全 文 ：收稿日期:2009-05-20基金项目:上海市科学技术委员会中药现代化专项(08DZ1972500)作者简介:顾然其(1985-),女,硕士研究生 ,研究方向:生物医学工程。＊通讯作者:程舟 , Tel:021-65985185, E-mail:chengzhou@tongji.edu.cn。
用线粒体 nad1基因 b/c内含子鉴别
人参属 4种药材
顾然其 1 ,程　舟 1＊ ,李　靖1 ,杨晓伶 1 ,李　珊 1 ,朱云国1 ,张文驹 2 ,陈家宽 2
(1.同济大学生命科学与技术学院 ,上海 200092;2.复旦大学生命科学学院生物多样性科学研究所 /生物
多样性与生态工程教育部重点实验室 ,上海 200433)
　　摘要　目的:探讨人参属 4种药材人参 、西洋参 、三七 、竹节参的鉴别方法及其系统发育关系。方法:扩增线粒
体 nad1基因 ,测序比对 , 分析该基因序列的差异。结果:获得人参(移山参 、高丽参)和竹节参该基因的 1 290bp片
段序列 , 西洋参和三七的该基因片段长度则分别为 1 269bp和 1 522 bp, 主要差异为该基因的 b/c内含子。在 NJ
系统发育树上 , 人参和竹节参关系最近 ,其次是西洋参 , 而与三七的关系最远。结论:基于该片段的碱基差异可从
这 4种药材中将西洋参 、三七鉴别出来。人参属植物线粒体 nad1基因 b/c内含子存在一定的进化信息 , 可以进一
步用于人参属药材的鉴别及系统发育关系分析。
关键词　人参属;线粒体 nad1基因;b/c内含子;鉴别;系统发育
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)01-0045-04
IdentificationofFourMedicinesofPanaxL.Revealedby
Mitochondrialnad1 Geneb/cIntron
GURan-qi1 , CHENGZhou1 , LIJing1 , YANGXiao-ling1 , LIShan1 , ZHUYun-guo1 , ZHANGWen-ju2 , CHENJia-kuan2
(1.SchoolofLifeScienceandTechnology, TongjiUniversity, Shanghai200092, China;2.InstituteofBiodiversityScience, School
ofLifeScience, FudanUniversity/ChineseMinistryofEducationKeyLaboratoryofBiodiversityScienceandEcologicalEngineering,
Shanghai200433, China)
Abstract　Objective:TostudytheidentificationmethodandphylogeneticrelationshipsoffourmedicinesofPanaxL.genus:Pa-
naxginsengC.A.Meyer, P.quinquefolicumL., P.notoginseng(Burk.)F.H.ChenandP.japonicusC.A.Meyer.Methods:Themi-
tochondrialnad1genewasamplified.Theirsequencediferenceswereanalyzedaftersequencingandalignment.Results:Thesequence
lengthesofP.ginseng(includingChinesetransplantedginsengandKoreanginseng), P.japonicuswere1 290 bp, andthoseofP.
quinquefolicumandP.notoginsengwere1 269bpand1 522bprespectively.Themaindifferenceamongthesesequenceswasinnad1
geneb/cintron.TheNJphylogenetictreeshowedthatP.ginsengwasmostcloselyrelatedtoP.japonicus, nextwasclosertoP.quin-
quefolicum, andP.notoginsengwascomparativelydistantlyrelatedtoP.ginseng.Conclusion:P.quinquefolicumandP.notoginseng
canbeidentifiedfromthe4medicinesofPanaxL.basedonthesequencedifferenceinmitochondrialnad1 gene.Themitochondrial
nad1 geneb/cintroncanprovidesomeevolutionaryinformation, therefore, itisusefultoidentifyandphylogeneticlyanalyseforthe
medicinesofPanaxL.genus.
Keywords　PanaxL.;Mitochondrialnad1gene;b/cintron;Identification;Phylogeny
　　人参属(PanaxL.)植物在全世界共有 12个种 ,
分布于亚洲东部 、中部和北美洲 ,我国有 7个种(包
括 1个外来种 )、3个变种 〔1〕。其中 ,人参(Panax
ginsengC.A.Meyer)、西洋参(Panaxquinquefolicum
L.)、三七 [ Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen] 、
竹节参(PanaxjaponicusC.A.Meyer)均为人参属中
广泛栽培和使用的重要药用植物。但它们在功效上
有一定差异 ,且价格相差甚远 。传统的鉴别方法主
要是基于形态性状来区分和鉴定 ,但是 ,由于形态性
状易受环境影响而发生变化 ,且制成中药制剂后更
难对其进行鉴别。而基因组 DNA在分析鉴定植物的
来源及其遗传差异等方面有优势。
迄今 ,对人参属植物的分子鉴定研究主要集中
在西洋参和人参上 ,通过 RAPD、AP-PCR等方法可
以得到区别西洋参和人参的 DNA指纹图谱 〔2-5〕。对
人参不同种质包括野山人参与栽培人参(园参)、人
参栽培农家类型等的遗传差异及鉴别也有较多的研
究报道〔6-8〕 ,中药制剂中所用人参属植物种类 ,可用
梯度 PCR法进行鉴定〔9〕。人参属植物系统进化研
究也有一定进展 ,基于 rDNA-ITS序列 〔10〕和叶绿体
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TrnC-D〔11〕序列分析了人参属植物的系统进化关系 。
　　植物线粒体 nad1基因编码线粒体呼吸传递链
的复合体 I-泛醌氧化还原酶(NADH:ubiquinoneox-
idoreductase)的 nad1亚基 ,是一个结构较为稳定的
线粒体基因 ,由 5个外显子构成(nad1 /A-E)。研
究表明该基因片段外显子 B和 C之间的第 2内含
子区具有一定的系统发育信息 ,可用于较高分类等
级的系统发育重建〔12, 13〕。
　　本文拟通过 PCR扩增人参(移山参 、高丽参)、
西洋参 、竹节参 、三七的 nad1基因片段 ,测序比对
分析 ,探讨该片段用于鉴别这些人参属药材的可行
性 ,并构建它们的种间亲缘关系 ,为该片段在人参属
植物的鉴定及系统发育研究中的进一步应用打下基
础 。
1 　材料和仪器
1.1 　材料　移山参采自辽宁省桓仁满族自治县 ,
西洋参采自辽宁省新宾满族自治县 ,高丽参购自韩
国 ,竹节参采自湖北省恩施县 ,三七采自云南省文山
县 。所有样品经上海神象药业有限公司万树文高级
工程师鉴定均为正品 。 Tris-HCl100 mmol/L(pH
8.0);EDTA50 mmol/L(pH8.0);NaCl500 mmol/
L;β-巯基乙醇;裂解液 20%SDS;5 mol/LKAc;
RNaseA10mg/mL;异丙醇;TE缓冲液。
1.2 　仪器　PCR仪 、凝胶电泳系统 、紫外凝胶成像
仪 。
2 　方法
2.1 　DNA提取及 PCR扩增 　采用改进的高盐
SDS法提取总 DNA〔8〕。采用 nad1通用引物 〔14〕nad
1 exonB:5′-GCATTACGATCTGCAGCTCA-3′;nad1
exonC:5′-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3′, 对人参
(移山参 、高丽参)、竹节参 、西洋参 、三七 nad1基因
部分序列进行 PCR扩增。反应体系 50 μL含:2
mmol/LMgCl2、0.25 mmol/LdNTPs、0.2 μmol/L引
物 、50 ng模板 、1×bufer和 2UExTaqDNA聚合酶
(TaKaRa)。使用 EppendorfMastercyclerGradient
PCR仪进行扩增反应 ,扩增条件为:94℃预变性 2
min;39个循环:94℃变性 1min、57.5℃退火 1 min、
72℃延伸 2 min;最后 72℃延伸 10 min。取 5 μL
PCR产物经 2%琼脂糖凝胶电泳后 ,用紫外凝胶成
像仪观察并记录结果 ,将 PCR扩增产物经电泳检测
纯化后由上海基康生物技术有限公司测序 。
2.2 　数据处理　应用 ClustalX软件 〔15〕进行 DNA
序列的对位排列并人工校正 。使用 MEGA3.1软
件 〔16〕分析序列位点差异 、GC含量 、Kimura双参数距
离等。采用 PAUP＊ 4.0〔17〕的近邻(NJ)法对人参属 4
种药材进行系统发育分析 ,并采用重复抽样分析 1
000次检验分子系统树各分支的置信度 。
3　结果
3.1　线粒体 nad1基因扩增产物及序列分析　人
参属 4种药材人参(移山参 、高丽参)、西洋参 、竹节
参 、三七经 PCR扩增 ,可获得线粒体 nad1基因片
段。其中扩增出的人参(移山参 、高丽参)、西洋参 、
竹节参的线粒体 nad1基因片段长度约为 1.3 kb,
较难区分;三七则扩增出长度约 1.5 kb的线粒体
nad1基因片段 ,在电泳图上存在明显的差异 ,可直
接用于区分三七和其他药材 ,见图 1。
图 1　人参属 4种药材的线粒体
nad1基因扩增产物电泳图
　　对各种人参属药材线粒体 nad1基因扩增片段
测序分析并提交 GenBank(表 1)。经软件分析 , 4种
人参属药材的 GC含量相近 ,在 53.8% ～ 54.3%之
间 ,平均 54.1%。人参(移山参 、高丽参)和竹节参
的该片段长度均为 1 290 bp,其中包括 5′端外显子
B部分序列 14bp,第 2内含子序列 1 207bp, 3′端外
显子 C部分序列 69 bp。西洋参和三七的该片段长
度分别为 1 269 bp和 1 522 bp,与人参和竹节参同
样包括 5′端外显子 B部分序列 14bp和 3′端外显子
C部分序列 69 bp,与人参和竹节参不同之处在于 ,
西洋参的 b/c含子序列长度为 1 207bp,三七则为 1
440 bp。可见 ,这 4种人参属药材在该片段上的差
异主要在于 b/c含子序列长度 ,西洋参和其它药材
相比存在两段长为 14 bp和 7 bp的序列缺失 ,与人
参相比 ,序列差异为 1.65%;虽然西洋参和人参及
竹节参的该线粒体 nad1基因片段长度在琼脂糖凝
胶电泳图上很难区分 ,但存在 21 bp的差异 ,通过序
列比对可以将西洋参和人参及竹节参区分开来。而
与人参(移山参 、高丽参)、竹节参和西洋参相比 ,三
七的 nad1基因序列有较大差异 。除有较多的碱基
变异外 ,三七存在两段长为 5 bp和 4 bp的序列缺
失 ,而在 1 086 ～ 1 319bp处多一段 234 bp的序列 ,
与人参序列相比存在 16.42%的差异。
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　　表 1　 人参属 4种药材的 nad1基因序列长度 、GC含量和 GenBank基因序列号
样品 种　名 序列长度 GC含量 /% 序列空隙 /bp 序列差异 /% 基因序列号
移山参 PanaxginsengC.A.Meyer 1 290 54.2 0 0 EU551720
高丽参 PanaxginsengC.A.Meyer(Koreanginseng) 1 290 54.2 0 0 EU551723
竹节参 PanaxjaponicusC.A.Meyer 1 290 54.2 0 0 EU551721
西洋参 PanaxquinquefolicumL. 1 269 53.8 21 1.65 EU551722
三七 Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen 1 522 54.3 9 16.42 EU815936
3.2 　基于线粒体 nad1基因序列的系统发育关系
　基于线粒体 nad1基因序列的碱基变异采用
PAUP＊ 4.0软件 〔17〕获得的人参属 4种药材人参(移
山参 、高丽参)、西洋参 、竹节参 、三七的 NJ系统发
育树见图 2。其中 ,移山参 、高丽参和竹节参之间没
有差异 ,遗传距离为 0。人参和竹节参的关系最近 ,
其次是西洋参 ,而三七的关系最远。
图 2　人参属 4种药材的 NJ分子系统树
4 　讨论
　　人参属植物的分子鉴定研究主要集中在西洋参
和人参及其伪品 ,而且以 DNA指纹图谱为主 〔2-4〕。
通常这些 DNA指纹图谱在鉴定药材的过程中存在
PCR扩增重复性问题。而植物线粒体 nad1基因特
定片段在人参和西洋参之间存在片段长度和序列上
的差异 ,且容易扩增 ,可以较好地用于鉴定人参和西
洋参。本研究分析了属于同一个种的移山参和高丽
参 2个人参样品 ,它们的该线粒体 nad1基因片段
完全一致 ,同时结果显示与人参不同种的竹节参在
该线粒体 nad1基因片段上也没有差异 ,可见 ,该片
段序列并不能区分人参和竹节参。而三七无论在该
片段长度及序列上均完全不同于人参 、竹节参和西
洋参 ,可用于鉴别三七药材 。
Shim等〔9〕探讨了用梯度 PCR法确定中药制剂
中所用人参属植物种类的可行性 ,表明可通过人参
的特异性条带鉴定中药制剂是否含有人参属植物及
其种类 。本研究获得的人参属 4种药材线粒体 nad
1基因 b/c内含子序列 ,可作为人参属药材饮片 、粉
末和含有人参属药材的中成药制剂(丸剂 、散剂等)
鉴定的依据 ,也为今后进一步开展人参属药材 DNA
条形码鉴定研究打下基础 。
　　本研究基于线粒体 nad1基因序列构建的 4种
药材的系统发育关系与 Wen等基于 rDNA-ITS序
列〔10〕和叶绿体 TrnC-D序列 〔11〕构建的系统发育关
系一致 ,即人参和竹节参最相近 ,其次是西洋参 ,而
三七的关系最远。在植物的系统与进化研究中 ,叶
绿体基因片段和核基因片段是两个主要的分子鉴定
与分类的依据 。相比而言 ,结构复杂的植物线粒体
基因片段在系统发育研究中还十分有限 。已有研究
表明植物线粒体中许多基因如与呼吸代谢有关的
cob、cox1、nad1、nad4和 nad5基因均存在进化较
快的内含子 ,因此某些线粒体基因同样提供了重要
的进化信息〔14〕。本研究结果表明 ,人参属植物线粒
体 nad1基因 b/c内含子存在一定的进化信息 ,可
以用于分析人参属植物的系统发育关系 。
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144.
香木菌桂的性状与显微鉴别
吴宏欣1, 2 ,李昌勤 2 ,薛愧玲 1 ,康文艺 2＊
(1.河南大学校医院 ,河南 开封 475001;2.河南大学天然药物研究所 ,河南 开封 475004)
　　摘要　目的:对香木菌桂的药材性状 、显微特征进行鉴别。方法:通过观察粉末 、横切片 , 进行显微鉴定。结果:
香木菌桂的显微鉴别特征明显 ,叶横切面主脉发达 , 有分枝状石细胞与上表皮垂直。 粉末鉴定叶石细胞较多 ,且多
呈分枝状;导管多见 ,多为螺纹导管 , 少量为梯网纹导管;腺鳞和气孔类型明显。枝的石细胞较多 , 细胞壁多增厚不
均 , 导管也多见。结论:上述特征可作为香木菌桂质量标准制定的参考依据。
关键词　香木菌桂;药材性状;显微特征
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)01-0048-03
收稿日期:2009-03-12基金项目:国家自然基金项目(30500646);河南省教育厅骨干教师计划(2008-755)＊通讯作者:康文艺 , Tel:15237842414, E-mail:kangweny@hotmail.com。
　　香木菌桂来源于木犀科柊树 Osmanthushetero-
phylus(G.Don)P.S.Green的树皮或枝叶。柊树
分布于我国台湾和日本 ,在日本已有数百年的栽培
历史 ,并于 1856年引入英国 ,目前在英国和欧洲其
他国家以及北美普遍栽培 , 我国各地也广有栽
培 〔1〕。香木菌桂性凉 ,味微苦 。具有补肝肾 、强腰
膝 、消疮毒的作用 。主治腰膝无力 、痈肿疔毒及百日
咳 〔2〕。香木菌桂具有较好的药用价值 ,但目前未见
详细的生药学报道。为此 ,笔者对其枝 、叶进行详细
的性状 、显微方面的研究 ,旨在为香木菌桂质量标准
的制定提供资料 。
1 　材料与仪器
1.1 　材料　实验用药材于 2007年 12月采自南京
植物园 ,经中药教研室袁王俊老师鉴定为木犀科植
物柊树 Osmanthusheterophylus(G.Don)P.S.Green
的枝叶 ,标本见于河南大学天然药物研究所 。
1.2　仪器 　光学显微镜(规格型号:90V-240V～
20VA-0 /60Hz,舜宇光学科技有限公司);摄像头(北
京微视新纪元科技有限公司);紫外分光光度仪(规
格型号:UV-2000,尤尼柯上海仪器有限公司)。
2　结果
2.1　药材性状　幼枝被柔毛;叶对生 ,叶片革质 ,
长圆状椭圆形或椭圆形 ,长 4.5 ～ 6 cm,先端渐尖 ,
具针状尖头 ,基部楔形或宽楔形 ,叶缘全缘或具 1 ～
5对刺状牙齿 ,有时两侧牙齿数目不一致 ,齿长 5 ～ 9
mm,先端具锐尖的刺。中脉在下表面微凸出。
·48· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 1期 2010年 1月