全 文 ：530 第 56 卷 2015 年第 4 期
收稿日期:2014-11-24
基金项目:嘉兴市科技计划项目 (2013AY21047) ;十二五浙江省高校重点学科 (药理学) ;2011 年嘉兴市重点科技创新团队———天然
药物与健康食品研发技术;国家级大学生创新创业训练计划项目 (201410354021)
作者简介:董晶莱 (1992 －) ，女，本科生。E-mail:gaogcjx@ 163. com。
通信作者:李 军。E-mail:lijunjx1@ 163. com。
文献著录格式:董晶莱，高广春，黄嬛，等． DNA条形码技术在部分菱属植物分子鉴定中的应用 ［J］． 浙江农业科学，2015，56 (4) :
530 － 533，557．
DOI:10. 16178 / j. issn. 0528-9017. 20150427
DNA条形码技术在部分菱属植物分子鉴定中的应用
董晶莱1，高广春1，黄 嬛1，李 白2，李 军2*
(1. 嘉兴学院 医学院，浙江 嘉兴 314001;2. 嘉兴市农业科学研究院，浙江 嘉兴 314016)
摘 要:为了弥补形态学鉴定方法的不足，本研究利用 DNA条形码技术，选取标准基因序列对部分菱属植
物进行初步的分子鉴定。通过对浙江、江苏 2 省南湖菱、两角菱、四角菱的 ITS，matK 和 rbcL 序列扩增及多重
序列比对，探寻菱属植物的分子鉴定方法。克隆了菱属植物 692 bp的 ITS序列、878 bp的 matK序列及 685 bp的
rbcL序列，其中 matK和 rbcL 序列不存在变异位点，不能用于鉴定菱属植物;ITS 序列存在 20 个变异位点，包
括 6 处插入 /缺失和 14 处碱基置换，在部分菱属植物的分子鉴定中具有应用价值。
关键词:菱属;分子鉴定;DNA条形码
中图分类号:S567. 21 + 9 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2015)04-0530-04
菱科 (Trapaceae)菱属 (Trapa L．)植物为
一年生水生草本植物，在中国南方尤其以长江下游
太湖地区和珠江三角洲栽培最多。菱果肉含有丰富
的蛋白质、不饱和脂肪酸及多种维生素和微量元
素，菱壳具有抗食道癌、乳腺癌、子宫颈癌等药用
价值。菱属植物包含多个栽培种和野生种，栽培种
包括南湖菱 (Trapa acornis Nakano)、四角菱
(Trapa quadrispinosa Ｒoxb)、二 角 菱 (Trapa
bispinosa Ｒoxb．)及乌菱 (Trapa bicornis Osbeck)
等;野生种包括野菱 (Trapa incise var． Sieb．)、耳
菱 (Trapa potanini V． Vassil．)、冠 菱 (Trapa
litwinowii V． Vassil．)、格菱 (Trapa pseudoincisa
Nakai．)及细果野菱 (Trapa maximowiczii Korsh)
等［1 － 2］。菱属植物的分类学研究多集中在常规的形
态分类学、数量分类学、细胞分类学以及花粉形态
学等方面［3 － 8］，不同分类方法对菱属植物的聚类分
析存在一定差异。由于菱属植株的形态及果肉等营
养形态基本相同，传统的形态分类学方法在菱属植
物的鉴别上有局限性。近年来已有应用分子生物学
方法研究菱属植物亲缘关系及分子鉴别的研究报
道［1 － 2，9 － 12］，大多是利用 DNA 指纹标记对菱属植
物进行分类及系统进化研究。鉴于菱在农业及医药
领域的重要作用，及其种质混乱、鉴别方法不统一
的现状，对单一品种菱建立一套可靠的分子鉴定方
法势在必行。
DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变
异的、易扩增且相对较短的 DNA 片段，基于物种
内的特异性和物种间的多样性而创建的一种新的生
物身份识别系统，可实现对物种的快速自动鉴
定［13］，该技术已被成功应用于生物物种的分类和
鉴定等领域［2，14 － 16］。常用的 DNA 序列有 matK，
trnH-psbA，rbcL和 ITS 等，通过单一片段或多片
段组合的方式构建不同植物的 DNA 条形码
标准［17］。
matK 基因位于 trnK 基因的内含子中，约
1 500 bp，编码一种成熟酶 (matuease)。matK 序
列的变异较均一，变异中转换和颠换以及密码子 3
个位置的变异频率没有严重的偏离，增强了分子系
统树的可靠性［15］。rbcL基因编码核酮糖-1，5-二磷
酸羧化 /加氧酶的大亚基，rbcL 序列的变异主要存
在于种以上水平，物种水平上通常变异不大，其变
异位点较均匀地分布于整个基因上［17］。核糖体
DNA ITS (18S-5. 8S-26S)片段广泛分布于真核生
物和真菌中，是系统学研究中最常用的片段之一，
常用作种水平区分的片段［2］。因此，本研究以浙
江省和江苏省的栽培种南湖菱、四角菱及二角菱为
董晶莱，等:DNA条形码技术在部分菱属植物分子鉴定中的应用 531
研究材料，选取 matK，rbcL和 ITS 序列对菱属植物
进行分子鉴定，为菱属植物的鉴定提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料和试剂
试验所用材料包括浙江嘉兴的南湖菱 (T．
acornis Nakano) ，果皮绿白色，试验编号为 T1-1;
浙江温州和江苏南京的二角菱 (T． bispinosa
Ｒoxb) ，果皮暗紫色，试验编号为 T2-1 和 T2-2;
浙江嘉兴和江苏南京的四角菱 (T． quadrispinosa
Ｒoxb) ，果皮分别为水红色和绿色，试验编号分别
为 T3-1 和 T3-2。菱角种类的鉴定参照中国菱属植
物分类方法［18 － 19］。
DNA聚合酶和 dNTPs 等购于宝生物工程 (大
连)有限公司，引物和 PCＲ 产物测序委托英潍捷
基 (上海)贸易有限公司完成。
1. 2 总 DNA提取和 PCＲ扩增
总 DNA提取方法:用清水洗净菱角果实，解
剖刀快速取出菱胚，每个测试样品分别取 5 个菱胚
进行混合，用 CTAB 法提取总 DNA［20］，保存于
－ 20 ℃备用。
用于 PCＲ反应的 ITS，matK 和 rbcL 序列引物
分别:ITS-F 为 5-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，
ITS-Ｒ为 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3;matK-F
为 5-CGATCTATTCATTCAATATTTC-3，matK-Ｒ 为
5-TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3; rbcL-F 为
5-ATGTCACCACAAACAGAAAC-3， rbcL-Ｒ 为 5-
TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3。
克隆 ITS序列的 PCＲ 反应体系为 20 μL，2 ×
GC buffer I 10 μL、dNTPs (2. 5 mmol· mL －1)
0. 5 μL、上下游引物 (10 μmol·mL －1)各 0. 5 μL、
DNA模板 1 μL、Taq DNA 聚合酶 0. 2 μL、ddH2O
7. 3 μL。反应条件为 94 ℃ 预变性 3 min;然后
94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，
共 36 个循环;最后 72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。
matK和 rbcL序列的 PCＲ 反应体系为 20 μL，10 ×
PCＲ buffer 2 μL、dNTPs (2. 5 mmol·mL －1)0. 5 μL、
上下游引物 (10 μmol·mL －1)各 0. 5 μL、DNA
模板1 μL、Taq DNA聚合酶0. 2 μL、ddH2O 15. 3 μL。
反应条件为 94 ℃预变性 3 min;然后 94 ℃变性
30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 36 个循
环;最后 72 ℃延伸 5min，4 ℃保存。PCＲ 产物进
行琼脂糖凝胶电泳检测，然后割胶回收目的条带，
送英潍捷基 (上海)贸易有限公司进行回收、纯
化及测序。
1. 3 序列分析及多重比对
分别将 ITS、matK 和 rbcL 序列在 NCBI 进行
Blast分析，用 DNAMAN 软件进行多重序列比对，
然后用 MEGA 4. 1 软件构建系统发育树。
2 结果与分析
2. 1 ITS序列扩增及比对
通过 PCＲ扩增，5 个测试样品均获得了 692 bp
的 ITS序列 (图 1) ，序列分析表明 ITS 序列包含
262 bp的 ITS1 序列、166 bp 的 5. 8S rDNA 序列及
264 bp的 ITS2 序列。序列比对表明，5 个测试样
品的 ITS序列相似度达 95%以上，(G + C)含量偏
高。南湖菱 ITS 序列 (G + C)含量为 58. 96%，
(A + T)含量为 41. 04%。
图 1 菱属植物 ITS序列引物 PCＲ结果
通过 GenBank数据库检索，获得 9 个菱属植物
的 ITS序列:江苏苏州四角菱 (AY315464)、江苏
泰州四角菱 (AY315466)、江苏南通二角菱
(AY315465)、安徽芜湖二角菱 (AY315468)、江
苏南 通 乌 菱 (AY315463)、安 徽 芜 湖 乌 菱
(AY315470)、江苏南京野菱 (AY315462)、湖北
梁子湖细果野菱 (AY035757)及欧菱 (FM887019)
的 ITS序列。多重序列比对表明，ITS 序列存在 20
个变异位点 (图 2) ，其中 6 处插入 /缺失和 10 处
碱基置换位于 ITS1 序列，4 处碱基置换位于 ITS2
序列，5. 8S rDNA序列中不存在变异位点。6 处插
入 /缺失分别位于第 17，18，71，107，130 和 207 bp
处;14 处碱基置换分别为 12 bp (AG) ，15 bp
(AG) ，36 bp (AG) ，63 bp (CT) ，482 bp
(TC) ，508 bp (AG) ，606 bp (AG)的转
换和 9 bp (TG)、10 bp (CG)、11 bp (A
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C)、67 bp (TG)、134 bp (CG)、201 bp (T
G)、448 bp (TG)的颠换。本试验的 5 个测
试样品仅在第 36 bp及 67 bp处有差异 (图 2) ，浙
江温州二角菱在第 36 bp 为 “G”，其余 4 种菱均
为“A”;浙江温州二角菱和浙江嘉兴四角红菱在
第 67 bp为“G”，其余 3 种菱角为“T”。
图 2 不同种菱属植物的 ITS序列比对
2. 2 matK基因扩增及序列比对
PCＲ扩增及测序结果表明，5 个测试样品都获
得了 878 bp 的 matK 序列 (图 3) ，样品间序列相
似度为 100%。统计分析表明，菱属植物的 matK
序列 (G + C)含量偏低，为 32. 80%， (A + T)
含量为 67. 20%。GeneBank 中尚未有菱属植物的
matK基因登录，通过 Blast检索到海桑科、千屈菜
科等科属植物的 matK 基因序列与本试验克隆的
matK序列相似度达 95%以上。用 MEGA 4. 1 软件
构建 matK 序列系统发育树，结果表明，在 matK
序列涉及到的植物中，菱属植物与海桑科植物亲缘
关系最近，与千屈菜科植物次之，与桃金娘科植物
亲缘关系最远 (图 4)。
图 3 菱属植物 matK及 rbcL序列 PCＲ结果
图 4 菱属植物与其他物种的 matK序列系统进化树
2. 3 rbcL基因扩增及序列比对
5 个测试样品都获得了 685 bp 的 rbcL 序列片
段 (图 3) ，样品间序列相似度为 100%，(G + C)
含量为 41. 17%， (A + T)含量为 58. 83%。将克
隆的 rbcL序列与 GeneBank数据库中欧菱和细果野
菱的序列进行序列比对发现 (图 5) ，rbcL 序列存
在 5 个变异位点，包括 1 处插入 /缺失和 4 处碱基
置换，1 处插入 /缺失位于 10 bp 处，4 处碱基置换
包括第 109 bp 和 110 bp 处的 2 处碱基颠换，4 bp
董晶莱，等:DNA条形码技术在部分菱属植物分子鉴定中的应用 533
图 5 菱角与欧菱和细果野菱的 rbcL序列比对
和 111 bp处的 2 处碱基转换。
3 小结和讨论
自加拿大动物学家 Paul Hebert［21］于 2003 年首
次提出 DNA条形码的概念以来，该研究已成为生
物分类学研究的热点和前沿。该技术利用基因组中
一段通用的标准短序列进行物种鉴定，现已提出
10 多条植物候选 DNA 条形码序列，其中以 ITS，
matK，rbcL及 trnH-psbA的单一片段或几个片段的
组合应用较多［22］。现已在胡椒属［16］、锦葵科［15］、
忍冬科［23］、石斛属［24］、重楼属［14］等植物的系统
进化及分类鉴定中得到广泛应用，同时也在药用植
物藏药雪莲［25］、女贞子［26］、杜仲［27］等基原植物
的分子鉴定中得到应用。
本研究以南湖菱、二角菱和四角菱为研究材
料，克隆 ITS、matK 及 rbcL 序列，通过多重序列
比对，找寻菱属植物序列变异位点。在测试的 3 个
DNA条形码序列中，ITS 序列变异位点较多，有
20 个，均位于 ITS1 和 ITS2 序列，包括 6 处插入 /
缺失和 14 处碱基置换，5. 8S rDNA 序列中不存在
变异位点，这与保曙琳等［2］的研究报道一致。由
于 rDNA比 cpDNA 具有更快的进化速率，而且不
存在 cpDNA的母系单向遗传问题，所以 rDNA ITS
序列是近年来用于探讨植物种内变异和种间、近缘
属间分子系统关系的重要分子标记之一，已被广泛
应用于胡椒属、锦葵科、石斛属及重楼属等科属植
物的分子鉴定研究中［2］。据保曙琳等［2］的研究报
道，南湖菱与二角菱在 ITS 序列中的鉴别位点在
508 号碱基上，南湖菱为 “G”，二角菱为 “A”。
本研究结果表明，在第 508 号碱基上，除来源于江
苏南通的二角菱 (GenBank 登录号 AY315465)为
“A”外，包括南湖菱在内的其余菱均为 “G”，因
此，ITS序列第 508 号碱基是否能作为鉴别南湖菱
与二角菱的位点还有待进一步扩大采样地点及样本
数量来分析。测试样品中 matK 和 rbcL 序列不存在
变异位点，不能用来鉴定菱属植物。
本试验的 5 个研究材料涉及南湖菱、四角菱及
二角菱 3 个种，均为栽培种，各种之间的差异为种
内差异。ITS序列变异位点分析表明，3 个种之间
具有较高的遗传稳定性，ITS 序列在菱属植物种内
分子鉴定及系统进化分析中具有重要的应用价值。
参考文献:
［1］ 姜维梅，丁炳扬． 国产菱属植物亲缘关系的 ＲAPD 分析
［J］． 浙江大学学报:农业与生命科学版，2004，30 (2) :
191 － 196.
［2］ 保曙琳，丁小余，常俊，等． 长江中下游地区菱属植物的
DNA分子鉴别 ［J］． 中草药，2004，35 (8) :926 － 930.
［3］ Kadono Y． A preliminary study on the variation of Trapa in
Japan［J］． Acta Phytoax Geobot，1987，38:199 － 210.
［4］ 于丹． 中国东北菱属植物的研究 ［J］． 植物研究，1994，
14 (1) :40 － 47.
［5］ 胡仁勇，丁炳扬，黄涛，等． 国产菱属植物数量分类学研
究 ［J］． 浙江大学学报:农业与生命科学版，2001，27
(4) :419 － 423.
［6］ 陈家宽，周进． 湖北斧头湖浮叶水生植物群落学研究:I．
菱群落的结构 ［J］． 水生生物学报，1995，19 (1) :
40 － 48.
［7］ 丁炳扬，黄涛，姜维梅，等． 菱属植物的幼苗形态及其系
统学意义 ［J］． 浙江大学学报:自然科学版，1999，26
(3) :92 － 98.
［8］ Shalabh B， Akash J， Jasmine C． Trapa natans (Water
Chestnut) :an overview［J］． International Ｒesearch Journal of
Pharmacy，2012，3 (6) :31 － 33.
［9］ Hoque A，Anai T，Arima S． Analysis of molecular diversity in
water chestnut based on ＲAPD markers［J］． Biotechnology，
2005，4 (2) :144 － 148.
［10］ Huang Y L，Shi S H． Phylogenetics of Lythraceae sensu lato:a
preliminary analysis based on chloroplast rbcL gene，psaA-ycf3
spacer，and nuclear rDNA internal transcribed spacer (ITS)
sequences［J］． International Journal of Plant Sciences，2002，
163 (2) :215 － 225.
［11］ Graham S A，Hall J，Sytsma K，et al． Phylogenetic analysis of
the Lythraceae based on four gene regions and morphology［J］．
International Journal of Plant Sciences，2005，166 (6) :995 －
1017.
(下转第 557 页)
刘 岩，等:桑树 AKＲ2A伴侣蛋白基因的克隆及分析 557
端 (TOC34 ) 均 含 有 ABS (AKＲ2A-binding
sequence，ABS)。Zhang等［6］推测 ABS 在膜上位置
不影响 AKＲ2A 功能，AKＲ2A 与单一 ABS 结构域
蛋白结合。AKＲ2A 结合膜蛋白的 ABS，可能在组
织膜蛋白特异性受体作用下转运至指定位置。
AKＲ2A 含有 4 个 C 端的 ankyrin repeats 和一个 N
端 PEST 结构域［2］，前者是蛋白相互作用结构域，
后者是指富含 Pro，Glu，Ser 和 Thr，降解短寿命
蛋白信号域。Shen 等［4］报道 AKＲ2A 可以与 APX3
相互作用。本文克隆鉴定了桑树 AKＲ2A 基因，为
今后围绕该基因开展桑树生长发育和代谢调控研究
提供了理论基础。
本研究发现，盐胁迫后，相对于叶、茎组织而
言，AKＲ2A 基因在植物根组织中表达水平提高，
这可能与盐离子进入质膜，根细胞代谢发生变化，
需要更多的 AKＲ2A 参与调控各类胁迫响应蛋白;
而 Eugenia等［7］对胁迫条件下抗坏血酸的表达检测
研究发现，植物损伤后前 3 h 内 AKＲ2A 表达量增
加。另外，研究检测发现不同品种桑树 AKＲ2A 基
因表达水平存在较明显差异，而 AKＲ2A 又能与
APX3，Hsp17. 8 等发生相互作用，调节膜蛋白合
成转运［8］，不同桑树品种 AKＲ2A 的表达调控及其
与植物抗逆等性能的关系目前尚不清楚，尚待进一
步调控和作用机制研究。
参考文献:
［1］ Liberek K，Lewandowska A，Zietkiewicz S． Chaperones in
control of protein disaggregation ［J］． EMBO Journal，2008，
27:328 － 335．
［2］ Yan J，Wang J，Zhang H． A 14-3-3-interacting， ankyrin
repeat-containing protein plays a role in both disease resistance
and antioxidation metabolism［J］． Plant Journal，2002，29:
193 － 202．
［3］ Mullen Ｒ T，Trelease Ｒ N． The sorting signals for peroxisomal
membrane-bound ascorbate peroxidase are within its C-terminal
tail［J］． Journal of Biological Chemistry，2000，275:16337 －
16344．
［4］ Shen G X，Kuppu S，Venkataramani S，et al． ANKYＲIN
ＲEPEAT-CONTAINING PＲOTEIN 2A is an essential molecular
chaperone for peroxisomal membrane-bound ASCOＲBATE
PEＲOXIDASE3 in Arabidopsis ［J］，Plant Cell，2010，22:
811 － 831．
［5］ Abell B M，Pool M Ｒ，Schlenker O，et al． Signal recognition
particle mediates post-translational targeting in eukaryotes［J］．
EMBO Journal，2004，23:2755 － 2764．
［6］ Zhang H，Li X，Zhang Y Z，et al． Is AKＲ2A an essential
molecular chaperone for a class of membrane-bound proteins in
plants［J］． Plant Signaling ＆ Behavior，2010，5:1520 －1522．
［7］ Eugenia L，Mary S K，Cawas E，et al． Expression profiling of
ascorbic acid-related genes during tomato fruit development and
ripening and in response to stress conditions［J］． Journal of
Experimental Botany，2009，60:663 － 678．
［8］ Zhang H，Wang J，Allen Ｒ D，et al． Cloning and expression of
an Arabidopsis gene encoding a putative peroxisomal ascorbate
peroxidase［J］． Plant Molecular Biology，1997，34:967 －971．
(责任编辑:张 韵
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
)
(上接第 533 页)
［12］ Kim C，Na H Ｒ，Choi H K． Molecular genotyping of Trapa
bispinosa and T． japonica (Trapaceae)based on nuclear AP2
and chloroplast DNA trnL-F region ［J］． American Journal of
Botany，2010，97 (12) :e149 － e152.
［13］ 任保青，陈之瑞． 植物 DNA条形码技术 ［J］． 植物学报，
2010，45 (1) :1 － 12.
［14］ 朱英杰，陈士林，姚辉，等． 重楼属药用植物 DNA条形码
鉴定研究 ［J］． 药学学报，2010，45 (3) :376 － 382.
［15］ 王柯，陈科力，刘震，等． 锦葵科植物 DNA 条形码通用
序列的筛选 ［J］． 植物学报，2011，46 (3) :276 － 284.
［16］ 郝朝运，邬华松，范睿，等． 胡椒属植物 DNA 条形码初
步研究 ［J］． 热带作物学报，2013，34 (5) :870 － 874.
［17］ 高连明，刘杰，蔡杰，等． 关于植物 DNA 条形码研究技
术规范 ［J］． 植物分类与资源学报，2013，34 (6) :
592 － 606.
［18］ 颜素珠． 中国水生高等植物图说 ［M］． 北京:科学出版
社，1983，121 － 130.
［19］ 万文豪． 中国菱属植物分类研究 ［J］． 江西大学学报:自
然科学版，1984 (2) :71 － 78.
［20］ Doyle J J． A rapid DNA isolation procedure for small quantities
of fresh leaf tissue ［J］． Phytochemical Bulletin，1987，19:
11 － 15.
［21］ Hebert P D N，Ｒatnasingham S，de Waard J Ｒ． Barcoding
animal life:cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among
closely related species［J］． Proceedings of the Ｒoyal Society of
London B: Biological Sciences， 2003， 270 (Suppl 1) :
S96 － S99.
［22］ 宁淑萍，颜海飞，郝刚，等． 植物 DNA 条形码研究进展
［J］． 生物多样性，2008，16 (5) :417 － 425.
［23］ 刘震，陈科力，罗焜，等． 忍冬科药用植物 DNA 条形码
通用序列的筛选 ［J］． 中国中药杂志，2010，35 (19) :
2527 － 2532.
［24］ 黄海，李劲松，符岸军，等． 石斛属植物 DNA条形码序列
的筛选 ［J］． 热带作物学报，2010，31 (10) :1769 －1777.
［25］ 刘建全，陈之瑞，路安民． 藏药雪莲原植物水母雪莲及其
混淆种类的 ITS 序列比较和分子鉴定 ［J］． 中草药，
2001，32 (5) :443 － 445.
［26］ 李美妮，韩蕊莲，韩建萍，等． 基于 ITS2 序列的女贞子原
植物及其混伪品的分子鉴定 ［J］． 世界科学技术:中医药
现代化，2011，13 (4) :644 － 649.
［27］ 章群． 中药杜仲原植物的分子鉴定 ［J］． 生态科学，
2004，23 (2) :141 － 143．
(责任编辑:侯春晓)