全 文 ：园　艺　学　报　2006, 33 (4):833 ～ 835
Ac taH or ticu ltu rae S inica
收稿日期:2005 - 06 - 25;修回日期:2005 - 09 -01
基金项目:北京市重点实验室 “果树逆境生理与分子生物学实验室 ” 资助项目;教育部优秀教师教科奖励基金资助项目
*通讯作者 Au thor for correspondence (E-mai l: rsh an@ cau. edu. cn)
苹果属小金海棠转录因子 MxMYB1基因的克隆及
其原核表达
曹冬梅 1, 2　许雪峰 1　韩振海 1*
(1中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094;2山西省农业科学院园艺研究所 , 山西太原 030031)
摘　要:M xMYB 1是苹果属小金海棠 MYB类转录因子。 MxMYB1含 1个重复序列及 MYB蛋白特有的
氨基酸组成。酶切 、 PCR扩增及测序分析表明构建的原核表达载体结构正确 , 未出现碱基突变及移码现
象。 1 mmo l /L IPTG诱导 2 h后 , 在预期的蛋白分子量 38 kD处出现 1条表达加强的蛋白条带 , 而未经诱导
的转化子没有此蛋白条带。为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础。
关键词:转录因子 M xMYB 1;原核表达;pET30a-M xMYB1
中图分类号:S 661　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2006) 04-0833-03
Identification and Prokaryotic Expression of Transcr iption FactorMxMYB1
Gene inMalus x iaojinensis
Cao Dongme i
1, 2 , Xu Xue feng1 , H an Zhenhai1*
(1 Institute of Horticultura l P lan ts, China AgriculturalUn iversity, B eijing 100094, China;2 Institute of Horticulture, Shanxi Agri-
cultura l Academy, Ta iyuan, Shanxi 030031, China)
Abstract:MxMYB 1 is aMYB transcription facto r fromMa lus x iaojinensis. M xMYB1 contains a h ighly
conserved DNA binding domain and am ino acids ex isted inMYB pro teins particula rly. Restriction endonuc le-
ase ana ly sis, PCR amplify ing and sequencing confirmed that construction w as co rrect and had no basemutan t
and drif.t SDS-PAGE of pET-MxMYB1 pro te ins induced by 1mmo l /L IPTG show ed that therew as a streng th-
ened pro tein band in expectan t38 kD prote inM arker, bu tSDS-PAGE of pET-MxMYB1 prote ins uninduced by
IPTG had not this band. These results w illmo re prov ide the foundation for purify ing and identify ing objective
pro tein.
Key words:Transc ription factorMxMYB 1;Prokaryo tic expression;pET30a-MxMYB1
1　目的 、 材料与方法
作者已经成功地克隆到了 1个缺铁诱导加强表达的苹果属小金海棠转录因子MxMYB 1, 但目前对
该基因的结构和功能还不清楚 , 为此 , 本试验对其结构进行了分析 , 且在体外进行了融合蛋白的表
达 , 这就为进一步利用融合蛋白为抗原制备抗血清提供了条件 , 进而为研究转录因子MxMYB 1的生
理功能及组织定位提供有用的蛋白探针。本试验是在 pTrip leEX-MxMYB1的阅读框两端设计了两个特
异引物 , 利用 PCR技术扩增了 906 bp片段 , 将其构入 pET-30a (+)原核表达载体 , 通过 IPTG诱导
了融合蛋白表达。所用的两个引物为 5’ 引物:5’ -ATAGAATTCATGTCGTCCGGCAC-3’ ;3’ 引物:
5’ -CCGTCGACTCAAGCGACACTG-3’ 。DNA序列由人工测序或自动测序仪测定 (华大中生和大连宝生
物 ), ORF、 MYB结构域等分析通过 DNAMAN、 SMART和 PROS ITE等软件完成。蛋白同源序列比较
在 NCB I BLAST和 G enedoc程序中进行。原核表达载体的构建见图 3, 获得的 pET30a -M xMYB1重组
质粒进行 PCR、酶切鉴定及 DNA测序分析。酶切 、连接 、 转化 、碱裂解法提纯质粒 DNA , 操作见参
园　　艺　　学　　报 33卷
考文献 〔1〕。融合蛋白的诱导表达参考 Hames等的方法 〔2〕。
2　结果分析与讨论
2.1　MxMYB1蛋白的结构分析及同源性比较
在以前的试验中利用探针杂交的方法 , 从小金海棠缺铁 cDNA文库中筛选到 1个 MxMYB 1基因
(G enBank登录号:AY196776)。对其编码蛋白的结构和氨基酸组成特点进行了分析 , 结果如下:
M xMYB1蛋白仅含有 1个 1R重复序列 , 并含有对维持 DNA结合域的疏水核起主要作用的色氨酸残基
(图 1)。MxMYB1的另一个特点是在其 C -端富含脯氨酸 , 这样的结构基序在其它的调控蛋白中也发
现 〔3, 4〕 , 可能具有转录激活功能〔5〕。此外 , 在其 C端还富含丝氨酸 , N端和 C端的丝氨酸区可能是磷
酸化位点 , 表明 M xMYB1的细胞内活性受到磷酸化调节。
图 1　各种不同来源 MYB蛋白的 1R重复序列的同源性分析
*为保守的色氨酸残基。
F ig. 1　C om parison of the am ino acid sequence w ith 1R repeat of DNA b inding dom a in from differentMYB-rela ted protein
The regu larly spaced Trp residues are labeled w ith asterisks.
2.2　小金海棠转录因子MxMYB1表达载体的构建及鉴定
利用特异引物从 pTripleEX-MxMYB1中扩增出约 900 bp左右的片段 , 与试验设计相符 (图 2)。
为 了方便质粒的构建 , PCR扩增时在引物两端引入了酶切位点EcoR I和Sal I, 同时去掉了基因 3’和
图 2　PCR扩增产物的电泳鉴定
F ig. 2　Electrophoresis o f PCR product
M:M arker;Lane 1, 2:PCR produc.t
图 4　重组表达质粒 pET30a-M xMYB1的酶切鉴定图
F ig. 4　 Identifica tion of recomb inant p lasm id
pET30a-M xMYB1 by restriction d igestion
图 3　重组表达质粒 pET30a-M xMYB1构建流程图
F ig. 3　Construction of recombinant expression
plasm id pET30a-M xMYB1
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　4期 曹冬梅等:苹果属小金海棠转录因子 M xMYB 1基因的克隆及其原核表达　
5’ 端的非翻译区 。基因的 5’端直接与原核表达
载体进行融合表达 , 因此基因 5’端与启动子之间
的距离不会对表达造成直接影响。
PCR产物回收后 , 经 EcoR I和 Sa l I双酶切 ,
以粘连的方式构入 pET-30a (+)的 EcoR I和 Sal
I位点 , 得到重组表达质粒 pET-MxMYB1 (图 3)。
对重组 pET-M xMYB1质粒的酶切分析表明
(图 4), 用 EcoR I和 Sal I双酶切 , 可切出 900 bp
左右片段 , 表明扩增的 MxMYB 1片段已插入载体
质粒中 。在此基础上 , 又进一步以重组表达质粒
pET-M xMYB1为模板 , 采用 PCR方法扩增出 900
bp左右扩增片段 (图 5), 进一步证明 pET-
M xMYB1重组质粒构建正确 。
为了进一步证明重组质粒构建正确 , 在酶切
及 PCR鉴定的基础上 , 对重组表达质粒 pET30a-
M xMYB1进行了序列测定 , 序列测定结果表明 ,
构建质粒的序列完全正确 , 未出现碱基突变及移
码现象 。
2.3　MxMYB1蛋白的原核表达
将重组质粒 pET30a-MxMYB1转化大肠杆菌
BL21, 经 IPTG诱导后提取大肠杆菌总蛋白进行
SDS -PAGE分析 。结果 (图 6)显示 , 插入有外
源片段的重组质粒 pET30a-MxMYB1经 IPTG诱导
后 , 在预计的蛋白分子量 38 kD左右有一条染色
较对照 (泳道 3 ～ 5)深的蛋白条带 。表明重组质
图 5　重组表达质粒 pET30a-M xMYB1的 PCR鉴定
F ig. 5　 Identifica tion of recombinant plasm id
pET30a-M xMYB1 by PCR
图 6　重组表达质粒 pET30a-MxMYB1表达产物的 SDS-PAGE分析
　F ig. 6　SD S-PAGE ana ly sis for the express ion
product o f pET30a-M xMYB1
Lane 1:Total proteins of inducedEcoli. transform edw ith pET-30a (+);
Lane 2:Totalp roteins ofuninducedE coli. transform ed w ith pET30a-MxMYB1;
Lane 3-5:Total proteins of inducedEcoli. transformedw ith pET30a-MxMYB1.
粒 pET-M xMYB1在大肠杆菌 BL21中诱导表达了 MxMYB1蛋白。
到目前为止 , 外源基因的原核表达仍然是大量获得目的蛋白的一条最有效途径 〔6〕 , 特别是对于
那些在组织或细胞中含量少且不易获得的蛋白 , 原核表达则是一条最佳途径。为了在体外对小金海棠
转录因子MxMYB 1的性质和功能进行研究 , 首先必须获得一定数量的 、纯度比较高的活性蛋白质 ,
因此本试验构建了原核表达载体。试验构建的 pET30a-MxMYB1结构正确 , 将构建好的重组质粒转化
到 BL21表达菌后得到了正确表达 (图 6)。在试验过程中 , 我们还发现细菌培养的条件对大肠杆菌中
H is6-M xMYB1融合蛋白的表达有一定的影响 , 同样的培养和诱导条件 , 不同批的菌种 , 最后得到的
融合蛋白的纯度是不同的 。
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