全 文 ：园　艺　学　报　2009, 36 (4):481-486
ActaHorticulturaeSinica
收稿日期:2008-12-30;修回日期:2009-03-24
基金项目:国家自然科学基金项目 (30471203);华中农业大学科研启动基金项目 (52204-06052)
＊通讯作者 Authorforcorrespondence(E-mail:zhangqinglin@mail.hzau.edu.cn)
ISTR在部分柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析中
的应用
杜晓云 1, 2 , 张梦思 1 , 罗正荣 1 , 张青林1＊
(1华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 , 武汉 430070;2山西运城学院生命科学系 , 山西运城 044000)
摘　要:利用反向序列标签重复技术 (inversesequence-taggedrepeat, ISTR), 对柿属 7个种 , 包括柿
(DiospyroskakiThunb.)、 君迁子 (D.lotusL.)、 浙江柿 (D.glaucifoliaMetc.)、 油柿 (D.oleifera
Cheng.)、 金枣柿 (D.sp.)、 老鸦柿 (D.rhombifoliaHemsl.)和美洲柿 (D.virginianaL.)共 32个基因
型进行了种质鉴定和亲缘关系研究。结果表明:ISTR可区分供试柿属植物中的 30份;ISTR能够很好地适
用于柿属植物亲缘关系分析;供试的中国与日本原产柿种质分别聚类;新发现的中国甜柿变异类型与日本
甜柿的亲缘关系较远且存在较丰富的遗传变异 , 可能是潜在的育种资源。 ISTR标记可在柿属植物种质资源
鉴定和亲缘关系分析中更广泛地应用。
关键词:柿属;亲缘关系;反向序列标签重复技术;逆转座子分子标记
中图分类号:S665.2　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X(2009)04-0481-06
IdentificationandGeneticRelationshipsofDiospyroskakiThunb.andRelatedSpeciesUsingISTRAnalysis
DUXiao-yun1, 2 , ZHANGMeng-si1 , LUOZheng-rong1 , andZHANGQing-lin1＊
(1KeyLaboratoryofHorticulturalPlantBiologyAfiliatedtoMinistryofEducation, HuazhongAgriculturalUniversity, Wuhan
430070, China;2DepartmentofLifeandScience, ShanxiYunchengUniversity, Yuncheng, Shanxi, 044000, China)
Abstract:Inversesequence-taggedrepeat(ISTR)molecularmarkerwasemployedtoinvestigategenetic
relationshipsof32 genotypesrepresentativeof7 speciesincludingDiospyroskakiThunb., D.lotusL., D.
glaucifoliaMetc., D.oleiferaCheng., Jinzaoshi(D.sp.), D.rhombifoliaHemsl.andD.virginianaL.
ISTRshowedgooddiscriminatorypowerbetweengenotypes, withexceptionofonebudmutationanditsoriginal
variety.TheclusteringresultsderivedfromISTRmoleculardatawasingoodagreementwiththepreviousstud-
iesorknowngeneticrelationshipsofsomegenotypes, indicatingthatISTRcouldbeappliedforthegenusof
Diospyros.Bothunweightedpair-groupmethodwitharithmeticaverages(UPGMA)andprincipalcoordinated
analysis(PCOA)resultsseparatedJapanesepersimmonintodiferentgroups, indicatingtheirdiferentgenetic
background.ThenewfoundseveralChinesenativePCNAvarietiesshowedabundantgeneticdiversitybasedon
ISTRanalysis, aswelaswithJapanesenativePCNAtypes, suggestingthattheymaybepotentialandprecious
breedingmaterials.Insummary, ISTRwouldbeapotentialeficienttoolforfurthergermplasmdiferentiation,
geneticdiversityassessmentandphylogeneticanalysisinDiospyros.
Keywords:DiospyrosL.;phylogeneticrelationship;inversesequence-taggedrepeat;retrotransposon
molecularmarker
反向序列标签重复技术 (inversesequence-taggedrepeat, ISTR)是一种基于逆转座子的分子标记。
ISTR标记较 AFLP等常规分子标记灵敏 (Demeyetal., 2004), 因使用的是通用引物 , 故与其它以物
DOI :10.16420/j.issn.0513-353x.2009.04.006
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种特异性引物为前提的逆转座子分子标记类型相比 , 可以免去前期逆转座子引物开发步骤 , 降低试验
成本和提高效率 。目前已在椰子 、松树 、 黑麦 、 小麦 、 油棕 、 甜菜 、马铃薯 、 番茄 (Rohde, 1996;
Castiglionietal., 1998;Heránetal., 2000)、 葡萄 (Sensietal., 1996)和柑橘 (Taoetal., 2006)
等植物的指纹分析 、 遗传连锁图谱构建和系统进化分析等研究中得到应用 。
本试验中拟探讨该标记在柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析中应用的可行性 , 以期为今后开展种
质鉴定 、遗传多样性评价和亲缘关系分析等研究提供新的研究手段;此外 , 还对中国原产完全甜柿和
日本原产完全甜柿之间遗传关系进行研究 , 可望为完全甜柿育种实践提供理论指导 。
1　材料与方法
试验于 2008年在华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室进行 。试材如表 1所示。
表 1　本试验所用材料及编号
Table1　The32 genotypesusedinthisexperiment
编号 Code 学名 Scientificname 试材Genotype 倍性 Polidylevel 脱涩类型 Astringenttype原产地 Origin
1 DiospyroskakiThunb. 富有 Fuyu 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
2 松本早生 Matsumoto-wase 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
3 上西早生 Uenishi-wase 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
4 西村早生 Nishimura-wase 2n=6x=90 PVNA 日本 Japan
5 赤柿 Akagaki 2n=6x=90 PVNA 日本 Japan
6 前川次郎 Maekawa-Jirou 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
7 次郎 Jirou 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
8 阳丰 Youhou 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
9 花御所 Hana-gosho 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
10 骏河 Suruga 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
11 晚御所 Oku-gosho 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
12 新秋 Shinsyuu 2n=6x=90 PCNA 日本 Japan
13 禅寺丸 Zenjimaru 2n=6x=90 PVNA 日本 Japan
14 平核无 Hiratanenashi 2n=9x=135 PVA 日本 Japan
15 华柿 1号 Huashi1 2n=6x=90 PVA 日本 Japan
16 雄株 9号 MaleType9 2n=6x=90 - 中国 China
17 鄂柿 1号 Eshi1 2n=6x=90 PCNA 中国 China
18 宝盖甜柿 Baogai-tianshi 2n=6x=90 PCNA 中国 China
19 小宝盖甜柿 Xiaobaogai-tianshi 2n=6x=90 PCNA 中国 China
20 四方甜柿 Sifang-tianshi 2n=6x=90 PCNA 中国 China
21 小果甜柿 Xiaoguo-tianshi 2n=6x=90 PCNA 中国 China
22 罗田甜柿 Luotian-tianshi 2n=6x=90 PCNA 中国 China
23 磨盘柿 Mopanshi 2n=6x=90 PCA 中国 China
24 铜盆柿 Tongpenshi 2n=6x=90 PCA 中国 China
25 台湾正柿 Taiwan-zhengshi 2n=6x=90 PCA 中国 China
26 沙谷 1号 Sagoksi1 2n=6x=90 PCA 韩国 Korea
27 D.glaucifoliaMetc. 浙江柿 ChekiangPersimmon 2n=2x=30 - 中国 China
28 D.lotusL. 君迁子 DatePlum 2n=2x=30 - 中国 China
29 D.rhombifoliaHemsl. 老鸦柿 DiamondLeafPersimmon 2n=4x=60 - 中国 China
30 D.oleiferaCheng. 油柿 OilyPersimmon 2n=2x=30 - 中国 China
31 D.virginianaL. 美洲柿 CommonPersimmon 2n=4x=60 - 美国 USA
32 D.sp. 金枣柿 Jinzaoshi 2n=2x=30 - 中国 China
　　注:PCNA:完全甜柿;PCA:完全涩柿;PVNA:不完全甜柿;PVA:不完全涩柿。
Note:PCNA:Polination-constantnonastringent;PCA:Polination-constantastringent;PVNA:Polination-variantnonastringent;PVA:
Polination-variantastringent.
基因组 DNA提取和质量检测参考 Doyle和 Doyle(1987)的文献 。 DNA质量及浓度检测使用
Cary-50紫外分光光度计 (美国 Varian公司), 终浓度稀释至 10 ng· μL-1 , 4 ℃保存备用 。
ISTR扩增及其产物检测参考 Rohde(1996)的方法并作优化 。引物序列参考 Aga和 Bryngelsson
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(2006)的文献 (表 2), 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 。 PCR扩增体系 (20 μL):模
板 DNA40 ng, Bufer1 ×, Mg2 +2.0 mmol· L-1 , dNTP0.25 mmol· L-1 , Taq酶 1 U, 引物 0.50
μmol· L-1 ;扩增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min;50 ℃ 1 min;72 ℃ 1.5 min, 循环 33次;72 ℃延
伸 8 min;扩增产物于 2.0%琼脂糖 (西班牙 Biowest)凝胶电泳检测 , 8 V· cm-1电压电泳 3 h。
SYNGENE凝胶成像系统观察和记录谱带 。本试验 PCR试剂均购自上海桑尼生物科技有限公司。
表 2　ISTR引物名称及其序列
Table2　PrimersusedinISTR-PCRreaction
正向引物 F-primer 序列 Sequences5′-3′ 反向引物 R-primer 序列 Sequences5′-3′
F2 AAAATGTAGTCTCTC B3 ATTCCCATCTGCACCAAT
F3 GTCGACATGCCATCTTTC B5 CTTCTGTGAAAGTCCTAG
F5 ATATATGGACTTAAGCAAGC B6 ATATATGGACTTAAGCAAGCA
F8 TTGGACAACCATATTTTGACT B7 GGAATATCATTCCCAATAAG
F9 ATATGGACTTAAGCAAGCCA B8 CCTCCTTATTGGGAATGATAT
F10 GATCAAAAAGTTTGGTTTCAT B10 GACCCTTTTGAAAACACATG
　　注:引物序列参考 Aga和 Bryngelsson(2006)的文献。
Note:ThesequencesofprimersreferedtoAga＆Bryngelsson(2006).
　　电泳条带按 1/0形式进行数据转换 , 只统计清晰 、 再现性强的条带。扩增产物按同一位点条带有
或无分别赋值 , 有带记为 “1”, 无带记为 “0”;采用 NTSYS-pcversion2.1 (Rohlf, 2000)软件计算
SM相似指数 , UPGMA(unweightedpairgroupmethodarithmeticaverages)法进行聚类 , 同时进行主坐
标分析和 Mantel检验聚类结果和相似指数矩阵之间的相关性 。
2　结果与分析
2.1　ISTR多态性分析
共筛选 36对引物 , 其中 9对引物的扩增谱带
清晰且重复性好。由表 3可见 , 9对引物的扩增总
带数为 63条 , 54条 (占 85.71%)具多态性;扩
增片段长度 100 ～ 1 500 bp;单引物对可扩增出 3 ～
12条谱带 , 平均为 7条 , 多态位点百分率 62.5% ～
100%;不同引物组合的种质鉴定能力差异较大 ,
但均未能区分 `富有 和其芽变品种 松`本早
生 , 其它 30份种质由 9对引物共同作用可以得到
很好区分。图 1为 F8/B6引物组合扩增电泳图谱。
表 3　选用 9对引物产生的谱带信息
Table3　Theinformationonbandsgeneratedby9 primerpairs
引物组合
Primerpair
总带数
Totalbands
多态性带数
Numberof
polymorphicbands
多态性百分率 /%
Percentageof
polymorphicbands
F3/B5 10 10 100
F3/B3 8 8 100
F5/B7 3 2 66.67
F10/B8 6 6 100
F9/B5 4 4 100
F9/B6 7 3 42.86
F2/B3 5 4 80
F10/B3 8 5 62.50
F8/B6 12 12 100
图 1　F8/B6引物组合对供试 32份柿属植物基因型的 ISTR扩增谱带
编号对应的基因型见表 1。
Fig.1　TheprofileofISTRamplificationusingF8/B6 primercombinationinthe32 Diospyrosspp.
LanescorrespondtotheaccessionslistedinTable1.
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2.2　基于 ISTR数据的相似指数及亲缘关系分析
由图 2可见 , 32份基因型的相似指数在 0.41 ～ 1.00之间 , 平均值 0.75。日本甜柿间的相似指数
变化范围从 0.84 (`花御所 和 晚`御所 )到 1.00 ( 富`有 和 松`本早生 ), 中国甜柿间的相
似指数变化范围为 0.65 (`鄂柿 1号 和 小`果甜柿 )到 0.89 (`四方甜柿 和 小`果甜柿 )。由
此看出中国甜柿间的差异较日本甜柿间大 。
图 2　试验材料的 ISTR分析的 UPGMA聚类图
Fig.2　Dendrogram of32 genotypesfromtheUPGMAclusteranalysisbasedonISTRdata
以 L=0.62为界可将供试 32份基因型分为两组 , 柿属近缘种单独成组 (Cluster4), 所有供试栽
培柿 (D.kakiThunb.)聚为一组。
柿组内若以 L=0.76为界可细分为两个亚组 , 台`湾正柿 、 沙`谷 1号 、 `宝盖甜柿 、 磨`盘
柿 和 鄂`柿 1号 聚为 Cluster3, 其它柿种质聚为另一亚组 。
以 L=0.88为界 , 栽培柿组的 26份基因型则可分为 3组:日本原产柿种质 (Cluster1)、 中国原
产柿种质 (Cluster2和 Cluster3);在 Cluster1中 , 富`有 、 松`本早生 (`富有 芽变)和 上`西
早生 (`松本早生 芽变)较先相聚 , 表明它们较近的亲缘关系 , 其中 富`有 和 `松本早生 未
被区分 , 上`西早生 与其芽变母本 松`本早生 表现相对较大的遗传差异; 阳`丰 (富有 ×次郎)
与其父本 `次郎 相聚 , 骏`河 (花御所 ×晚御所)与其母本 花`御所 相聚; 平`核无 为稀有
的 9倍体柿品种 , 果大且无核 , 聚类图上显示其与其它日本柿种质的遗传背景差异较大; 宝`盖甜
柿 、 小`宝盖甜柿 和 磨`盘柿 具相似的果实外观 , Cluster2和 Cluster3中 , 磨`盘柿 和 宝`盖甜
柿 聚在一起 , 与 小`宝盖甜柿 相距较远 , 表明 宝`盖甜柿 与 小`宝盖甜柿 间遗传差异较大。
将 UPGMA聚类结果转换为协表征矩阵 , 对协表征矩阵和相似系数矩阵的相关性进行 Mantel检验。
结果表明 , 两种矩阵极显著相关 , 相关系数 r=0.946, 说明聚类结果较好地体现了种质之间的遗传关
系。
2.3　基于 ISTR数据的主坐标分析
图 3为不同基因型主坐标分布图 , 反映的试材间分组及遗传关系与图 2结果相似。由图 3可见 ,
供试材料分为 3组 , Group1为柿近缘种 , Group2为中国原产柿种质 , Group3为日本原产柿种质。
第一和第二主坐标贡献率分别为 34%和 12%。
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图 3　ISTR主坐标分析散点图
Fig. 3　Diagramshowingtherelationshipsamong32 genotypesbasedonprincipalcoordinatesanalysisbyISTR
3　讨论
本研究的目的之一是探讨基于椰子 Ty1-copia逆转座子序列开发的 ISTR分子标记 (Rohde, 1996;
Aga＆Bryngelson, 2006)在柿属植物中的适用性及其进一步用于研究该属植物种间及种下亲缘关系
的可行性。试验结果表明 UPGMA聚类和主坐标分析均将供试种质分为 3个大的类群 , 近缘种与栽培
柿聚在不同的组 , 栽培柿组内中国原产柿和日本原产柿完全分开 , 与其地理起源相符 , 同罗正荣等
(1999)、 Guo和 Luo(2006)、 Guo等 (2006)、 Hu和 Luo(2006)等的研究结果一致;中国原产的
`罗田甜柿 、 磨`盘柿 和日本柿聚为不同的组 , 并与之亲缘关系较远 , 同 Kanzaki等 (2000)的
AFLP分析结果一致;几个已知亲缘关系的芽变和杂交品种都能各自很好地聚在一起 , 与实际吻合;
Choi等 (2003)、 Guo等 (2006)的研究结果表明栽培柿和君迁子的亲缘关系较近 , Nakamura等
(1994)、 Yonemori等 (1998)的研究表明老鸦柿和美洲柿是与栽培柿亲缘关系最远的种 , Nakatsuka
等 (2002)通过 Ty1-copia逆转座子 Southern杂交结果认为美洲柿与柿遗传上差异显著 , 本研究结果
佐证了上述结果 。因此 , 从本试验对部分已知亲缘关系试材间遗传关系的分析结果与已知亲缘关系对
比 , 以及同前人已有研究相互印证情况来看 , ISTR能够很好地应用于柿属种质的遗传关系研究 。
本试验 ISTR揭示的种质间多态带百分率为 85.71%, 与柿属植物中已发表的其它标记相比 , 其
多态性水平低于线粒体非编码区扩增 (92.44%, Hu＆ Luo, 2006), 近似于 IRAP和 REMAP
(86.32%, Guoetal., 2006), 强于 SRAP(80.88%, Guo＆Luo, 2006)。此外 , 因使用通用引物 ,
故较以物种特异性引物开发为前提的 IRAP和 REMAP等 (Kalendaretal., 1999)逆转座子标记的引
物成本低 , 因此 ISTR可能为今后开展柿属植物种质资源研究较经济和便捷的标记类型 。
ISTR产物可使用高浓度的琼脂糖凝胶和 PAGE凝胶两种电泳方式进行检测 , 目前报道多采用后
者 。本研究应用琼脂糖凝胶电泳检测手段获得较好结果 , 甚至可区分芽变 , 表明琼脂糖凝胶电泳检测
ISTR产物可行 , 利于简化 ISTR操作流程 , 提高试验效率。 PAGE胶电泳检测手段繁琐 , 但具分辨率
高等优点。因此 , 今后对 ISTR产物检测方式的选择还需依具体试验目的 、 分离片段大小 、 所具备的
试验条件和试材遗传背景而定 。
宝`盖甜柿 、 小`宝盖甜柿 和 鄂`柿 1号 果实个大 , 种子数少 , 色泽和口感均优;`四方甜
柿 和 小`果甜柿 抗性极强 , 这些试材均属继 罗`田甜柿 后新发现的稀有的中国原产完全甜柿
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新类型 , 但目前尚未用于育种实践 。前人以 罗`田甜柿 为试材研究表明中国完全甜柿与日本完全
甜柿可能具有不同的甜涩性状遗传规律 , 日本完全甜柿间杂交选育新品种目前已面临严重的近交退化
问题 , 而以 罗`田甜柿 作杂交亲本有望提高完全甜柿品种选育效率和增强杂种优势 (Kanzakiet
al., 2000;Ikegamietal., 2004)。本试验中从 DNA水平检测到中国原产甜柿间相似指数的变化范围
及平均相似指数均大于日本原产完全甜柿 , 表明中国甜柿可能更具丰富的遗传多样性 , 新发现的这些
中国完全甜柿新类型系具有潜在完全甜柿育种价值的甜柿资源。
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