全 文 ：果 树 学 报 2009，26（2）: 180～185
Journal of Fruit Science
枇杷属植物 ISSR反应体系的建立和优化
付 燕 1，罗 楠 1， 杨 芩 1，2，王永清 1*，邓群仙 1，李俊强 1，秦红玫 1，阮光伦 3
（1四川农业大学林学园艺学院，四川雅安 625014； 2凯里学院环境与生命科学学院，贵州凯里 556000；
3重庆市涪陵区果品办公室，重庆 408000））
摘 要: 首次通过正交实验，对影响枇杷属植物 ISSR 反应较大的 Mg2+、Taq 酶、dNTPs、引物、模板 DNA 浓度进行筛
选，并对扩增反应程序进行优化。优化后的反应体系为: 25 μL反应体系中，含 10×buffer 2.5 μL, Mg2+浓度 2.0 mmol·L-1，
Taq 酶 1.5 U，引物 0.3 μmol·L-1，模板 DNA 60 ng，dNTPs 0.15 mmol·L-1。 反应程序为 94 ℃预变性 5 mim；94 ℃变性
1 mim，退火温度 70 s，72 ℃延伸 1.5 mim，40 次循环；72 ℃延伸 7 mim，4 ℃保存。
关键词: 枇杷属植物； ISSR； 正交设计； 反应体系
中图分类号：S667．3 文献标识码：A 文章编号：1009－9980(2009)02－180－06
Establishment and optimization of ISSR reaction system for species of
Eriobotrya
FU Yan1，LUO Nan1，YANG Qin1，2，WANG Yong-qing1*，DENG Qun-xian1，LI Jun -qiang1，QIN Hong -
mei1，RUAN Guang-lun3
（1College of Forestry and Horticulture，Sichuan Agricultural University，Yaan，Sichuan 625014 China； 2College of Environmental and Life
Science， Kaili University， Kaili， Guizhou 55600 China; 3Fruit Office of Fuling Area of Chongqing， Chongqing 408000 China）
Abstract: The concentration of Mg2+，Taq polymerase，dNTPs，primer and template DNA，greatly influencing ISSR-PCR of
loquat，were optimized by orthogonal design in this study，and the reaction procedure was also improved． Thus an optimized
ISSR reaction system was established for the first time for loquat． The total 25 μL contained 10×buffer 2.5 μL，2.0 mmol·L-1
Mg2+，1.5 U Taq polymerase，0.3 μmol·L-1 primer，60 ng template DNA，and 0.15 mmol·L-1 dNTPs． The reaction procedure
was: 94 ℃ for 5 min，followed by 40 cycles of 94 ℃ for 1 min，annealing temperature for 70 s，72 ℃ for 1.5 mim，and was ter-
minated with a 7 min extension step at 72 ℃．
Key words: Eriobotrya Lindl.； ISSR； Orthogonal design； Reaction system
枇杷属 （Eriobotrya Lindl.） 植物属于蔷薇科
（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae），原产中国。 枇杷属
植物约有 30个种， 分布在亚洲亚热带和温带地区。
其中原产于中国的有 21 个种类（包括种、变种和变
型）[1] 。 中国拥有丰富的枇杷种质资源，种类多，分布
广，野生、半野生的种系繁多，种与品种间分类存在
一定分歧 [2]。 目前在枇杷属植物中运用最多的是
RAPD 标记[3]，由于 RAPD 标记重复性相对较差而限
制了其在分类中的运用。 因此运用更可靠的 ISSR、
AFLP 等分子手段对枇杷属植物进行分类、种质资源
鉴定和遗传多样性研究具有重要意义。
ISSR（Inter Simple Sequence Repeats，即简单重
复序列区间），利用人工合成的 17～24个核苷酸重复
序列作为引物，在引物的 3’端或 5’端加上 2～4个随
机选择的核苷酸，对传统意义上的 SSR 之间的 DNA
序列进行扩增，而不是扩增 SSR 本身 [4] 。 与 SSR 相
比，ISSR 不需要预先获知序列信息，不需要酶切，其
成本也比 AFLP 低； 由于重复序列在基因组中是变
异最快的成分， 因此其多态性比 RAPD更高， 更可
靠，重复性好。近年来，ISSR技术已在杧果[5]、梨[6]、葡
萄[7]等多种果树上得到了广泛应用，是研究植物遗传
多样性和种质资源鉴定的有效手段， 但在枇杷属植
物中的研究应用报道较少 [8-9]， 尚未见枇杷属植物
ISSR反应体系系统优化的研究报道。 为此我们建立
并优化了枇杷属植物 ISSR反应体系， 为在 DNA 水
平上对枇杷属植物种质资源进行研究奠定了基础。
收稿日期： 2008－08－11 接受日期: 2008－12－01
基金项目： 基金项目:四川省农作物育种攻关项目（项目编号: 2001-08-03-13）
作者简介： 付燕，女，在读硕士生，主要从事果树生物技术研究。 Tel: 13882447901，E-mail: fuyanloquat@126.com
觹 通讯作者。 Author for correspondence． Tel: 13684450258，E-mail: yqw14@sicau.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2009.02.015
图 1 枇杷属植物 ISSR 反应体系正交设计实验结果
（引物 UBC811）
编号分别对应表 1 中各处理组合，M. 100 bp DNA ladder
Fig. 1 The electrophoresis results of ISSR-PCR orthogonal
design （using primer UBC 811）
Number refers to the treatment in table 1，M. 100 bp DNA ladder
1 材料和方法
1.1 材料
实验材料（按顺序编号 1～21）为 : 窄叶枇杷（E.
henryi Nakai）、台湾枇杷（E. deflexa Nakai.）、台湾枇
杷 恒 春 变 种 （E. deflexa Nakai. var. koshunensis
Nakai.）、南亚枇杷（E. bengalensis Hook. f.）、广西枇
杷 （E. kwangsiensis Chun）、 香花枇杷 （E. fragrans
Champ.）、栎叶枇杷（E. prinoides Rehd. & Wils.）、大
渡河枇杷（E. prinoides Rehd. & Wils. var. dadunensis
H. Z. Zhang）和普通枇杷（E. japonica Lindl.）中的栽
培品种美满、龙泉 1 号、洛阳清、红灯笼、龙泉 5 号、
大五星、早钟 6 号、田中、伍桥、解放钟、白玉、茂木、
华宝 2号。其中野生种采自华南农业大学果树种质资
源圃，栽培品种采自四川省成都市龙泉驿区。 采集新
梢未展开嫩叶，用冰壶保存，置于-70℃冰箱中备用。
1.2 基因组 DNA提取
参照刘月学等[10]的方法，提取物用 100μL 去离子
水溶解，核酸蛋白仪测定 DNA 的浓度和纯度，并用
0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，-20℃保存。
1.3 PCR扩增和优化设计
对影响反应较大的 Mg2 + 、TaqDNA 聚合酶 、
dNTPs、引物、模板 DNA 浓度进行 5 因素 5 水平正
交实验设计（表 1）。
按表 1编号加样， 除表中所列因素外， 还包括
2.5 μL10×buffer，加去离子水补足 25 μL。 以大五星
DNA 为模板，使用引物 UBC811 对以上各因素进行
优化， 反应程序在参照其它蔷薇科木本果树 [11]ISSR
反应程序的基础上，初步确定为 94℃预变性 5 min；
94 ℃变性 1 min，52 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 1.5
min，45个循环；72℃再延伸 7 min，4℃保存。
根据正交试验结果，选择合适的反应体系，确定
引物的最佳退火温度。 根据引物 Tm 值，设定退火温
度为（48～58℃），PCR仪（Bio-Rad 公司 PTC-200）自
动生成 8 个温度梯度 : 48、48.8、50.1、51.9、54.4、
56.3、57.5、58 ℃。 同时对循环次数、退火时间、延伸
时间等影响 ISSR反应的重要因素进行优化。
1.4 PCR产物检测
扩增产物用 1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB
染色，Syngene 凝胶成像系统观察拍照。
2 结果与分析
2.1 正交设计直观分析评分
按表 1 设计的 25 个处理进行 PCR 反应后，将
得到的产物进行电泳（图 1）。不同 Mg2+浓度、Taq酶用
量、引物浓度、模板用量和 dNTPs 浓度扩增的结果
各不相同。参照何正文等[12]和汪结明等 [13]的正交设计
直观分析方法，对 2 个重复 PCR 产物电泳结果分别
评分。依扩增谱带特异性与敏感性即谱带多少、亮度
的强弱和有无弥散现象评分，谱带越多、亮度越强、无
弥散现象评分越高，反之评分越低。最好的处理定为
25 分，最差的处理定为 1 分，以这 2 个处理的结果
为比较标准，再将其他处理的谱带结果与这 2个标准
比较依次评分， 依照这一评分标准图 1 中各处理的
记分结果依次为 : 2、3、3、1、1、1、2、1、12、10、10、15、
25、18、17、21、17、10、17、25、10、5、14、22、9； 重复的
电泳结果与第 1个电泳结果有较强的一致性， 其记
编号
No.
Mg2+
/mmol·L-1
Taq 酶
Taq polymerase
/U
引物
Primer
/μmol·L-1
模板 DNA
Templacte
DNA/ng
dNTPs
/mmol·L-1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.2
0.3
0.4
0.5
0.1
0.3
0.4
0.5
0.1
0.2
0.4
0.5
0.1
0.2
0.3
0.5
0.1
0.2
0.3
0.4
20
40
60
80
100
80
100
20
40
60
40
60
80
100
20
100
20
40
60
80
60
80
100
20
40
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.30
0.10
0.15
0.20
0.25
0.25
0.30
0.10
0.15
0.20
0.20
0.25
0.30
0.10
0.15
0.15
0.20
0.25
0.30
0.10
表 1 ISSR 反应体系 L25（56）正交实验设计
Table 1 L25（56）orthogonal design for ISSR-PCR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213141516171819202122232425M 1400
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
bp
2 期 付 燕等: 枇杷属植物 ISSR 反应体系的建立和优化 181
果 树 学 报 26 卷









 
 

Taq 酶 Taq polymerase/U
图 3 Taq 酶浓度与扩增结果的关系
Fig. 3 Taq polymerase in relation to amplification result
结
果
均
值
M
ea
n
of
re
su
lts
变异来源
Source
平方和
SS
自由度
DF
均方
MS
F 值
F
显著水平
P
Mg2+
Taq酶
Taq polymerase
引物 Primer
DNA
dNTPs
误差 Error
总计 Total
9 870.600 0
1 145.600 0
704.600 0
318.600 0
90.600 0
24.500 0
12 154.500 0
4
4
4
4
4
25
45
2 467.650 0
286.400 0
176.150 0
79.650 0
22.650 0
0.980 0
3 525.214 0
2 864.000 0
117.433 0
41.921 0
20.591 0
0.000 0
0.000 0
0.000 0
0.000 5
0.002 6
表 2 PCR 反应各因素间方差分析
Table 2 Variance analysis on factors of PCR reaction









   
分依次为: 2、4、3、1、1、1、1、1、12 、11 、10、16、25、17、
18、20、17、9、17、25、11、4、15、23、8。
2.2 各因素对 PCR反应影响的差异分析
将上述处理和评分结果用 DPS 统计软件进行
方差分析（表 2）。由 F值可知，Mg2+对反应影响最大，
dNTPs 影响最小，各因素水平变化对 PCR 反应影响
大小依次为 : Mg2+、Taq 酶 、 引物 、 模板 DNA 和
dNTPs。
2.2.1 Mg2+浓度对枇杷属植物 ISSR 反应体系的影
响 从图 2 可以看出，随着 Mg2+浓度增加，扩增结果
均值明显增加，当 Mg2+浓度增加到 3.0 mmol·L-1时，
扩增结果均值有减少的趋势。从图 1中可见，当 Mg2+
浓度在 1.0～1.5 mmol·L-1 时（1～10 号处理），几乎无
扩增谱带或扩增带较弱 。 当 Mg2+浓度为 2.0～2.5
mmol·L-1（11～20 号处理）时，扩增产物明显增多，且
特异性较强。 对 Mg2+进行因素内多重比较， 结果表
明，25 μL 体系中， 除 2.0 mmol·L-1 和 2.5 mmol·L-1
差异不显著外，其他各水平均达到极显著水平。根据
电泳图谱与评分结果分析， 确定 Mg2+浓度为 2.0
mmol·L-1。
2.2.2 Taq酶对枇杷属植物 ISSR反应体系的影响
从方差分析可知 Taq 酶对 ISSR-PCR 反应影响较
大: Taq 酶量过低，PCR 反应的敏感性差， 扩增产物
少；Taq 酶量过高扩增反应的特异性降低，产生大量
的弥散片断，形成很亮的背景。 从图 1中可以看出，
当反应体系中 Taq 酶用量为 0.6 U（1、6、11、16、21
号处理）和 0.9 U（2、7、12、17、22 号处理）时，扩增谱
带较弱或有缺失； 由图 3可见， 随着 Taq 酶用量增
加，扩增结果均值逐渐增加，当 Taq 酶用量为 1.5 U
时， 扩增效果最好，Taq 酶为 1.8 U 时扩增结果均值
有较少的趋势。 对 Taq酶因素内各水平进行多重比
较，结果表明，各水平差异均达到极显著水平。因此，
确定 Taq酶 1.5 U为本实验反应参数。
2.2.3 引物浓度对枇杷属植物 ISSR 反应体系的影
响 引物浓度关系到扩增产物的质量。 浓度太低不
能进行有效的扩增， 浓度太高会增加引物二聚体的
形成，导致条带不稳定及清晰度下降。 由图 1 可知，
当引物浓度为 0.1 μmol·L-1 （1、10、14、18、22 号处
理）时，扩增片段分子量大小在 600～900 bp，小分子
质量片段没有得到有效扩增； 当引物浓度增至 0.5
μmol·L-1（5、9、13、17、21 号处理）时，扩增片段分子
量在 200～900 bp，小分子量片段能有效扩增，从图 4
可见，当引物浓度为 0.3 μmol/L 和 0.5 μmol·L-1时，
扩增结果均值较好。对引物各水平进行多重比较，结
图 2 Mg2+浓度与扩增结果的关系
Fig. 2 Mg2+ in relation to amplification result
结
果
均
值
M
ea
n
of
re
su
lts
Mg2+/mmol·L-1











引物 Primer/μmol·L-1
图 4 引物浓度与扩增结果的关系
Fig. 4 Primer concentration in relation to
amplification result
结
果
均
值
M
ea
n
of
re
su
lts
182
2 期 付 燕等: 枇杷属植物 ISSR 反应体系的建立和优化

























    
dNTPs/mmol·L-1
图 6 dNTPs 浓度与扩增结果关系
Fig. 6 dNTPs in relation to amplification result
模板 DNA Tamplate DNA/ng
图 5 模板浓度与扩增结果的关系
Fig. 5 Template DNA in relation to amplification result
果表明，0.3 μmol·L-1 和 0.5 μmol·L-1，0.2 μmol·L-1
和 0.4 μmol·L-1差异未达极显著水平。 因此综合考
虑扩增结果和节约成本，选择引物浓度为 0.3 μmol·
L-1为本实验的反应参数。
2.2.4 模板浓度对枇杷属植物 ISSR反应体系的影响
由方差分析可见，模板对 ISSR-PCR 反应影响较
小，在 20～100 ng的扩增效果均较好（图 5）。 对 DNA
各水平进行因素内多重比较， 结果表明， 除 40 ng
外，其他各水平差异均未达到极显著水平。因此确定
模板浓度 60 ng为本实验的反应参数。
2.2.5 dNTPs 对枇杷属植物 ISSR 反应体系的影响
由方差分析可见，dNTPs 是影响反应最小的因
素。 对 dNTPs 各水平进行多重比较， 结果表明，除
0.30 mmol·L-1 与其他各水平差异达到极显著水平
外， 其余各水平间差异达显著水平， 0.15 mmol·L-1
和 0.20 mmol·L-1差异不显著。 由图 6 可见，dNTPs
浓度在 0.15～0.20 mmol·L -1 时扩扩增效果较好 ，
dNTPs 浓度升高到 0.25 mmol·L-1 时扩增效果有减
弱的趋势。 因此，综合考虑扩增效果和节约成本，选
择 dNTPs浓度 0.15 mmol·L-1为本实验的反应参数。
2.3 退火温度对枇杷属植物 ISSR反应体系的影响
如引物 UBC841（图 7），当退火温度低于 54.4℃
时， 扩增条带明显增多， 许多大分子量片段得到扩
增，但背景较模糊，不利于条带统计。因此，综合考虑
扩增的完整性和清晰度， 引物 UBC841 最佳退火温
度确定为 58℃。表 3为本研究得到的部分引物最佳
退火温度及其 Tm值。
2.4 退火时间对枇杷属植物 ISSR反应的影响
本实验设置了 3个退火时间对最佳退火时间进
行筛选，结果表明退火时间为 45 s 时，扩增条带有
缺失，且有弥散现象；适当延长退火时间，扩增条带
逐渐增加，拖尾现象逐渐消失。 退火时间为 70 s时，
扩增条带完整清晰（图 8）。 因此，本实验退火时间为
70 s。
2.5 循环次数对枇杷属植物 ISSR反应体系的影响
结
果
均
值
M
ea
n
of
re
su
lts
结
果
均
值
M
ea
n
of
re
su
lts
图 7 不同退火温度对 ISSR-PCR 扩增结果的影响
（引物 UBC841）
1~8 为退火温度梯度 48、48.8、50.1、51.9、54.4、56.3、57.5、58℃
Fig. 7 Effects of annealing temperature on ISSR
amplification (Primer UBC841)
The annealing temperature from 1 to 8 in order: 48，48.8，50.1，51.9，
54.4，56.3，57.5，58℃
1 2 3 4 5 6 7 8
表 3 部分引物最佳退火温度和 Tm 值
Table 3 The optimal annealing temperature and Tm value
of some primers
引物
Primer
序列（5’-3’）
Sequence（5’-3’）
退火温度
Annealing temperature/℃
Tm值
Tm value/℃
UBC810
UBC811
UBC814
UBC815
UBC834
UBC835
UBC836
UBC840
UBC841
UBC856
UBC857
UBC864
UBC873
UBC876
UBC880
UBC881
UBC895
UBC899
(GA)8T
(GA)8C
(CT)8A
(CT)8G
(AG)8GTT
(AG)8GTC
(AG)8GTA
(GA)8GTT
(GA)8GTC
(AC)8GTA
(AC)8GTA
(ATG)6
(GACA)4
(GATA)2(GACA)2
(GGAGA)3
(GGGTG)3
AGAGTTG-
GTAGCTCTTGATC
CATGGTGTTGGT-
CATTGTTCCA
58.0
58.0
54.4
51.9
58.0
56.3
58.0
54.4
58.0
58.0
58.0
58.0
56.3
50.1
58.0
57.5
56.3
56.3
52.2
54.6
52.2
54.6
53.9
56.2
54.4
53.9
56.2
53.9
56.2
48.2
51.5
46.4
53.6
61.8
55.8
58.2
183
果 树 学 报 26 卷
图 10 引物 UBC895 在 21 份枇杷属植物种质资源中的 ISSR 扩增结果
（编号见材料部分，M: 100 bp DNA ladder）
Fig. 10 Banding pattern of 21 loquat accessions amplified by primer UBC895
(Number the same as materials，M: 100 bp DNA ladder)
图 8 不同退火时间对 ISSR 扩增结果的影响
1-3 为引物 UBC841，4-6 为引物 UBC845，退火时间为 45 s，60 s，70 s
Fig. 8 Effects of annealing time on ISSR amplification
1 to 3: Primer UBC841，4 to 6: Primer UBC845
Annealing time from 1 to 3 and 4 to 6 in order: 45 s，60 s and 70 s
循环次数对扩增产物的量具有重要影响， 且不
同植物适合的循环次数不同。循环次数不够，扩增产
物少，部分谱带不能检测；过多的循环次数可导致一
些非特异性的产物干扰，发生错配的比例也上升，引
起弥散现象。 实验结果发现 35次循环时，扩增产物
不足，条带弱且有缺失；40 次循环扩增产物亮度高，
清晰度好； 而 45次循环时出现了明显的弥散现象，
条带拖尾不清（图 9）。 因此确定 40次循环为本实验
的最佳反应参数。
通过实验分析，优化枇杷属植物 ISSR反应体系，
在 25 μL 反应体系中 ， 含 10×buffer 2.5 μL，Mg2+2.0
mmol·L-1，Taq酶 1.5 U， 引物 0.3 μmol·L-1， 模板 60
ng，dNTPs 0.15 mmol·L-1。反应程序为 94℃预变性 5
mim；94℃变性 1 mim， 退火温度 70 s，72℃延伸 1.5
mim，40次循环；72℃延伸 7 mim，4℃保存。
采取上述优化体系，用引物 UBC895 对 21 份枇
杷属植物种质资源进行扩增（图 10），由图可见扩增
谱带清晰，多样性异常丰富。
1 2 3 4 5 6
图 9 不同循环次数对 ISSR 扩增结果的影响
1-3 为引物 UBC841，4-6 为引物 UBC845， 循环次数依次为 35、40、
45 次
Fig. 9 Effects of cycle times on ISSR amplification
1 to 3. Primer UBC841，4 to 6. Primer UBC 845 Cycle times from 1 to 3
and 4 to 6 in order. 35 times，40 times and 45 times
1 2 3 4 5 62 3 5 6
3 讨 论
ISSR反应退火温度较高，引物～模板复合物比较
稳定，很少出现由于随机因素造成反应不稳定的情况。
从实验结果可以看出，Mg2+对反应影响较大，Mg2+浓度
为 0.5 mmol·L-1和 1.0 mmol·L-1时大部分组合扩增不
完整或没有扩增带， 但当 Mg2+浓度为 3.0 mmol·L-1
时有一定弥散现象。 引物浓度对扩增产物的完整性
和扩增片段的大小有强烈的选择性， 引物浓度低时
更有利于大分子量片段的扩增， 引物浓度高时更有
利于小分子量片段的扩增，这与彭海等 [14]的研究结
果一致，但其原理有待于进一步研究。 由于 ISSR 引
物序列较长，且不同引物（CG）含量差异较大，不同
引物退火温度差异较大。较高的退火温度下，由于扩
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
bp
184
2 期
增的特异性增强，条带逐渐减少；退火温度偏低，背
景模糊，弱带较多，不利于结果的统计，因此对每条
引物的最佳退火温度进行筛选十分必要。 但本研究
引物最佳退火温度与其 Tm 值之间无规律可循，这
与代红艳等[15]的研究结果一致。
ISSR 体系优化采用较多的为单因素设计，通过
多次实验最终得到最佳反应体系。 近年来正交设计
逐渐用于各种反应体系的优化， 其主要根据统计学
原理，从复因子实验结果中，挑选几个处理进行部分
实验，了解全面实验的情况和因素之间的内在规律，
能较快地找到最优水平组合。与单因素设计相比，正
交设计减少了许多的处理组合， 通过一次实验就得
到了最佳反应体系，不仅大大地节约了时间，且能降
低实验费用。 由于枇杷属植物 ISSR研究报道较少，
并且已有研究均未对其反应体系和扩增程序进行系
统优化 [17]，而主要参照同属蔷薇科的其他木本植物
的反应体系进行扩增， 因此其稳定性与可靠性有待
提高。 本实验采用正交设计对各因素水平进行综合
筛选，研究探讨各因素对 PCR 反应结果的影响大小
和内在规律性，并对影响反应较大的退火温度、退火
时间和循环次数等参数进行了系统优化。 优化后的
反应体系在 21 份枇杷属植物材料中扩增的谱带清
晰稳定，重复性好。 因此，本研究建立的枇杷属植物
ISSR 反应体系稳定可靠，为枇杷属植物种、品种鉴
定及遗传多样性研究提供了有效的方法。
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