全 文 ：文章编号:1000-1573(2006)01-0038-03
部分枣属植物硅胶干燥叶片 DNA 提取方法的比较
李学营 , 　彭建营 , 　彭士琪
(河北农业大学 园艺学院 , 河北 保定 071001)
摘要:以硅胶干燥 15 d和半年的 3 种野生枣属植物叶片为试材 ,分别采用简易 CTAB 法 、高盐沉淀法和高盐低
pH 法 3 种方法提取基因组总 DNA ,通过 A260/ A280、琼脂糖凝胶电泳 、PCR扩增分析对提取的基因组 DNA 进行
了鉴定。半年内不同保存时期的材料对于 DNA提取没有明显差异;高盐沉淀法所得 DNA纯度最高。
关　键　词:枣属植物;叶片;硅胶保存;基因组 DNA;提取方法
中图分类号:S 665.1　　　　　　　　文献标识码:A
Comparison between extracting methods for genomic DNA
of dry leaf of Ziziphus Mill.saved in silica
LI Xue-ying , PENG Jian-ying , PENG Shi-qi
(College of Horticulture , Agricultural University of Hebei , Baoding 071001 , China)
Abstract:Improved CTAB , high salt precipitation , and high salt and low pH method were em-
ployed to ext ract genomic DNA from the leaves of 3 species of Ziziphus M ill.saved in silica for 15
day s and for half a year.The ex tracted DNA was tested using the value of A260/ A 280 , agarose gel
electropho resis and PCR amplif ication.The DNA from the leaves saved in silica for half a year is
good fo r PCR amplif ication and the method of high salt precipitation is best.
Key words:Ziziphus Mill.;leaves;preservation in silica;genomic DNA;ex tracting method
　　在植物提取 DNA 的研究中 ,多采用新鲜或冷
冻的材料。但对于野外 ,特别是远距离采样时受条
件的限制携带液氮或冰壶非常不方便。有研究表
明 ,用硅胶干燥保存的野外标本的叶子可用于基因
组DNA的提取[ 1 , 2] 。从枣和酸枣的新鲜材料中提
取基因组 DNA曾有过研究[ 3 , 4] ,但对于枣属植物的
其他种 ,特别是从硅胶干燥的叶片中提取 DNA ,尚
未见报道 。
枣属植物叶片中含有较多的多糖 、多酚 、单宁等
次生物质[ 3] 。本研究采用常规的简易 CTAB 法提
取枣属植物硅胶干燥叶片的 DNA 时发现 ,这些次
生物质常与核酸形成复合物 ,DNA 埋在这种粘稠的
胶状物质中难以溶解且产生不同程度的褐变 ,这种
DNA不能用于分子生物学研究。因此 ,建立一种制
备高质量 DNA的有效方法十分必要 。
1　材料和方法
1.1　材料
分别用硅胶保存 15 d和保存半年的 3种野生
枣属植物毛果枣(Ziziphas.at topensis Pierre)、蜀枣
(Z .x iangchengensis Y.L.Chen et P.K.Chou in
Bull)和褐果枣(Z .fungi i Merr)的 6个硅胶干燥幼
叶做样品 ,3种植物分别采自云南勐腊 、四川乡城和
广西百色 。保存 15 d的毛果枣 、蜀枣和褐果枣分别
用 A1 、A2 、A3表示 ,保存半年的毛果枣 、蜀枣和褐
果枣分别用 B1 、B2 、B3表示 。
收稿日期:2005-04-13
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270927);河北省自然科学基金项目(C2004000363)
作者简介:李学营(1979-), 男 ,河北南宫人 , 主要从事果树分子生物学研究.
通讯作者:彭建营(1965-), 男 ,河北大城人 , 教授 ,博士生导师 , 主要从事果树种质资源和分子生物学研究.
第 29卷第 1期
2 0 0 6年 1月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNAL OF AGRICU LT URAL UNIVERSI TY OF HEBEI
　 　 Vol.29 No.1
Jan .2 0 0 6
1.2　方法
1.2.1　总 DNA的提取　称取硅胶干燥的叶片 0.1
g ,放入研钵中 ,加入液氮迅速研磨成粉状 ,采取以下
方法提取总 DNA 。
①简易 CTAB 法。参照文献[ 3] 、[ 5]和[ 6] 略
做修改。将研磨的干粉迅速转入 1.5 mL 离心管
中 ,加入 700 μL 预热的提取液 , 充分混匀后 , 于
65℃水浴中保温 30 min ,加等体积的氯仿-异戊醇
(24∶1), 12 000 r/min , 16℃离心 10 min ,之后改用
4℃重复抽提 1次 ,取上清液加 2倍体积的-20℃预
冷的无水乙醇轻轻摇匀 , -20℃静置 1 h ,用细玻璃
棒挑出 DNA 转入另一离心管中 , 70%的乙醇洗涤
DNA沉淀 2次 ,风干后溶于 100 μL TE溶液中 , 4℃
保存备用 。
简易 CTAB法提取液:100 mmol/L Tris-HCl
(pH 8.0), 1.4 mol/ L NaCl , 20 mmol/L EDTA(pH
8.0), 2%CTAB , 2%PVP , 2%β-巯基乙醇 。
②高盐沉淀法[ 5 , 6] 。向简易 CTAB 法提取的
DNA 中加 3 mol/ L NaCl 至 NaCl 终浓度为 2.5
mol/L ,并用等体积的-20℃无水乙醇沉淀 DNA ,
轻轻摇匀后-20℃静置 1 h , 用细玻璃棒挑出 DNA
转入另一离心管中;70%的乙醇洗涤 DNA 沉淀 2
次 ,风干后溶于 100μL TE溶液中 ,4℃保存备用。
③高盐低 pH 法[ 5 , 6] 。将研磨的干粉迅速转入
1.5 mL 离心管中 ,加入 700μL 65℃预热的提取液 ,
充分混匀后 ,于 65℃水浴中保温 30 min;12 000 r/
min ,16℃离心 15 min ,取上清液加 1/3倍体积的 5
mol/L(pH =4.8)的 KAc 溶液 , 4℃放置 20 min;
12 000 r/min ,4℃离心 10 min ,取上清液加等体积
的氯仿-异戊醇(24∶1);12 000 r/min , 4℃离心 15
min ,取上清液加 2倍体积的-20℃预冷的乙醇 , 轻
轻摇匀-20℃静置 1 h , 用细玻璃棒挑出 DNA转入
另一离心管中;70%的乙醇洗涤 DNA 沉淀 3 次 ,风
干后溶于 100μL TE 溶液中 ,4℃保存备用 。
将以上所提 DNA 分别加入 3 μL RNase(去
DNase, 10 μg/μL)37℃保温 1 h ,用氯仿-异戊醇
(24∶1)抽提后用-20℃预冷的乙醇沉淀 ,将所得 DNA
溶于 50μL TE溶液中 ,存于-25℃冰箱中待用。
1.2.2　枣属植物总 DNA 的鉴定
①经上述方法提取的 DNA 经 TE 稀释 , 用
BECKMAN DU -60 型紫外分光光度计测定波长
260 nm 及 280 nm 处的光吸收值(OD 值),计算
DNA浓度 ,根据 A 260/ A280判断 DNA纯度;
②以标准分子量λDNA 和λDNA/Hind Ⅲ为对
照 ,通过 0.8%的琼脂糖凝胶电泳 ,经溴化乙锭染色
后 ,在紫外透射仪下观察并照相 ,比较 DNA 的浓
度 ,并检验 DNA 有无降解 。
③PCR 反应 引物 、Taq酶 、dN TP 均为大连宝
生物公司产品。
扩增引物为 ITS 通用引物 P1:5 -AGA ,
AGT ,CGT ,AAC ,AAG , GTT , TCC , GTA ,G -3 和
P2:5 -TCC , TCC , TCC , GCT , TAT , TGA , TAT ,
GC-3 [ 7] ,目的片段为 700 左右 , 反应体积为 50
μL ,内含 dNTP 0.2 mmol/L , Mg2+2 mmol/L ,两条
引物各 60 ng , TaqDNA 聚合酶 1.5 U 和叶片总
DNA模板量为 80 ng ,之后用双蒸水补足。反应程
序为:①94℃预变性 2 min 。 ②94℃变性 1 min ,
52℃退火 1 min , 72℃延伸 1 min;循环 35 次。 ③
72℃延伸 10 min。扩增产物经 1.4%琼脂糖凝胶电
泳 ,溴化乙锭染色后 ,在紫外透射仪下观察 、照相 。
2　结果与分析
2.1　DNA样品的纯度和产量
3种方法提取所得的 DNA溶液的 A 260/ A280均
在 1.6 ～ 1.9之间 , 说明所得 DNA 样品中基本无蛋
白质污染;不同保存时间同一材料的 A260/ A280几
乎没有差异 ,表明半年内硅胶保存的材料均可用于
DNA提取 。但 3 种方法在去除蛋白质方面的效果
仍存在一定差异 ,其中高盐低 pH 法和高盐沉淀法
比简易 CTAB法的效果要好 ,就 DNA 的产量而言 ,
简易CTAB法和高盐沉淀法均可得到大量的 DNA ,
而高盐低 pH法产量较低(表 1)。
表 1　3种提取方法所得 DNA样品的纯度和产量
Table 1　The purity and yields of DNA extracted by three methods
提取方法
Ex tracting method
A260/ A280 DNA 产量/(ng·μL-1)　Yield
A1 B1 A2 B2 A3 B3 A1 B1 A2 B2 A3 B3
简易 CTAB 法 1.66 b 1.64 b 1.63 b 1.65 b 1.77 b 1.77 b 760 a 750 a 775 a 775 a 790 a 770 a
高盐沉淀法 1.80 a 1.82 a 1.85 a 1.86 a 1.89 a 1.88 a 695 b 700 b 695 b 685 b 715 b 720 b
高盐低 pH 法 1.81 a 1.79 a 1.77 a 1.78 a 1.86 a 1.84 a 550 c 560 c 490 c 495 c 445 c 455 c
　　注:数字后不同小写字母表示 P <0.05水平差异显著.
39　第 1期　 李学营等:部分枣属植物硅胶干燥叶片 DNA提取方法的比较
2.2　琼脂糖凝胶电泳分析
从琼脂糖电泳图 (图 1)可以看出 ,3 种方法所
提取的 DNA 大小为 23 kb左右 ,完整性均较好 ,无
明显的拖尾现象 ,但是点样孔都有不同程度的发亮 ,
这说明 DNA 样品中含有未被去除的蛋白质 、多糖
及其他一些次生代谢物质 ,这些物质与 DNA 粘连
形成复合物 ,使部分 DNA 无法离开点样孔或电泳
速度较慢。3种方法比较而言 ,简易 CTAB 法点样
孔最亮 ,说明含有较多的糖类等物质 ,高盐沉淀法效
果最好 ,点样孔基本无异物 ,且浓度比高盐低 pH 法
高 ,进一步表明高盐沉淀法去除多糖和其他一些次
生代谢产物的效果很好并且 DNA 的产率也较高 。
不同保存时间同一材料的同一种提取方法的电泳图
谱没有差异 ,进一步说明了硅胶干燥保存的枣属植
物叶片在半年内并无明显变化 。
图 1　3 种枣属植物基因组 DNA电泳图
Fig.1　Agarose gel electrophorses of DNA
extracted from Ziziphus Mill.
注:M1为λDNA/HindⅢ, M 2为λDNA;
1 、2 、7 、8 、13 、14为高盐低 pH 法;3 、4、9 、10 、15 、16为高盐沉淀法;
5 、6 、11 、12 、17 、18为简易 CTAB法
2.3　ITS产物结果分析
从 PCR结果可知(图 2), 3种方法所提的 DNA
均可用于 I TS 操作 ,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观
察图谱清晰 。简易 CTAB 法所提 DNA 浓度虽高 ,
但扩增产物浓度却比其他两种方法要低 。不同保存
时间同一材料的同种方法所提 DNA的 PCR产物并
无差异。
图 2　PCR扩增产物电泳图
Fig.2　Agarose gel electrophorses of PCR products
注:M 为 100 bp DNA Ladder-1K;1-6为高盐低 pH 法;
D7-12为高盐沉淀法 、;13-18为简易 CTAB法
3　讨论
本研究采用不同保存时期的同种硅胶干燥保存
材料及 3种不同提取方法的研究表明 ,普通的简易
CTAB法不能够有效的去除枣属植物中的多糖 、酚
类及其他一些次生代谢产物 ,虽然加入了 PVP 、β-
巯基乙醇 ,但对于硅胶干燥的枣属植物材料并不理
想 ,高盐低 pH 法和高盐沉淀法较好。高盐沉淀法
无论是在 DNA质量还是 DNA 产量上都较好 ,但是
如果操作不好特别是盐浓度过高后用无水乙醇沉淀
DNA时容易晰出盐的结晶。从去除色素的角度看 ,
在提取过程中当高盐沉淀法加入 NaCl时上清液颜
色明显变浅 ,可能是 NaCl能够去除色素的缘故 。3
种方法所提的 DNA 都可用于 ITS 扩增 ,扩增产物
的浓度与 DNA质量成正比例关系。同一材料不同
硅胶干燥保存时间所提 DNA和 PCR扩增产物几乎
没有差异 ,所以用硅胶干燥保存枣属植物材料是可
行的而且极为方便 。
在许多的分子生物学实验中 ,DNA的质量非常
关键 。在本实验中作者还发现 ,为了提高 DNA 的
质量可以在适当的步骤加大离心力和延长离心时
间;利用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提可以减少酚
的残留量;同时还发现太嫩及太老的叶子都不利于
DNA的提取 ,刚刚发出的嫩叶 DNA含量高 ,但含糖
量也高 ,而成熟叶片的酚类 、色素及其他一些次生代
谢产物含量高 ,DNA产率较低(数据未给出)。
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(编辑:郭桂仙)
40　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 29卷