全 文 ：文章编号:1001-4829(2004)02-0192-05
　　收稿日期:2003-12-03
　　基金项目:云南省农业生物技术重点实验室开放基金资助项目
作者简介:易芍文(1964-),女 ,助理研究员 ,从事果树种质资源
研究。
云南省梨属植物资源的微卫星分析研究
易芍文1 ,李进斌2 ,周小罡2 ,袁　媛1 ,胡忠荣1
(1.云南省农业科学院园艺作物研究所 ,云南 昆明　650205;2.云南省农业生物技术重点实验室 ,云南 昆明　650223)
摘　要:本研究利用在苹果(Malus×domestica Borkh.)研究中使用的 27个微卫星标记 , 对云南省农业科学院园艺作物研究所种
质资源圃中收集到的部分资源及昆明附近栽培的梨品种进行分析。结果表明这些标记可用于梨品种的研究 ,但不适于梨的野生
近缘植物石屏海棠(Malus h upehensis Rehd)、腾冲海棠(Malus sieboldii Rehd)和 子(Cotoneaster m ult i f lora Bge)的研究。由于本
试验电泳时使用的是 3 %的琼脂糖凝胶 ,所以得到的等位位点数不如用聚丙稀酰胺凝胶进行电泳的多。根据 27对微卫星引物对
42个梨品种基因组 DNA 扩增的结果 ,可以将供试的 42个梨品种分为 5群。
关键词:梨;野生近缘种;微卫星标记;云南
中图分类号:S661.2　　　文献标识码:A
Microsatellite analysis of pear(Pyrus pyrifolia)collected in Yunnan province
YI Shao-w en1 , LI Jin-bin2 , ZHOU Xiao-gang2 , YUAN Yuan1 ,HU Zhong-rong1
(1.Horticultural C rop Research Institute , Yunnan Academy of Agricultural Sciences , Kunming 650205 ,C hina;2.Agricultu ral Bio-technol-
ogy Laboratory of Yunnan Province , Kunming 650223 , China)
Abstract:Twenty seven microsatellite markers developed f rom apple , Ma lus×domest ica Borkh.were used for analysis of variet ies of pear ,
collected f rom resou rce garden of Horticultural Crop Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences and gardens around Kun-
ming.The result s show ed that markers developed f rom apple can be used for pear , Pyrus pyri fol ia analysis , but they did not w ork well on
w ild relatives Ma lus hupehensis Rehd , Malus siebold ii Rehd , and Cotoneaster mu lt if lora Bge.The alleles recorded on an agarose gel w ere
less than that recorded on a polyacrylamide gel.Fourty two varieties w ere clustered into 5 lineages at the 0.73 by UPGMA method.
Key words:pear;wi ld relatives;microsatelli te marker;Yunnan
　　梨是我国果树主要树种之一 ,栽培面积和产量
都居世界首位。同时我国又是梨的原产地之一 ,资
源十分丰富 ,世界梨属植物约有 30种 ,原产我国的
就有 13种 ,占世界总数的 43 %以上 ,全国各地均有
梨树分布和栽培 。果树资源工作者通过调查发现了
许多地方优良品种 ,这些品种目前已成为我国许多
地区生产上大量栽培的品种。仅云南已经收集到的
梨属植物资源就达 154 份 ,涉及 6个种 , 30 余个类
型 ,50多个品种和 3个梨的野生近缘属(种)。其中
文山红梨 、砚山红香酥 、巍山红雪梨 、玉香梨等品种
的皮色鲜艳夺目 ,风味浓厚 ,是优良的地方梨品种 ,
为我国十分珍贵的梨种质资源 ,不论在生产上或育
种上都具有重大的利用价值 。但是梨为多年生木本
植物 ,生命周期长 ,树体高大 ,占地广 ,遗传上高度杂
合 ,许多重要的经济性状是受多基因控制的数量性
状 ,受环境条件的影响较大 ,常规方法评价的周期
长 ,所以现阶段我国对梨种质资源的研究评价还仅
停留在性状鉴定和细胞学水平上[ 1] 。
随着农业产业结构的调整 ,对优良梨品种的苗
木需求正呈不断上升的趋势 。利用云南省珍贵的梨
资源 ,培育有特色的 ,适合本地发展的梨树新品种是
发展云南省水果生产的必由之路 。利用分子标记对
包括野生近缘属在内的梨种质资源进行遗传多样性
研究 ,有利于在较深层次上对这些梨属资源进行评
价 ,为更好地利用这些资源提供依据 。还可利用分
子标记对现有的梨栽培品种建立分子指纹 ,进行分
子鉴别。以便用于优良苗木的鉴别 ,为优良品种的
引进和布局 ,假伪苗木的早期识别提供可信的方
法[ 1～ 2] 。
192
西　南　农　业　学　报
Sou thw est China Journal of Agricultural S ciences
　　　　　　　　　　　　　　2004年 17卷 2期
Vol.17　　No.2
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2004.02.015
近年来发展起来的分子标记技术特别是 AFLP
(扩增片段长度多态性)和 SSR(微卫星标记)技术为
梨品种的鉴定和分类开辟了广阔前景[ 2 ～ 3] 。AFLP
(Amplified Fragment Length Polymo rphism ,扩增片
段长度多态性),兼有 RAPD与 RFLP 的特点 ,所以
AFLP 分析得到的基因组信息比前两者多 。SSR则
有稳定性强 ,重复性好 ,自动化程度高 ,标记呈显性
或共显性 ,对 DNA 的数量和质量要求较低 ,并且可
以通过控制引物的数目和种类来选择不同的 DNA
片段以及扩增的 DNA片段的数目[ 4 ～ 6] 。这些遗传
标记可用于遗传分析的各个方面 ,如演化分类 ,系统
发育[ 6] ,品种鉴别 ,遗传图谱构建及目标基因的定
位[ 2]等各项研究中 ,在实际应用中有着非常好的前
景。但迄今在梨属植物上的研究还不多见[ 7] 。
已有研究证明 ,SSR引物不仅在同一属内的不
同种间能扩增重复序列 ,而且在同一科不同属的物
种甚至是不同科之间也能扩增出重复序列。所以随
着相关物种的 SSR分子标记的建立及比较基因组
学的发展 ,利用近缘物种的 SSR标记来进行研究是
一条可行的途径 ,如国外利用 SSR标记在苹果上已
经有大量的研究 ,包括品种识别 、图谱制作都已经做
过研究 ,而直接利用已发表的苹果 SSR的位点引物
序列来进行梨属植物的 SSR标记研究也已被证明
是十分有效的方法[ 8 ～ 9] 。Yamamoto[ 7]等就利用苹
果的 SSR标记对以日本梨为主的 36个栽培品种进
行了品种鉴定研究。结果表明除突变体以外的品种
全部可以在检测到的 79个等位基因位点上相互区
别开来。所以本研究又从 Gianfranceschi等[ 9]分析
苹果品种的研究中引入了 15对引物 ,也取得了较好
效果。
1　材料与方法
1.1　试验材料
本试验使用的试验材料如表 1所示 ,包括 42个
梨品种 , 2个苹果品种 , 3份海棠材料和 1 份 子材
料 。其中红梨 35号 、红梨 32号 、95-2 、YH1 、YH2 、
YH3为云南省农科院品种资源站红梨课题组惠赠。
苹果材料是作为对照检测微卫星引物及扩增程序
的 。
1.2　DNA抽提
利用简化的 DNA抽提方法 ,共抽提了 42个不
同梨品种 、2 个苹果品种 、3个海棠 ,及 1 个 子的
DNA(表 1)。通过电泳检测浓度后 ,稀释成 2 ng/μl
的浓度备用 。
1.3　引物设计及合成
本研究共设计引物 27对(如表 2所示),由赛百
盛基因技术有限公司(北京)合成 。表 2 中前面 12
对引物是 Yamamo to(2000)证实可以用于梨品种的
SSR引物 。后面的 15 对是本研究根据 Gian-
f ranceschi等(1998)分析苹果品种时使用的 SSR引
物直接合成后进行试验 。
1.4　PCR扩增
PCR扩增的总体积为 20 μl , 每个反应使用
10ng基因组DNA 。反应混合液组成为:1×PCR缓冲液
表 1　本研究供试的植物材料
Table 1　Varieties of pear , apple and w ild relatives of pear
编号
No.
供试品种
Variety
编号
No.
供试品种
Variety
编号
No.
供试品种
Variety
编号
No.
供试品种
Variety
y1 金帅苹果 y20 幸水 y44 玉香梨 y62 83-74
y2 富士苹果 y22 水晶 y45 巍山红雪梨(园艺所种植) y63 83-76
y3 腾冲海棠 y23 日本黄梨 y48 红利 35号 y65 83-78(滇)
y6 石屏海棠(红花) y30 文山红雪梨 y49 红利 32号 y66 83-79
y7 石屏海棠(白花) y31 红叶梨 y50 95-2 y68 A-55
y10 杜梨 y33 鲁沙梨 y51 YH1 y69 子
y11 早美酥 y34 黄花梨 y52 YH2
y12 鸭梨 y35 富源黄梨 y53 YH3
y13 冀密 y36 宝珠梨 y54 红香酥
y14 茌梨 y37 巍山红雪梨(团结乡种植) y56 83-15-1
y15 慈梨 y38 火把梨 y57 83-15-2
y16 早酥 y39 白香酥 y58 83-16
y18 丰水 y40 胭脂梨 y59 83-20
y19 新水 y41 酸梨 y61 83-67
1932期 易芍文等:云南省梨属植物资源的微卫星分析研究
表 2　本试验使用的 SSR 引物 、基序及来源
Table 2　Primer sequences, mot ifs and p redicted products size of SSR
标记
M arker
引物序列(正向 , 5 -
3 )
Primer sequence(For-
w ard , 5-3)
引物序列(反向 , 5 -
3 )
Primer sequence(Re-
verse , 5-3)
基序
Moti f
重复次数
Repeat number
推测产物大小
Predicted product
length(bp)
参考文献
Reference
01a6
AGG ATT GCT GGA
AAA GGA GG
TTA GAC GAC GCT
ACT TGT CCT
GA 21 136 Yamamoto et al.2000
01d12
CGG ACT ATA ATC
AAC CTG AAA GT
CGG TTT AAC ATG
ACA TCA CAA
GA 19 126 Yamamoto et al.2000
01d7
T TC CAT CCT TCT
CCC TTC
CAC CTA CTC TCC
ACC ACA
GA 18 117 Yamamoto et al.2000
02b1
CCG TGA TGA CAA
AGT GCA TGA
ATG AGT TTG ATG
CCC T TG GA
GA 14 238 Yamamoto et al.2000
04f3-2 CAA AAC CAC CCT
CAT CCT CGA A
CCC CAA GCA GAC
CTG AAG AAA
GA 14 111 Yamamoto et al.2000
04h11
CT T CCA TCG AGA
T TG CAT CAT A
CGA ATT GAG AGG
TCG TCG TT
GA 23 225 Yamamoto et al.2000
05g8
CGG CCA TCG AT T
ATC TTA CTC T T
GGA TCA ATG CAC
TGA AAT AAA CG
GA 18 121 Yamamoto et al.2000
17e6
AAC ACG CCA TCA
CAC ATC
CTG T TT GCT AGA
AGA GAA GTC
GA 21 109 Yamamoto et al.2000
22c6
GAC CT T TCC CTC
TCC TGA
CTG GAT ATG ATT
AT T GCA GA
GA 12 111 Yamamoto et al.2000
23g4
T TT CTC TCT CT T
TCC CAA CTC
AGC CGC CTT GCA
TTA AAT AC
GA 19 88 Yamamoto et al.2000
26c6
GAC GAA GAA CTC
GCC GGA GC
CGA GGA CCA ACC
CAC ACA CAA
GA 10 136 Yamamoto et al.2000
28f4
TGC CTC CCT TAT
ATA GCT AC
TGA GGA CGG TGA
GAT TTG
GA 18 112 Yamamoto et al.2000
CH01B12
CGC ATG CTG ACA
TGT TGA AT
CGG TGA GCC CTC
TTA TG T GA
AG 20 123～ 130 Gianf ranceschi et al.1998
CH01E01
GGT TGG AGG GAC
CAA TCA TT
CCC ACT CTC TGT
GCC AGA TC
GT.A.AG 12.1.32 104～ 138 Gianf ranceschi et al.1998
CH01E12
AAA CTG AAG CCA
TGA GGG C
TTC CAA T TC ACA
TGA GGC TG
AG 32 243～ 248 Gianf ranceschi et al.1998
CH01F02
ACC ACA TTA GAG
CAG TTG AGG
CTG GTT TGT TTT
CCT CCA GC
AG 22 168～ 222 Gianf ranceschi et al.1998
CH01F09
ATG TAC ATC AAA
GTG TGG ATT G
GGC GCT T TC CAA
CAC ATC
AG 22 112～ 139 Gianf ranceschi et al.1998
CH01G12
CCC ACC AAT CAA
AAA TCA CC
TGA AGT ATG
GTG GTG CGT TC
AG 4.5 107～ 186 Gianf ranceschi et al.1998
CH01H01
GAA AGA CTT GCA
GTG GGA GC
GGA GTG GGT
TTG AGA AGG TT
AG 25.5 107～ 141 Gianf ranceschi et al.1998
CH01H10
TGC AAA GAT AGG
TAG ATA TAT GCC
A
AGG AGG GAT
TGT TTG TGC AC
AG 21 93～ 119 Gianf ranceschi et al.1998
CH02B03B
ATA AGG ATA CAA
AAA CCC TAC ACA
G
GAC ATG TTT GGT
TGA AAA CTT G
GA 22 77～ 109 Gianf ranceschi et al.1998
CH02B10
CAA GGA AAT CAT
CAA AGA TTC AAG
CAA GTG GCT TCG
GAT AGT TG
GA 19.5 114～ 157 Gianf ranceschi et al.1998
CH02C06
TGA CGA AAT CCA
CTA CTA ATG CA
GAT TGC GCG CTT
TT T AAC AT
GA 21 216～ 254 Gianf ranceschi et al.1998
CH02D11
AGC GTC CAG AGC
AAC AGC
AAC AAA AGC AGA
TCC GT T GC
AG 21 117～ 146 Gianf ranceschi et al.1918
CH02D12
AAC CAG ATT TGC
T TG CCA TC
GCT GGT GGT AAA
CGT GGT G
GA 19 138～ 157 Gianf ranceschi et al.1998
CH02F06
CCC TCT TCA GAC
CTG CAT ATG
ACT GTT TCC AAG
CGA TCA GG
TG-AG 10 , 20 138～ 157 Gianf ranceschi et al.1998
COL a
AGG AGA AAG
GCG TT T ACC TG
GAC TCA T TC TTC
GTC GTC ACT
GA 17.5 213～ 239 Gianf ranceschi et al.1998
194 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　17卷
(20 mM Tris/HCl , pH8.4 , 50 mM KCl), 0.1 mM
dNTP 混合物 , 0.5 μM 引物(包括正向和反向引
物),1.5 mM MgCl2 , 1U of Taq 多聚酶。PCR反应
共30个循环 ,每一循环分别是 94 ℃变性30 s ,55 ℃
退火 30 s ,72 ℃延伸 60 s。循环前的变性条件为 94
℃5 min ,反应最后的延伸时间为 7 min 。
1.5　电泳
电泳使用 3 %的琼脂糖凝胶。EB染色后 ,在紫
外光下拍照 ,记录试验结果。
2　结果与分析
2.1　试验所用的反应体系
供试的 27对微卫星引物在苹果金帅和富士两
个品种上都扩增出了与文献报道的大小一致的片
断 ,说明本试验所用的反应体系是正确的。但以 3
份海棠材料和 1份 子材料的 DNA 为模板的材料
中 ,只有 3对引物得到了扩增结果 ,片断大小与苹
果 、梨的结果也相似 。说明本试验使用的海棠 、荀子
和苹果 、梨品种在遗传上有较大差异。所以在进行
聚类分析时 ,未将其列入 。
2.2　PCR扩增的结果
利用 FREET REE 和 TREEVIEW 软件对 PCR
扩增的结果进行分析后 。如图 2所示 ,根据 27 对
SSR引物的扩增结果 ,可将供试的 42个梨品种区分
为 5个群 ,第一群为仅有胭脂梨和红香梨 2个品种 ,
但与其它群的区别最为显著。第二群包括白香梨等
17个品种 ,根据 SSR的结果 ,可以进一步区分为 4
个亚群 ,即白香梨 、日本黄梨 、巍山红雪梨(团结乡种
植)、富源黄梨为第一亚群 。巍山红雪梨(园艺所种
植)、玉香梨 、红梨 32 号 , 83-74为第二亚群。慈梨 、
冀密 、酸梨为第三亚群。早美酥 、杜梨 、鸭梨 、茌梨 、
红叶梨 、早酥为第四亚群。第三群只有 3个品种 ,即
83-79 ,83-78和 95-2。第四群由 5个品种组成 ,包括
宝珠梨 、鲁沙梨 、火把梨 、文山红雪梨和日本品种丰
水 。第五群为本研究种品种较多的一群 ,共包括 15
个品种 。83-76 , 83-16 , 83-15-1 三个品种与其它品
种有较大差异 ,这三个品种之间也有较大差异。A-
55 ,83-20 ,83-67三个品种之间则十分相似 ,但与其
它品种差异较大。剩下的 YH1 ,红梨 35号 , YH2 ,
83-15-2 ,新水 ,黄花梨和幸水可构成另外一个亚群 。
3　讨　论
上述结果表明 ,一些来源于苹果(Malus×do-
mestica Borkh)的 SSR引物可用于梨的遗传多样性
及品种鉴别研究 ,仍有一定的效果 。这与 Yamamo-
to 等的研究结果一致[ 7] 。但由于使用的琼脂糖凝
胶分辨能力较低 ,所以记录到的等位位点数比使用
聚丙稀酰胺凝胶电泳时的少。这就表明 ,使用 SSR
研究群体时 , 为取得较好的效果 ,使用聚丙烯酰胺
或银染等分辨率更好的方法 ,是必要的 。在标记数
量相同的情况下 ,使用聚丙烯酰胺或银染得到的信
息就会更多 。
图 1　云南部分梨及其近缘种的微卫星图谱 , 引物为 CH01G12 , 扩增完成后
在 3 %琼脂糖凝胶上电泳的结果 ,最后两联为 DNA标记
Fig.1　Amplification results of p rimer CH01G12 , elect rophoresis w ith 3 % agarose gel.Last tw o lanes w ere DNA ladders.
1952期 易芍文等:云南省梨属植物资源的微卫星分析研究
图 2　根据 SSR 的结果利用 FreeTree软件(版本:0.9.1.50)进行 42 个梨品种聚类分析的结果
Fig.2　UPGMA tree of 42 varieties of pear obtained with FreeTree(Ver.0.9.1.50)
　　由于本研究使用的 SSR引物都是从苹果研究
中引入的 ,而且基本上都是以 AG为基序的 ,根据这
些标记得到的结果也还难以完整地代表梨品种的多
样性 ,特别是本试验中所使用的梨的野生近缘种棠
梨和 子 ,所以还不能根据本试验所使用的标记来
分析他们与梨之间 ,或是这些资源之间的亲缘关系 。
根据笔者对 GeneBank 中已经注册的 DNA 序列进
行微卫星分析的结果 ,虽然注册序列还不是很多 ,但
也含有大量其它基序的 SSR[ 10] 。利用其它基序及
不同长度的 SSR ,将为云南梨属植物资源的研究提
供更多的标记。
从本试验的结果看出 ,即使同是巍山红雪梨 ,不
同采样地点得到的样品仍有一定区别 ,这就说明利
用SSR进行品种区别的灵敏度是很高的 。但是不
一定能够恰当地反应品种之间的亲缘关系 ,尤其是
云南的梨的野生近缘植物石屏海棠(Malus hupe-
hensis Rehd)、腾冲海棠(Malus sieboldii Rehd)和
子(Cotoneaster multi f lora Bge)之间 ,很少能有扩增
产物 ,因此 ,还需要根据梨的已知序列设计更多的引
物 ,才能找到更好的引物用于亲缘关系的研究 。
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(责任编辑　王家银)
196 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　17卷