDNA
matK gene by adding precooling CTAB free buffer after treated without liquid nitrogen and improving the
concentration of NaCl when precipitating. Utraviolet spectrophotometer and agarose gel electrophoresis
methods were used to test the DNA quality. The results showed that modified CTAB methods were optimal to
produce high quality and yields DNA and amplifiable in the polymerase chain reaction (PCR). This methods
don’t need to grind with liquid nitrogen, saving manpower and reducing cost. In addition, adding CTAB freed
buffer and improved NaCl when precipitating were effective for the removement of polyphenolics and
polysaccharides. The researches indicated that the modified CTAB was suitable for extracting genomic DNA
from Malus herbarium leaves.
Key words: DNA isolation; polyphenol; polysaccharide; Malus; herbarium specimens
丁芳兵等：从苹果属腊叶标本中提取DNA的改良CTAB法研究
但在实际工作中，有时因远距离采样或时间限制，只能
从腊叶标本材料中提取DNA。苹果属是多年生木本
植物，本身含有大量的多糖、多酚等次生代谢产物，这
些物质在标本存放过程中不易被降解，仍然大量存在
于叶组织中，提取时DNA易于和多糖共沉淀并与多酚
类物质发生不可逆相互作用，降低提取的纯度；并且脱
氧核糖核酸对空气中的水分子和氧气很敏感，在长时
间的保存过程中会受到不同程度的降解和破坏[5]，不
利于进行后续的 PCR扩增。目前虽然可以采用基因
组提取试剂盒，但由于成本过高，一般不被研究大量植
物材料的科研工作人员普遍接受。
CTAB法现已广泛用于植物基因组DNA的提取，
赵海山等[6]研究了改良CTAB法对干燥方式不同的平
邑甜茶叶片DNA的提取效果，结果表明从标本干燥叶
片也能获得质量较好的DNA，但是含量不如新鲜叶片
和硅胶干燥叶片多。钟扬等[7]应用玻璃粉沉淀法对保
存多年的特殊植物材料千屈菜等的标本提取DNA并
用于PCR扩增，效果良好。目前针对苹果属腊叶干燥
标本DNA的提取尚缺少报道，笔者在研究苹果属植物
系统发育进化的过程中，通过大量试验，摸索出一种能
够从长期保存并富含次生代谢产物的标本材料中提取
DNA的方法，为后续生物学实验的开展奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本材料 选择了2007—2008年间采集的7个苹
果属标本（表1），包括湖北海棠、沧江海棠、陇东海棠、
山荆子等，取其枝条上的干燥叶片进行试验。
1.1.2 主要试剂 常规 CTAB 裂解液 [2% CTAB，
100 mmol/L，Tris.Cl (pH 8.0)，20 mmol/L EDTA (pH
8.0)，1.4 mmol/L NaCl，2% β-巯基乙醇]；CTAB free提
取 液 [0.25 mol/LNaCl，0.2 mol/L Tris.Cl (pH 8.0)，
80 mmol/L EDTA (pH 8.0)，2%~4% PVP]；改良 CTAB
裂 解 液 [2% CTAB，100 mmol/L Tris.Cl (pH 8.0)，
80 mmol/L EDTA (pH 8.0)，1.4 mmol/L NaCl，2% PVP，
2% β-巯基乙醇]；氯仿:异戊醇(24:1)；无水异丙醇；无水
乙醇；70%乙醇；3 mol/L NaCl；TE溶液 (10 mmol/L
Tris.Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)。
1.1.3 主要仪器 Eppendorf冷冻离心机；UV-2100尤尼
柯紫外分光光度计；Bio-Rad PCR扩增仪；DYY-8C型
电泳仪（北京六一仪器厂）；GIS-1000凝胶成像仪（上
海天能科技公司）；水浴锅；移液枪。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
（1）常规CTAB法。取0.1 g干燥叶片加入适量石
英砂研磨成细粉状，移至1.5 mL离心管加入800 μL热
CTAB常规裂解液（β-巯基乙醇临用之前加入），65℃水浴
60 min，期间每隔10 min上下颠倒浮板1次；5000 r/min
离心 10 min，取上清液；加入等体积氯仿异戊醇，上下
混匀成乳浊状，室温放置 10 min；10000 r/min离心
10 min；移上层水相至一新Effonder管，重复抽提1次；
取上层水相，加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混
匀后 4℃静置 30 min；12000 r/min离心 10 min，弃上清
液，70%乙醇漂洗2次，用真空干燥泵吸干管壁残余的
乙醇，室温晾干，加入适量TE缓冲液以及适量Rnase，
4℃过夜。
（2）改良CTAB法。与常规方法不同的是裂解之
前先加入 800 μL预冷的CTAB free提取液，激烈震荡
后冰浴10 min，3000 r/min离心5 min，弃上清液，立即
加入预热的CTAB改良裂解液（β-巯基乙醇临用之前
加入），65℃水浴；加异丙醇沉淀DNA时同时加入 1/5
体积5 mol/L NaCl，其余步骤相同。
1.2.2 DNA纯度检测 取 15 μL DNA稀释 20倍，在紫
外分光光度计下测定波长为260 nm和280 nm时的吸
光值，计算OD260/280比值。
1.2.3 琼脂糖电泳检测 采用 1.0%的琼脂糖凝胶进行
电泳，每个点样孔上样5 μL，溴化乙锭染色，紫外灯下
观察并根据标样判断DNA的分子量大小，最后记录结
果拍照。
1.2.4 PCR扩增 2段DNA序列 PCR扩增的总反应体
积都为 50 μL，其中包括 dNTP (0.2 mmol/L)、Mg2 +
(2 mmol/L)、Taq DNA聚合酶2.5 U，DNA模板15~30 ng，
引 物 各 20 μmol。 ITS 区 的 扩 增 使 用 引 物 P4
(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)和P5(5-GGAAG
TAAAAGTCGTAACAAGG-3)；matK基因的扩增使用
引物 matK1F(5-ACTGTATCGCACTATGTATCA-3)和
trnK2R (5-AACTAGTCGGATGGAGTAG-3)。 ITS 扩
增程序分别为96℃预变性2 min，96℃变性30 s，50℃退
火 30 s，72℃延伸 30 s，30 个循环，最后 72℃延伸
样品号
1
2
3
4
5
6
7
种名
沧江海棠M. ombrophila
湖北海棠M. hupehensis
滇池海棠M. yunnanensis
滇池海棠M. yunnanensis
湖北海棠M. hupehensis
湖北海棠M. hupehensis
山荆子M. baccata
样品来源
腊叶标本.2008.云南维西
蜡叶标本.2008.湖北神农架
腊叶标本.2008.云南中甸
腊叶标本.2008.云南中甸
腊叶标本.2007.安徽大别山
腊叶标本.2007.安徽大别山
腊叶标本.2007.山西灵宝山
表1 样品来源
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2 min。matK扩增程序为 96℃预变性 2 min，96℃变性
1 min，52.5℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环，最
后 72℃延伸 10 min。PCR扩增产物用 1.5%的琼脂糖
胶，在 l×TAE缓冲液中电泳分离。
2 结果与分析
2.1 DNA纯度和电泳检测结果
改良方法提取的DNA OD260/280比值介于1.8~2.0之
间，表示所提取的DNA纯度较高。从外观观察，采用
改良CTAB法在提取过程中未出现多酚类物质的褐
化，获得的沉淀物呈无色透明状，能迅速溶解于低盐
TE，溶液清亮。而常规CTAB法所获得的沉淀则呈现
出褐色，还混有大量胶状物。将2种方法提取的DNA
进行琼脂糖电泳，检测结果见图1。改良CTAB法获得
的DNA片段大小较一致，主带清晰，点样孔无残留，条
带后面无明显拖尾，且RNA消化较为彻底，说明多糖
等杂质去除较干净，DNA质量好，活性强，无降解。而
常规CTAB法所获得的基因组DNA在电泳中表现出
主带弥散，点样孔有荧光反应，说明杂质去除的并不彻
底且DNA有部分降解，质量不高。
2.2 PCR扩增的结果比较
图 2和图 3分别为采用常规方法和改良方法对 7
个样品的nrDNA ITS区和 cpDNA matK的PCR扩增产
物琼脂糖凝胶电泳结果，用常规方法未获得所需的目
标DNA片段或者仅能扩增出少量目的条带，而采用改
良方法扩增的 7个样品均可获得清晰的目标 DNA
条带。
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7
15000 bp
泳道1~7见表1中样品的编号。M为marker。下同
图1 2种方法提取的基因组DNA电泳图
图2 nrDNA ITS扩增结果电泳图
图3 cpDNA matK扩增结果电泳图
3 结论与讨论
本试验在提取DNA过程中没有使用液氮研磨，而
是直接加石英砂研磨腊叶干燥标本，在此之前黄东亮
等[8]在对甘蔗进行基因组DNA的提取时已报道加液氮
与否对DNA的产量和纯度没有影响，对于叶龄长的成
熟叶片，虽然加液氮更易磨碎叶片提高效率，但直接研
磨同样可以达到很好的提取效果。并且加液氮研磨过
程中容易造成材料四处飞溅，材料回温后若不迅速加
入裂解液，DNA容易与多酚物质发生糅化反应，造成
DNA降解[9]。而无液氮研磨则可不受材料回温时间影
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丁芳兵等：从苹果属腊叶标本中提取DNA的改良CTAB法研究
响，笔者在此基础上进一步加以改进，将研磨完的材料
装入离心管，低温(-20℃)冰箱保存，之后试验步骤可集
中进行，这样既可尽量避免交叉污染，又提高了工作效
率。不过低温储藏对研磨成粉末的样品是否有影响，
以及储存时间的长短还有待进一步研究。
对于酚类物质的去除以往学者往往采用向裂解液
中加入高分子螯合剂PVP（基乙烯吡咯烷酮）或PVPP
（聚乙烯聚吡咯酮）等能络合多酚和萜类物质，如杨云
等[10]、李娟玲等[11]、於朝广等[12]、赵丽华等[13]、佟兆国等[14]。
但是由于腊叶标本在提取DNA之前已经成发生部分
褐化，并且苹果属材料中还含有大量多糖等次生代谢
产物，因此仅仅采用这些方法提到的DNA质量不理
想，而且如果纯化次数太多，根本不能获得DNA，更无
从谈及完整性。在裂解细胞核之前去除细胞质中的多
酚是去除这类杂质的有效途径，在苹果属基因组DNA
的提取上陈大明等[15]仅在提取野生湖北海棠、苹果等
果树的新梢幼叶时采用此方法，而对于蜡叶标本酚类
的去除效果和可行性少见报道。经笔者验证此方法适
用于苹果属腊叶干燥标本DNA的提取，不仅提前去除
了多酚，有效抑制了氧化，还可去除一部分多糖，相对
于常规方法提取的DNA外观呈褐色，加入除杂缓冲液
后提取的DNA外观白色，干燥后透明。不足的是操作
需在冰上进行，尤其对离心之后加入裂解缓冲液这一
步骤要求尽量快速，并且因为除杂缓冲液会残留一部
分在样品组织中，加入裂解液的体积有时不好定量掌
握。本试验利用高盐高浓度异丙醇能沉淀DNA并溶
解多糖的特性沉淀苹果属植物DNA，高洪晓等[16]也认
为高盐法对人体和环境危害较小且操作简单，优于其
他除多糖的方法，适合丁香属植物DNA的提取。从电
泳图中可以看出改良CTAB法提取DNA加样孔无明
显荧光反应，表明多糖类物质去除的较彻底。此外，由
于标本材料保存多年，DNA不可避免的会有部分降
解，为了保证得到纯度较高、完整性较好的DNA，将
EDTA浓度提高到 80 mmol/L，以保护DNA不被内源
核酸酶降解 [5]。从电泳图上看条带之后没有明显拖
尾，片段长度均接近或等于 15000 bp，无弥散现象，
DNA完整性好。本试验对RNA酶的加入顺序也稍作
调整，加RNA酶4℃过夜，不仅能够彻底消化RNA，还
简化了操作步骤节省了时间，在对目的片段进行PCR
扩增时也没有不良影响。值得注意的是在 PCR问题
上虽然改良方法提取的DNA均能得到有效的扩增，但
部分常规方法提取的DNA也能够扩增出 ITS片段，而
在扩增matK片段上却无一例外地失败了，笔者认为可
能是matK片段长度较 ITS长，常规方法提取的DNA
可能已经严重降解，因此或许还能够扩增出小片段的
DNA产物，但在大片段扩增上无能为力。
综上所述，提取苹果属植物腊叶标本采用无液氮
研磨后加入预冷除酚缓冲液，同时提高裂解液中
EDTA的浓度，异丙醇沉淀时提高盐浓度，最后加RNA
酶 4℃过夜，获得的DNA完全能够满足后续实验的要
求，该改良CTAB法无需昂贵的试剂和复杂、高费用的
操作步骤，具有简便、快速、经济的特点，单人单日便可
提取DNA样品约 100份，在一般实验室中均能应用，
但是面对数量巨大的植物样品，如何进一步提高效率
尚需探究。
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