全 文 ：　林业科技开发　2010年第 24卷第 4期 61　
苯胁迫下冬青属植物叶片细胞 ATPase
活性动态变化
张衡锋 1 ,陆小青2＊ ,汤庚国 3
(1.江苏畜牧兽医职业技术学院 ,江苏 泰州 225300;2.江苏省中国科学院植物研究所;3.南京林业大学)
摘　要:以冬青和大别山冬青为材料 , 经高浓度苯胁迫处理后 , 用透射电子显微镜观察叶片细胞 ATPase超微结构
的动态变化。结果表明:在高浓度苯胁迫下 , 冬青和大别山冬青细胞质膜 、细胞核 、细胞间隙上 ATPase活性明显提
高 ,其中大别山冬青 ATPase活性提高明显 ,尤其是液泡膜和叶绿体膜上 ATPase活性。这表明大别山冬青对苯气
体胁迫具有较强的抗性 ,冬青对苯气体胁迫的抗性较差 。
关键词:苯胁迫;冬青;ATPase;超微结构
UltrastracturedynamicsofATPaseactivityinleafcelsoftwoIlexsunderhighbenzenestress∥ZHANG
Heng-feng, LUXiao-qing, TANGGeng-guo
Abstract:TheultrastracturedynamicchangesofATPaseactivtyintheleavesofthree-year-oldIlexs(Ilexchinensis, andI.
dabeishannensis)seedlingsunderhighbenzenestresswerestudiedbythetransmissionelectronmicroscope.Theresults
showedthatbenzenestresscouldimprovetheATPaseactivtyofplasmolemma, nuclearenvelopeandintercellularspacefor
twoIIexs, especialyforI.dabeishannensis.TheATPaseactivtyofvacuolarmembraneandchloroplastmembranewasin-
creasedmorethanthatofotherorganelles.ThisindicatedthatI.dabeishannensiswasstrongerthanIlexchinensisinresis-
tingbenzenestress.
Keywords:benzenestress;Ilexs;ATPase;ultrastracture
Firstauthor saddress:JiangsuAnimalHusbandry＆VeterinaryColege, 225300Taizhou, Jiangsu, China
收稿日期:2010-04-03　　　　修回日期:2010-05-11
基金项目:江苏省科技厅高技术项目 “观赏型冬青植物抗污染新品种
的选育研究 ”(编号:BG2006316)。
第一作者简介:张衡锋(1980-),男 ,硕士,主要从事园林植物的引种和开
发研究。通讯作者:陆小青,男 ,高级实验师。E-mail:zhfwqc@sohu.com
　　目前我国城市室内空气污染严重 ,其中苯污染尤
为突出 。世界卫生组织(WHO)及国际癌症研究机构
于 1993年将苯确定为人类致癌物 [ 1] 。 ATPase是生
物体细胞内广泛存在的代谢酶 [ 2] ,探索 ATPase在细
胞中的分布状态是研究细胞生理的一种重要手
段 [ 3-4] 。 ATPase在细胞中的多少可反映出细胞当时
的生活状态 ,这一技术已被广泛应用于植物逆境生理
研究中 [ 5-7] 。目前国内外关于气体污染胁迫对植物
影响的研究多集中于酶的变化及植物光合系统和气
孔运动的变化[ 8] , 而关于气体污染对植物细胞
ATPase活性超微结构影响的报道很少 ,关于苯胁迫对
植物叶片细胞 ATPase活性超微结构的影响尚未见报
道 。本文观察分析了高浓度苯气体胁迫下两种冬青
的叶片 ATPase活性超微结构的动态变化并对其抗性
进行了比较 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验材料为冬青属的冬青(Ilexchinensis)和大别
山冬青(I.dabeishannensis),都为引种到南京中山植
物园冬青试验苗圃中的 3年生扦插苗 。选生长健壮 、
整齐一致的个体 ,在 2006年秋季上盆栽培 ,栽培基质
为黄棕壤性质的园土。每盆 1株 ,每种上盆 50株 ,放
在光照条件一致的苗圃培养。 2007年 3月移入温
室 ,试验时所有花盆都用聚四氟乙烯薄膜包裹。
2.2　试验处理
采用熏蒸法 ,在所有密闭仓中注入 40 μL苯 。温
度设定为 25℃。植物放入密闭仓后 0天和 30天分别
取样 ,采集生长良好 、自顶端向下成熟的第 3片叶 。
取材后将材料切成 1 mm3左右的小块分别固定 。其
处理 、固定和包埋等操作程序根据 WangYQ等[ 9]的
方法并有所改进。具体步骤如下:
(1)将切好的冬青材料迅速投入用 50 mmol/L
(pH7.2)二甲胂酸钠缓冲液配制的 4%多聚甲醛与
2.5%戊二醛的混合固定液中 ,室温下初固定 2 h。
(2)用 50 mmol/L(pH7.2)的二甲胂酸钠缓冲
　应用研究
62　 林业科技开发　2010年第 24卷第 4期
液洗 4次 ,每次约 0.5 h。
(3)再用 50 mmol/L(pH7.2)的 Tris-Maleate缓
冲液洗 2次 ,均在 4℃下进行 ,每次约 0.5 h。
(4)将洗涤过的材料转移到酶孵育液中 ,室温下
培育2.5h。酶孵育液的组成为:50 mmol/L(pH7.2)
的 Tris-Maleate缓冲液中含有 ATP钠盐 2mmol/L, Pb
(NO3)2 3 mmol/L, MgSO45 mmol/L。设两个对照反应
(均由 50mmol/L(pH7.2)的 Tris-Maleate缓冲液配制):
①反应液中不加 ATP;②反应液中加入0.1MNaF。
(5)孵育反应后 , 先用 50 mmol/L(pH7.2)的
Tris-Maleate缓冲液洗 2次 ,每次20min。
(6)再用 50 mmol/L(pH7.2)的二甲胂酸钠缓
冲液洗 2次 , 4℃下每次约0.5h。
(7)将孵育过的材料在 4℃下 ,用 50 mmol/L(pH
7.2)的二甲胂酸钠缓冲液配制的 1%锇酸固定液固
定 8h。
(8)在室温下 ,用重蒸水洗 2次 ,每次约 0.5 h。
(9)将洗涤过的材料 ,经丙酮系列脱水 , Spurr树
脂包埋。 LKB300型超薄切片机切片 ,切片不经染
色 ,在 H-600型透射电镜下观察 、拍照。
2　结果与分析
2.1　苯胁迫前后冬青叶片细胞 ATPase定位
电镜细胞化学试验表明 ,冬青处理前 ATPase活
性反应生成黑色沉淀物在叶片细胞中的一定部位界
限明显 ,以细胞质膜的活性最强 ,细胞质 、液泡膜 、胞
间连丝及细胞间隙上有少量沉淀物(见图 1A～图
1B)。处理后冬青叶片细胞发生质壁分离 ,细胞质膜
上 ATPase活性显著增加 ,而胞间连丝上 ATPase活性
显著下降 , 叶绿体膜和液泡膜上均未出现明显的
ATPase活性(见图 1C～图 1D)。
A.叶片细胞中细胞质膜和胞间连丝上有 ATPase分布(×17 000);B.叶片细胞中细胞质膜和细胞质上有沉淀物(×10 000);C.叶片细胞中质壁分
离的质膜上有强电子致密物(×3 500);D.叶片叶脉组织中细胞质膜有 ATPase沉淀物(×4 000);E.叶片细胞中细胞质膜和细胞间隙有沉淀物
(×12 000);F.叶片细胞中的叶绿体膜 、质膜和细胞质物上有少量沉淀物(×12 000);G.叶片细胞中质膜和叶绿体膜上有较强沉淀物(×4 000);
H.叶片细胞中肿胀的叶绿体膜、质膜和液泡膜上有较强的沉淀物(×12 000);I.叶片细胞细胞核上有沉淀物(×10 000);J.叶片细胞细胞核 、质
膜 、胞间连丝和细胞质上均有较强的沉淀物(×6 000);K.冬青酶孵育液中未加底物的对照反应切片(无沉淀物);L.大别山冬青酶孵育液中未加
底物的对照反应切片(无沉淀物)。注:N.细胞核 , Nm.核膜 , Ch.叶绿体 , Ce叶绿体膜 , V.液泡 , Th.类囊体片层 , T.液泡膜 , Pm.质膜 , Pd.胞间连
丝 , Cy.细胞质 , Cw.细胞壁 , Is.细胞间隙。
图 1　苯胁迫前后两种冬青叶片细胞 ATPase定位
应用研究　
　林业科技开发　2010年第 24卷第 4期 63　
2.2　苯胁迫前后大别山冬青叶片细胞 ATPase定位
大别山冬青处理前叶片细胞正常 ,细胞质膜 、叶
绿体膜 、液泡膜及细胞间隙上有少量沉淀物(见图 1E
～图 1F)。处理后绝大多数细胞结构完整 ,细胞质
膜 、细胞核膜 、细胞间隙和胞间连丝 ATPase活性明
显 ,尤其是液泡膜和叶绿体膜上的 ATPase活性显著
升高(见图 1G～图 1J)。
2.3　对照反应
观察酶孵育液中未加底物的对照反应切片 ,可以
看出冬青和大别山冬青质膜及叶绿体膜等细胞器上
均无沉淀物 ,表明反应切片中的黑色沉淀物是ATPase
活性的真实反映(见图 1K～图 1L)。
3　讨　论
ATPase是能够水解 ATP产生能量 ,使离子逆电
化学梯度进行跨膜运输的膜载体蛋白。植物细胞质
膜和液泡膜上的 H+ -ATPase消耗 ATP能量建立跨
膜质子电化学势剃度 ,推动各种离子和小分子代谢产
物进行跨膜运输。因此 ,植物细胞膜上的 ATPase被
称为 “主宰酶 ” [ 10] 。 ATPase活性在胁迫条件下通常
会有所提高 。研究发现 ,小麦抗盐突变体根细胞液泡
膜 ATPase的活性随盐浓度强度的增加而增加 ,且其
增加的幅度无论是在绝对量上还是在相对量上均显
著高与不耐盐的野生型 [ 11] 。在高粱上研究显示 ,盐
处理第 1天 ,高粱根和叶鞘液泡膜 ATPase活性成倍
增加 ,第 2天降至对照的水平 ,至第 7天已明显低于
对照[ 12] 。另外 ATPase属于膜结合蛋白 ,胁迫下生物
膜结构以及稳定性发生的变化也同样会影响到 AT-
Pase的活性 ,而细胞膜系统通常是胁迫伤害的主要
部位[ 13] 。所以在胁迫下植物细胞膜结构功能的稳定
性在维持 ATPase活性和细胞的离子平衡中起着十分
关键的作用 。
两种冬青经过苯气体胁迫后 ,能量代谢受到干
扰 ,减少了 ATP的供应。胁迫下植物细胞中的 H+ -
ATPase和 ATP的亲和力提高 ,这对抵御胁迫的危害
具有积极的意义 。试验结果表明 ,苯气体胁迫 30天 ,
冬青细胞质膜上 ATPase活性显著增加 ,而胞间连丝
上 ATPase活性显著下降 ,可能因为胁迫条件下 ,细胞
结构受损 ,细胞间的物质和信息交流减弱 。大别山冬
青除细胞质膜上 ATPase活性显著增加外 ,液泡膜 、胞
间连丝 、细胞核膜和叶绿体膜上 ATPase活性都显著
增加 ,尤其液泡膜和叶绿体膜是植物细胞中离子泵的
重要组成部分。这就表明大别山冬青在苯胁迫条件
下 , ATPase活性增强 ,水解 ATP,跨膜运输H+ ,维持
膜电化学势梯度 ,维持细胞的正常生长 ,对苯气体胁
迫表现出较强的抗性。相对于大别山冬青 ,冬青对苯
气体胁迫的抗性较差。这个结果与陆小青等 [ 14]关于
7种冬青对苯气体胁迫的生理反应的研究结果基本
一致。
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(责任编辑　周贤军)
　应用研究