全 文 ：收稿日期:2008-01-12
基金项目:国家自然基金项目(30471116);教育部新世纪人才支持计划
(NECT2004-0931);国家 “十一 · 五 ”科技支撑计划(2006
BAD02B06)。
作者简介:张以忠(1977-),男 ,硕士 ,讲师 ,主要从事生物学等课程的
大学教学和荞麦科研工作。
通讯作者:陈庆富 ,教授 , E-mail:cqf1966@163.com。
荞麦属种质资源的谷草转氨酶同工酶研究
张以忠1, 2 , 　陈庆富1
(1.贵州师范大学生物技术与工程学院植物遗传育种研究所 , 　贵阳 550001;
2.毕节学院环境与生命科学系 , 　贵州 毕节 551700)
摘要:用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对荞麦属 (FagopyrumMil)8个种(含大粒组 7个种和小粒组 1个种)33份荞麦资源
的谷草转氨酶同工酶进行了研究。结果发现:谷草转氨酶同工酶酶带共 14条。不同物种的酶带为 3 ～ 5条 , 甜荞和苦荞
分别有 3带和 5条带。酶谱分析及聚类分析表明:大粒组荞麦种的酶带与 F.gracilipes等小粒组荞麦种间差异极大 , 甜
荞和苦荞酶带分别与 F.megaspartanium和 F.pilus相似 , 并分别与 F.megaspartanium和 F.pilus聚类最近 , 暗
示 F.megaspartanium和 F.pilus可能分别是甜荞和苦荞的祖先种。
关键词:　甜荞;苦荞;野荞;谷草转氨酶同工酶;系统关系;起源与进化
中图分类号:　S517　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2008)05-0039-05
StudyofGlutamateOxaloacetateTransaminaseIsozyme
onResourcesofGenusFagopyrum
ZHANGYi-zhong1, 2 , CHENQing-fu1
(1.InstituteofPlantGeneticsandBreeding, SchoolofBiologicalTechnology
andEngineering, GuizhouNormalUniversity, Guiyang550001, China;
2.DepartmentofEnvironmentandLifeScience, BijieColege, Bijie551700, China)
Abstract:Theglutamateoxaloacetatetransaminaseisozymeofthirty-threeaccessionsofcultivatedandwild
buckwheatbelongingtoeightspeciesofgenusFagopyrumincludingsevenspeciesofthebig-achenegroupand
onespeciesofthesmal-achenegroupwerestudiedbymeansofpolyacrylamidegeleletrophoresis(PAGE).
TheresultsshowedthatthereareatotaloffourteenbandsofglutamateoxaloacetatetransaminaseIsozyme, with
arangefromthreebandstofivebandsamongdiferentbuckwheatspecies.F.esculentumandF.tataricumre-
spectivelyhaveatotalofthreebandsandfivebandsamongdiferentaccessions.Theresultsofthezymograph
analysisandtheclusteringshowedthattherearemuchgreatdiferenceofzymographsbetweenthebig-achene
groupandthesmal-achenegroupandthatF.megaspartaniumandF.pilusarecloseinclusteringtreeto
F.esculentumandF.tataricum, respectively, so, wesupportChen shypothesisthatF.megaspartaniumand
F.pilusmaybetheancestorspeciesofF.esculentumandF.tataricum, respectively.
Keywords:　commonbuckwheat;tartarybuckwheat;wildbuckwheat;glutamateoxaloacetatetransaminase
Isozyme;phylogeneticrelationship;originandevolution
　　荞麦(Buckwheat)属于蓼科(Polygonaceae)荞麦属
(Fagopyrum)[ 1-5] 。有两个栽培种 ,一个是甜荞 (F.
esculentumMoench), 另一个是苦荞 [ F.tataricum
(L.)Gaertn.] [ 6] 。
早在 1913年 , Gross[ 7, 8]对中国的荞麦种进行了系
统分类 。接着 , Steward[ 7]在 1930年对亚洲的蓼科植
物进行了划分 ,列出了 10个荞麦种类(其中 1个种后
来被认为是蓼属种)。 Ye和 Guo[ 7]的分类工作证实了
Steward的种类并重新进行了划分。 Ohnishi和 Matsuo-
ka[ 8]提出了原产中国的 4个新种 。Chen[ 9, 10]发现并描
述了中国的 3个新种。因此 ,到目前为止 ,荞麦属种类
约有 15个自然物种和 1个人工合成种类[ 9, 10, 11] 。其
中 6个自然种和 1个人工合成种类属大粒组 , 即:
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研究报告　　张以忠 等:荞麦属种质资源的谷草转氨酶同工酶研究
DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2008.05.043
F.esculentum Moench、 F.tataricum (L.) Gaertn.、
F.zuogongenseQ.F.Chen、 F.megaspartaniumQ.F.
Chen、 F.pilusQ.F.Chen、 F.cymosum Meissn和
F.giganteum Krot.。 9 个 种 属 小 粒 组 , 包 括
F.gracilipes(Hemsl.)DammerexDiels、F.leptopodum
(Diels) Hedberg、 F.statice Gros、 F.capillatum
Ohnishi、 F.calianthumOhnishi、 F.gilesi(Hemsl)
Hedberg、 F.pleioramosumOhnishi、 F.lineare(Sam.)
Haraldsom和 F.urophylumGros。这两个组之间的遗
传差异很大 [ 3, 9-11] 。
目前极少有荞麦谷草转氨酶的研究报道。本研究
比较和分析了荞麦属所有大粒组种类和部分小粒组种
类的谷草转氨酶同工酶 ,以期为荞麦属种间系统关系 、
荞麦起源与演化 、荞麦遗传育种 、荞麦开发利用等研究
提供新线索和新资料 。
1　材料与方法
1.1　材　料
供试材料来源于贵州师范大学植物遗传育种研究
所 ,其种名 、编号 、倍性 、原产地等见表 1。
1.2　方　法
1.2.1　样品制备
荞麦干种子样品制备参照 Chen[ 11]的方法 ,并稍加
改动 。具体方法为:从 -24℃冰柜中取出荞麦种子 ,剥
去种皮 ,将其捣成粉末 ,并称取粉末 0.3g,加0.9ml提取
液(0.1MTris-HCl缓冲液 , pH7.5, )、0.11g聚乙烯基吡
咯烷酮和 0.3g石英砂 ,冰浴研磨至匀浆 , 4℃下 4 000r/
min离心 20min,上清液为实验样品。
1.2.2　制胶及电泳
本研究采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶技术 ,其涉及
的参数及电泳方法参照胡能书等 [ 12]及王中仁 [ 13]的方
法 ,并适当调整。分离胶浓度为 8.5%(pH8.9),浓缩
胶浓度为 5.16%(pH6.3),胶板为 (20 cm)×(12.5
cm)×(0.23cm),每槽加样约 55μl,上槽加 1滴 2%
溴酚蓝 , 4℃冰箱中进行电泳 ,起始电压 100V, 2h后
200V,待溴酚蓝指示线移至胶底 0.2 cm时 ,终止电
泳 。
1.2.3　染色及记录
谷草转氨酶同工酶的染色与固定 ,参考 Chen[ 11] 、
王中仁 [ 13]及毛盛兴等 [ 14] ,并稍加改动。具体方法为:
电泳完毕经双蒸水冲洗过的凝胶放入 100 ml0.1
mol/LpH7.5的 Tris-HCl缓冲液中浸泡 10min。倒出
缓冲液 , 加入溶液 (其配方为:17 mlpH 7.5 的
0.2mol/L天冬氨酸钠盐 、5mlpH7.5的 0.2mol/La-
酮戊二酸 、10ml0.1mol/L的硝酸钙 、 68mlpH7.5的
0.1mol/L的 Tris-HCl缓冲液和 2g聚乙烯基吡咯烷
酮),在 37℃下保温 15min。倒出溶液 ,用双蒸水冲洗
凝胶 ,加入染色液(配方为:200mg固蓝 BB盐充分溶
解在 100mlpH7.5的 0.1mol/LTris-HCl缓冲液中),
37℃下保温 ,酶带呈色满意时(约 20min),倒出染液 ,
用自来水冲洗 ,拍照后放入 7%的乙酸中保存 。
表 1　供试荞麦材料
名称 编号 种名 倍性 原 产 代 号
甜荞 ES2004102902 F.esculentum 2x 贵州黔 ES2
ES2004010201 F.esculentum 2x贵州威宁 ES3
ES2004091702 F.esculentum 2x贵州水城 ES4
ES2004091703 F.esculentum 2x贵州遵义 ES5
ES2004091701 F.esculentum 2x贵州道真 ES6
ES2003110102 F.esculentum 2x贵州绥阳 ES7
ES2004010401 F.esculentum 2x贵州兴仁 ES8
ES2004030101 F.esculentum 2x四川凉山 ES9
ES2004102901 F.esculentum 2x湖南武冈 ES10
ES2004062001 F.esculentum 2x 德国 ES11
ES2004082201 F.esculentum 2x 捷克 ES12
苦荞 TA2003120101 F.tataricum 2x贵州毕节 TA1
TA2003120103 F.tataricum 2x贵州威宁 TA3
TA2001112202 F.tataricum 2x贵州威宁 TA4
TA2004041507 F.tataricum 2x贵州威宁 TA5
TA2004041503 F.tataricum 2x贵州威宁 TA6
TA2004081103 F.tataricum 2x贵州威宁 TA7
TA2001112203 F.tataricum 2x贵州威宁 TA8
TA2004100102 F.tataricum 2x贵州水城 TA9
TA2001100501 F.tataricum 2x贵州沿河 TA10
TA2004081101 F.tataricum 2x四川九江 TA12
TA2004102902 F.tataricum 2x湖南武冈 TA14
TA2003100801 F.tataricum 2x山西大同 TA15
野苦荞 WT2003120102 F.tataricumssp.potanini 2x
四川
马尔康 WT1
野甜荞 HO2004101901 F.esc.var.homotropicum 2x 云南 HO1
金荞 CY2002062501 F.cymosum 4x 云南 CY1
佐贡野荞 ZU2003070101 F.zuogongense 4x 西藏 ZU1
巨荞麦 GI2003032001 F.giganteum 4x人工合成 GI1
大野荞 ME2003101201F.megaspartanium 2x 贵州 ME4
ME2004090101F.megaspartanium 2x 云南 ME7
毛野荞 PI2004120101 F.pilus 2x 西藏 PI1
PI2004120102 F.pilus 2x 贵州 PI2
细野荞 GR2004100701 F.gracilipes 4x 云南 GR1
1.3　数据分析方法
本研究采用系统聚类法 ,首先将各样本看成一类 ,
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第 27卷　第 5期　2008年 5月　　　　　　　　　　　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　　　Vol.27　No.5　May.　2008
图版 1　荞麦属种质资源谷草转氨酶同工酶酶图(A)及模式图(B)
　　注:黑框表示很深带 ,浅框表示深带 ,空框表示浅带。
1.甜荞谷草转氨酶同工酶酶图(1A)及模式图(1B),样品 1到 11分别是ES2, ES3, ES4, ES5, ES6, ES7, ES8, ES9, ES10, ES11, ES12。
2.(苦荞谷草转氨酶同工酶酶图(2A)及模式图(2B)。样品 1到 13分别是 TA1, TA3, TA4, TA5, TA6, TA7, TA8, TA9, TA10, TA12, TA14, TA
15, WT1。
3.荞麦谷草转氨酶同工酶酶图(3A)及模式图(3B)。样品 1到 12分别是 ES8, ES12, ZU1, GR1, CY1, HO1, GI1, ME4, ME7, PI1, PI2, WT1。
有酶带数计为 1 ,无酶带计为 0 ,使用 SPSS11.5分析
软件 ,利用欧氏距离计算样品间距离 ,用最短距离法计
算类群间距离 ,按系统聚类分析方法对其进行聚类分
析 。
2　结果与分析
8个种 33份荞麦干种子的谷草转氨酶同工酶电
泳结果见图版 1。从图版 1中共发现谷草转氨酶同工
酶谱带共 14条 。根据谱带的分布 ,可分为 2个区 。A
区(GOT1-6), B区(POD7-14)。
甜荞(ES2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12),共 3条带
(GOT-7、9、11),不同收集系间无变异。
苦荞(TA1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15)和野苦
荞(WT1),共 5条带(GOT-3、5、6、12、13),不同收集
系间无变异 。
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研究报告　　张以忠 等:荞麦属种质资源的谷草转氨酶同工酶研究
佐贡野荞(ZU1),共 3条带(GOT-7、9、11),其中
2条带(GOT-7、9)较深为主带 , 1条带(GOT-11)很浅。
野甜荞(HO1),共 3条带(GOT-7、9、11),其中 2
条带(GOT-7、9)较深为主带 , 1条带(GOT-11)很浅。
大野荞(ME4、7),共 4条带(GOT-5、7、9、11),不
同收集系间无变异。
巨荞(GI2),共 5条带(GOT-3、5、7、9、11),其中 3
条带(GOT-5、7、9)较深为主带 ,其余 2条带(GOT-3、
11)很浅 。
毛野荞(PI1、PI2),共 5条带 (GOT-3、5、6、12、
13),不同收集系间无变异。
金荞(CY1),共 4条带(GOT-5、7、10、14),其中 2
条带(GOT-7、9)很深为主带 ,其余带很浅。
细野荞(GR1),共 4条带(GOT-1、2、4、8),其中 1
条带(GOT-8)较深为主带 ,其余带很浅 。
以上 8种荞麦 ,根据酶带在 A区和 B区中的分布
情况可分为 4种类型 。
类型 Ⅰ :B区有带 GOT-12、GOT-13, A区有带
GOT-6,包括苦荞 、 F.pilus(PI1、PI2)和 F.tataricum
ssp.potanini。
类型Ⅱ:B区有带 GOT-7、9、11, A区无带或有带
GOT-3、5,包括甜荞 、F.megaspartanium(ME4、7)、F.
zuogongense(ZU1)、 F.esculentumvar.homotropicum
(HO1)、 F.giganteum(GI2)。
类型 Ⅲ:B区有带 GOT-10、GOT-14, A区有带
GOT-5,包括 F.cymosum(CY1)。
类型 Ⅳ:B区有独特带 GOT-8, A区有独特带
GOT-1、GOT-2、GOT-4,为 F.gracilipes(GR1)。
可以 看出:甜荞 、 F.zuogongense、F.esculentum
var. homotropicum、F.giganteum、F.megaspartanium
均有谱带 GOT-7、GOT-9、GOT-11 ,暗示这几种荞麦有
一定的亲缘关系。苦荞 、 F.pilus和 F.tataricumssp.
potanini均有谱带 GOT-3、 GOT-5、 GOT-6、 GOT-12、
GOT-13 ,暗示其亲缘关系很近。同时 , F.cymosum与
F.tataricumssp.potanini、苦荞 、 F.pilus均有谱带
GOT-5,暗示这些种间有一定的亲缘关系 。而 F.
gracilipes与其它荞麦无相同带 ,暗示与其它荞麦亲缘
关系较远。
运用欧氏距离 ,对上述 8种荞麦进行系统聚类 ,结
果如图 2所示。 T=7时 , 8种荞麦聚成 4个类群。类
群 1包括苦荞 、 F.pilus和 F.tataricumsp.potanini。
类群 2包括甜荞 、 F.megaspartanium、F.zuogongense、
F.esculentumvar.homotropicum和 F.giganteum。类
群 3为 F.cymosum,而类群 4为 F.gracilipes。 T=17
时 , 8种荞麦聚成 3个类群。而 T=24时 , 8种荞麦明
显分成 2个类群。类群 1包括大粒组的甜荞 、苦荞 、
F.tataricum ssp. potanini、F.megaspartanium、F.
zuogongense、F.esculentum var. homotropicum、F.
giganteum、F.pilus、F.cymosum。类群 2为小粒组的
F.gracilipes。暗示荞麦组间亲缘关系较远 。
图 2　荞麦谷草转氨酶同工酶聚类图
3　讨　论
目前国内外对荞麦谷草转氨酶同工酶的研究报道
极少 ,仅有 Chen[ 11]报道了荞麦属大粒组几个种的谷
草转氨酶同工酶 ,发现同工酶酶带在同一种不同品系
之间很少有差异 ,但是不同种间表现出明显差异。同
时 F.megaspartanium和 F.pilus的酶带分别与甜荞和
苦荞的相似 ,认为 F.megaspartanium和 F.pilus可能
分别是甜荞和苦荞的祖先种 ,但是没有对 F.gracilipes
和 F.tataricumssp.potanini荞麦种类进行报道 。本研
究首次报道了荞麦属所有大粒组种类及部分小粒组种
类的谷草转氨酶同工酶 ,结果发现 ,同工酶酶带共 14
条 ,不同荞麦种酶带 3到 5条 ,甜荞和苦荞分别均有 3
条和 5条带 ,同一荞麦种不同收集系间无变异 ,不同荞
麦种间差异较大 。另外 ,本研究还发现 ,甜荞和大野荞
均有相同酶带 GOT-7、GOT-9、GOT-11;而苦荞和毛野
荞具有相同酶带 GOT-3、GOT-5、GOT-6、GOT-13、GOT-
14 ,暗示甜荞和大野荞 ,苦荞和毛野荞之间分别有很近
的亲缘关系 。支持 Chen[ 9 -11]的结果。本研究中发现
甜荞有 3条带 ,不同于 Chen报道的甜荞只有 1条带。
其原因可能是甜荞是异花受粉作物 ,遗传是杂合的。
Chen的酶制备和电泳是当日完成 ,所得谱带可能是杂
合体的(G1G2)。本研究的酶制备液一般于冰箱中
放置 2 ～ 3d。也许是放置过程中杂合的甜荞谷草转氨
酶二聚体(G1G2)解聚后重先组合形成 3种不同的
二聚体(G1G1, G1G2, G2G2)从而表现出 3个谱
带 。对此有待进一步研究 。
(下转第 46页)
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第 27卷　第 5期　2008年 5月　　　　　　　　　　　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　　　Vol.27　No.5　May.　2008
α-淀粉酶的产生 ,从而催化淀粉分解 ,为种子萌发提供
能量和原料 。此原理是:种子在萌动过程中 ,胚释放出
来的赤霉素能够诱导糊粉层细胞中 α-淀粉酶基因的
表达 ,引起 α-淀粉酶生物合成 ,并分泌到胚乳中催化
淀粉水解为糖[ 4, 5] 。 (2)先用 HCl处理后再用 GA3处
理 ,当 GA3浓度降至 100mg/L的情况下 ,一串红种子
的发芽率不但没有下降 ,反而有明显的上升趋势(见
图 3),这主要是由于 HCl的作用使得一串红种皮的透
性增加 ,因而使 GA3能够更有效地进入种子内部发挥
其作用 。另一方面 , GA3处理可能与打破休眠的启动
有关 , 也可能是 GA3处理使贮藏早期种子的透性增加
或使某些抑制物含量降低 ,从而促进种子发芽 。
一串红为需光种子 ,用外源 GA3处理能够代替光
对种子的作用 ,显著提高一串红种子的各项萌发指标 ,
其中浓度为 500mg/L处理的效果最佳。一串红种子
在自然条件下萌发率不高 ,是由于其种皮透性差造成
的 ,用 HCl处理可使种皮透性增强 ,与 ck1相比 ,种子
的各项萌发指标明显提高了 。 HCl与 GA3协同处理 ,
种子的各项萌发指标在 GA3为 100mg/L时最高 ,与单
独使用 GA3相比 ,其使用浓度大大降低。
参考文献:
[ 1]徐本美 , 徐玉蓉.漆树种子休眠与萌发的研究 [ J] .植物生理
学通讯 , 1998, (2):42-45 .
[ 2]陶嘉龄 , 郑光华.种子活力 [ M] .北京:科学出版社 , 2004:
45.
[ 3]张韵 , 郁继华 ,钟新榕 , 等.外源 ABA和 GA
3
对 NaCl胁迫下
黄瓜种子萌发特性的影响 [ J] .甘肃农业大学学报 , 2006, 41
(2):27-30.
[ 4]李合生.植物生理生化原理和技术 [ M] .北京:高等教育出
版社 , 2000:238-239.
[ 5]高俊风.植物生理学实验技术 [ M] .西安:世界图书出版社 ,
2000:175-177.
(上接第 42页)
参考文献:
[ 1]吴征镒.西藏植物志(第一卷)[ M] .北京:科学出版社 ,
1983:604-605.
[ 2]陈庆富.五个中国荞麦 (Fagopyrum)种的核型分析 [ J] .广
西植物 , 2001, 21(2):107-110.
[ 3] ChenQing-Fu.Discussionontheoriginofcultivatedbuckwheat
ingenusFagopyrum(Polygonaceae)[ J] .AdvancesinBuck-
wheatResearch, 2001:206-213.
[ 4] WangL, LiYY, CaiGH, ZhangZ, WangZH.Prokaryoticex-
pressionandimmunologicalidentificationoftartarybuckwheat
allergenicprotein(TBa)[ J] .ChineseJournalofBiochemistry
andMolecularBiology, 2006, 22(4):308-312.
[ 5] WangJS, ChaiY, ZhaoXT, JiW Q.KaryotypeAnalysisof
ChineseBuckwheatCultivars[ J] .ActaBot.Boreal.Occident.
Sin, 2005, 25(6):1 114-1 117.
[ 6] LinRF, Zhou, YN, WangR, LiJY.Astudyontheextractof
tartarybuckwheat.I.ToxicologicalSafetyoftheExtractofTar-
taryBuckwheat[ A] .S.H.Seung, S.C.Yong, S.K.Nam, C.H.
Park(eds.), Advancesinbuckwheatresearch(Ⅰ ).Proceed-
ingsoftheeighthInternationalSymposiumonBuckwheatin
Chunchon[ C] .Korea.PublishedbytheOrganizingCommitee
oftheEighthInternationalSymposiumonBuckwheatunderthe
auspicesoftheInternationalBuckwheatResearchAssociation,
2001:602-607.
[ 7] YeNG, GuoGQ.Classification, originandevolutionofgenus
FagopyruminChina[ A] .LinR, ZhouM, TaoY, LiJ, ZhangZ
eds.Proceedingsofthe5thInternationalSymposiumonBuck-
wheat[ C] .Taiyuan.Beijing:ChineseAgriculturalPublishing
House, 1992:19-28.
[ 8] OhnishiO, MatsuokaY.Searchforthewildprogenitorofbuck-
wheatⅡ.TaxonomyofFagopyrum(Polygonaceae)species
basedonmorphology, isozymesandcpDNAvariability[ J] .
GenesandGeneticSystems, 1996, 71:383-380.
[ 9] ChenQing-Fu.AstudyofresourcesofFagopyrum(Polygo-
naceae)nativetoChina[ J] .BotanicalJournaloftheLinnean
Society, 1999, 130:53-64.
[ 10] ChenQing-Fu.HybridizationbetweenFagopyrum(Polygo-
naceae)speciesnativetoChina[ J] .BotanicalJournalofthe
LinneanSociety, 1999, 131:177-185.
[ 11] ChenQing-Fu.Astudyofisozymeandinterspecifichybridiza-
tiononbig-achenegroupofbuckwheatspecies(Fagopyrum,
Polygonaceae)[ J] .CropSciences, 2004, 44:1 511-1 518.
[ 12]胡能书 ,万贤国.同工酶技术极其应用 [ M] .长沙:湖南科
学技术出版社 , 1985:70-74.
[ 13]王中仁.植物等位酶分析 [ M] .北京:科学出版社 , 1996:96
-97.
[ 14]毛盛兴 ,向华.同工酶遗传学引论 [ M] .北京:首都师范大
学出版社 , 2000:66-67.
·46·
第 27卷　第 5期　2008年 5月　　　　　　　　　　　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　　　Vol.27　No.5　May.　2008