全 文 ：基金项目:国家自然科学基金项目(编号:30970300);哈尔滨科技创新人才研究专项基金项目(编号:2010rfxxs031)
通讯作者:王振月 Tel:(0451)87266273 E-mail:wangzhen_yue@ 163． com
基于 psbA-trnH序列鉴定酸模属几种药用植物
郭慧1 贾力维1 王谦博2 周博1 王振月1 (1．黑龙江中医药大学 哈尔滨 150040;2．广东药科大学附属第一医院
药学部)
摘 要 目的:分析酸模、皱叶酸模、巴天酸模、长刺酸模、毛脉酸模、羊蹄酸模的 psbA-trnH条形码序列，探讨酸模属植物的鉴
定新方法。方法:对 24 份植物样品提取基因组 DNA，PCＲ聚合酶链式反应扩增 psbA-trnH序列进行双向测序，序列经过 Con-
donCode Aligner拼接后，采用 MEGA 6． 0软件进行序列比对，计算种内种间 K2P遗传距离，构建系统邻接树(NJ Tree)。结果:
表明酸模属 psbA-trnH序列种内平均 K2P距离均小于种间平均 K2P距离;应用相似性搜索法分析结果表明 psbA-trnH序列可
准确鉴定酸模属植物;NJ树显示除巴天酸模和皱叶酸模聚为一支，其余酸模属植物表现出良好的单系性。结论:psbA-trnH
序列可用于鉴定酸模属植物，为酸模属植物的临床安全用药提供依据。
关键词 酸模属;DNA条形码;psbA-trnH序列;鉴定
中图分类号:Ｒ282． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2016)08-1432-04
Identification of Several Ｒumex Plants Using psbA-trnH Sequence
Guo Hui1，Jia Liwei1，Wang Qianbo2，Zhou Bo1，Wang Zhenyue1(1． Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，
China;2． Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University)
ABSTＲACT Objective:To identify Ｒumex acetosa，Ｒumex crispus，Ｒumex patientia，Ｒumex gmelinii and Ｒumex japonicus using
psbA-trnH barcodes． Methods:Genomic DNA from twenty-four samples was extracted and the psbA-trnH regions were amplified se-
quenced． The genetic distances were calculated using MEGA 6． 0 in accordance with Kimura 2-parameter (K2P)model and the neigh-
bor-joining (NJ)phylogenetic tree was constructed． Ｒesults:The results revealed that the intraspecific genetic distances of Ｒumex L．
were lower than the interspecific genetic distances． The identification efficiency of psbA-trnH barcode using BLAST1 was high． The NJ-
tree showed that Ｒumex L． could be identified according to their monophyly except Ｒumex patientia and Ｒumex crispus． Conclusion:
PsbA-trnH barcode can be used to identify Ｒumex L． The study provides scientific foundation for the clinical safe use of traditional Chi-
nese medicines．
KEY WOＲDS Ｒumex L．;DNA barcoding;psbA-trnH Sequence;Identification
酸模属为蓼科第二大属，该属植物资源丰富，全
球约有 200 余种，我国产 26 种，2 个变种［1］。其中
毛脉酸模 Ｒumex gmelinii Turcz． ex Ledeb． 、巴天酸
模 Ｒumex patientia L． 、皱叶酸模 Ｒumex crispus L． 等
11 种民间作为“土大黄”使用。我国酸模属植物资
源丰富，且具有一定的药用价值，该属中有效成分主
要含有蒽醌类、萘醌类、二苯乙烯类、黄酮类及酸模
素等化学成分［2 ～ 4］。现代药理研究结果表明酸模属
植物中有效成分具有明显抗肿瘤、抗真菌、抗氧化、
清热解毒、镇咳消肿等多种功效［5 ～ 7］。
DNA条形码分子鉴定技术是利用一段两端相
对保守中间变异足够大且短的基因片段对物种进行
准确快速的识别鉴定方法［8 ～ 10］。该技术不受药材
形态特征及发育阶段的影响，同时具有鉴定准确、快
速和通用性强等优点。目前，DNA 条形码鉴定技术
在中药材鉴定中已取得了革命性突破，在人参、黄
芪、升麻等名贵中药材中取得成功的鉴定结
果［10 ～ 13］。基于以上优点中药材 DNA 条形码鉴定
指导原则已列入中国药典 2015 年版补增本中。该
指导原则规定以核内转录间隔区 ITS2 序列作为中
药材鉴定的核心条形码，psbA-trnH间隔区作为辅助
条形码。同时，psbA-trnH片段在蕨类植物［14］、忍冬
科［15］、石斛属［16］等药用植物中得到验证。
目前，国内外研究学者对酸模属分子鉴定方向
研究相对较少。Song 等［17］利用 psbA-trnH 基因转
录间隔区成功鉴定蓼科 18 种中药材植物，发现 ps-
bA-trnH序列在该科的鉴定成功率达到 100%。但
是，上述研究在该属植物中仅选取了酸模作为代表，
并未对该属中其他植物进行系统分类学鉴定研究。
本文对酸模属 6 种植物运用 DNA 条形码分子鉴定
技术进行了比对研究，为酸模属植物的系统分类学
研究提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
本试验所研究的材料共计 6 个物种 32 份植物
样本，包括 24 份试验样品和 8 条 Genbank序列。采
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表 1 样品及序列信息表
中文名 拉丁名 凭证样本号 Genbank登录号 样本数 样品来源
酸模 Ｒ． acetosa QH001SM01 ～ 05 KU945380-KU945384 5 黑龙江清河
皱叶酸模 Ｒ． crispus QH002ZY01 ～ 03MJ002ZY04
KU945385-KU945387
KU945388 4 黑龙江清河、马家沟
巴天酸模 Ｒ． patientia
QH003BT01 ～ 06
MJ003BT01 ～ 02
YY003BT01 ～ 04
KU945389-KU945394
KU945395-KU945396
KU945397-KU945400
12
黑龙江清河、
马家沟、
黑龙江中医药大学药用植物园
长刺酸模 Ｒ． trisetifer MJ004CC01 ～ 02 KU945402-KU945403 2 黑龙江马家沟
毛脉酸模
羊蹄酸模
Ｒ． gmelinii
Ｒ． japonicus
YY005MM01 KU945401
EU554054
1
1
黑龙江中医药大学药用植物园
GenBank下载
集于帽儿山和清河等地，详细信息见表 1。经黑龙
江中医药大学中药资源与开发教研室主任王振月教
授鉴定为酸模属植物，标本均保存于黑龙江中医药
大学药用植物园标本室。
1． 2 DNA提取
取酸模属药材样品用 75%乙醇擦洗新鲜植物
表面，自然干燥后，经液氮进行充分研磨。取粉末约
50 mg加入 700 μLDNA裂解缓冲溶液，在 56℃条件
下水浴过夜。使用天根植物基因组 DNA 提取试剂
盒(Tiangen Biotech Co，China)提取植物总 DNA。
提取过程参考中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原
则及试剂盒说明书做适当调整［18］。
1． 3 PCＲ扩增及测序
psbA-trnH序列所用通用引物及反应条件参照
《中药 DNA 条形码分子鉴定》［19］。PCＲ 扩增反应
体系为 25 μl，包含 1 × PCＲ buffer(无 Mg2 +) ，2． 0
mmol·L-1 MgCl2，0． 2 mmol·L
－1 dNTP 混合物，正
反向引物0． 1 μmol·L －1(上海生工生物工程股份有
限公司合成)和1． 0 U TaqDNA 聚合酶。PCＲ 产物
取 5 μl，以 1 × TAE为电泳缓冲溶液进行0． 8%琼脂
糖凝胶电泳。由北京金唯智基因组研究中心有限公
司进行双向测序。
1． 4 数据处理
获得的测序峰图使用 CodonCode Aligner 3． 7． 1
(CodonCode Co． USA)软件进行校对、拼接、去除引
物区和低质量部分获得 psbA-trnH 序列。对拼接后
的序列使用 MEGA 6． 0(molecular evolutionary genet-
ics analysis)进行比对分析，基于 K2P 模型(Kimura
2-parameter model)计算遗传距离、种内和种间变异。
采用相似性搜索法(BLAST1)、最近距离法(nearest
distance)、构建邻接(neighbor-joining tree，NJ Tree)
系统聚类树，对酸模属植物进行鉴定。
2 结果
2． 1 酸模属植物序列特征分析
酸模 4 条序列比对后序列平均长度为 320 bp，
平均 GC含量为26． 97%;皱叶酸模 8 条序列(4 条样
本序列、4 条 Genbank序列)比对后序列平均长度为
343 bp，平均 GC 含量为33． 24%;巴天酸模 15 条序
列(12 条样本序列、3 条 Genbank 序列)比对后序列
平均长度为 324 bp，平均 GC 含量最高为32． 73%;
毛脉酸模 1 条序列长度为 329 bp，平均 GC 含量为
31． 91%;长刺酸模 2 条序列比对后序列平均长度为
319 bp，平均 GC含量为32． 60%;羊蹄酸模 1 条序列
长度为 322 bp，平均 GC 含量为32． 61%。本研究中
酸模属植物序列长度大约在 330 bp 左右，序列长度
差异较小，且序列足够短，便于 PCＲ扩增。
2． 2 酸模属植物种内种间遗传距离分析
2． 2． 1 种内遗传距离分析 基于 K2P 模型计算遗
传距离，psbA-trnH 序列种内种间平均 K2P 距离见
表 2。酸模 psbA-trnH 序列种内平均 K2P 距离为
0． 007，种内最大 K2P 距离为0． 012 7;其余皱叶酸
模、巴天酸模、长刺酸模的种内平均 K2P距离为 0。
表 2 酸模属植物 psbA-trnH序列和
种内种间遗传距离信息表
物种名 序列长度 平均
GC
含量(%)
种内 K2P距离
(平均值)
种间 K2P距离
(平均值)
酸模 317 ～ 327bp 26． 97 0． 007 0． 1163
皱叶酸模 342 ～ 343bp 33． 24 0 0． 0005
巴天酸模 324bp 32． 72 0 0． 0009
长刺酸模 319bp 32． 60 0 0． 0225
毛脉酸模 329bp 31． 91 0 0． 0238
羊蹄酸模 322bp 32． 61 0 0． 0189
2． 2． 2 种间遗传距离分析 酸模与同属其余 5 种
植物 psbA-trnH 序列种间平均 K2P 遗传距离为
0． 116 3，种间最小 K2P遗传距离为0． 112 8，大于种
内最大 K2P 遗传距离;毛脉酸模与其余酸模植物
psbA-trnH序列种间平均 K2P 遗传距离为0． 023 8，
种间最小 K2P 遗传距离为0． 003 1，大于种内最大
K2P遗传距离;羊蹄酸模和长刺酸模与其余酸模植
物 psbA-trnH 序列种间平均 K2P 距离为0． 018 97，
0． 022 5;巴天酸模和皱叶酸模与其余酸模植物 ps-
bA-trnH 序列种间平均 K2P 距离为 0． 000 9 和
0． 000 5，均大于种内最大 K2P遗传距离。
2． 3 酸模属植物系统发育邻接树(NJ树)鉴定
为了更直观的体现鉴定结果，本文基于 psbA-
trnH序列构建了酸模、毛脉酸模、皱叶酸模、巴天酸
模、长刺酸模和羊蹄酸模的系统发育邻接树，见图
3341
中国药师 2016 年第 19 卷第 8 期 China Pharmacist 2016，Vol． 19 No． 8
1。结果表明，酸模、羊蹄酸模各自聚为一支。毛脉
酸模和长刺酸模形成 1 个独立分支。巴天酸模和皱
叶酸模聚在一支上，且能与酸模、毛脉酸模、长刺酸
模、羊蹄酸模区分开。因此 psbA-trnH 序列可以鉴
别酸模、长刺酸模、羊蹄酸模、毛脉酸模，但对巴天酸
模和皱叶酸模未起到很好的鉴定效果。
Bootstrap 1000 次重复，仅显示支持率≥60%的分支
图 1 基于 psbA-trnH序列构建酸模、皱叶酸模、
巴天酸模、长刺酸模、毛脉酸模、羊蹄酸模的 NJ树
3 讨论
植物学和药理的研究表明，酸模属植物能产生
很多有生物活性的次生代谢产物。如萘类化合物、
类固醇、酚酸，具有抗炎、抗病毒等效果［20］。但是，
国外有研究报告显示在一些酸模属植物中含有较高
的草酸类物质，大量使用会引起中毒反应［21］。这对
我国酸模属植物的研究与开发具有指导意义。基于
psbA-trnH序列构建的 NJ系统发育树以及种内种间
遗传距离分析，证实 psbA-trnH 条形码能够准确的
区分并鉴定 4 种酸模属植物。宋经元等［17］利用
DNA条形码分子鉴定技术，数据表明 psbA-trnH 序
列可快速、准确的分辨 18 种蓼科药典中药材以及 8
种形态相似非药典混伪品。
酸模属植物的种内、种间遗传距离分析表明，本
试验研究该属所有植物中种间平均 K2P 距离均大
于种内平均 K2P 距离。由 NJ 树可知，酸模以 99%
的支持率聚为一支，毛脉酸模、长刺酸模以 65%的
支持率聚为一支，巴天酸模、皱叶酸模以 64%的支
持率聚为一支。表明 psbA-trnH 序列适合区分酸
模、毛脉酸模、羊蹄酸模等几种酸模属药用植物。巴
天酸模和皱叶酸模两者在形态学上极为相似，且在
分类界定一直存在争议。本研究结果表明两者在系
统发育树中聚为一支，在分子水平上证明两者的亲
缘关系较近。
本试验研究所选取的试验材料为酸模属植物叶
片，叶片中的化学成分如挥发油、多糖和酚类化合物
含量较少，在试验过程中提取 DNA 较为容易，主要
注意以下几点:①选取的植物叶片是经过硅胶干燥
的叶片，其 DNA 含量会有降解，因此需要适当加大
样本量，本研究中经过多次比较发现取样量为 50mg
的效果较好;②延长水浴时间，有利于细胞裂解和
DNA溶出，试验过程中发现 56℃水浴过夜效果最
好;③DNA 沉淀步骤中，用-20℃预冷的异丙醇沉淀
DNA，放入 － 20℃冰箱中预冷 15min，有利于 DNA
充分沉淀。此外，为验证序列的正确性，将序列与
GenBank数据库进行比对，显示序列均为准确序列，
无真菌污染现象。
蓼科酸模属植物来源较多，且药用资源丰富。
但该属部分临床应用缺乏品种标准和鉴定，且有药
理研究不明和不相符之处。虽然该属在民间广泛应
用，并且取得了部分临床疗效。但是，无论在现代药
理研究还是临床应用方面都应注重品种鉴定工作。
因此对该属植物进行系统分类学研究，能有利于规
范酸模属植物研究，保持该属植物品种的一致性。
参 考 文 献
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基金项目:国家自然科学基金项目(编号:81473417)
通讯作者:姜泓 Tel:13386881143 E-mail:
櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊
jianghong@ mail． com． cn
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(2016-04-11收稿 2016-05-20修回)
甘草次酸对雄黄染毒小鼠体内活性硫水平的影响
苑洁1． 2 霍韬光2 封聪2 袁明美2 王守云2 姜泓2 (1．贵州省疾病预防控制中心 贵阳 550004;2． 中国医科大
学公共卫生学院)
摘 要 目的:建立 HPLC法测定小鼠血浆、脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及睾丸中的活性硫水平。方法:70 只 ICＲ 小鼠
随机分为对照组，低、中、高剂量雄黄组，甘草次酸对照组，甘草次酸低、高剂量干预组，每组 10 只，灌胃给药，每日 1 次，共染毒
8 周。采用 HPLC法检测染毒后小鼠血浆、脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及睾丸组织中的活性硫含量。结果:与对照组相
比，雄黄高剂量组血浆、脑、肝脏、肾脏中活性硫水平显著降低(P ＜ 0． 05) ;与雄黄高剂量组相比，甘草次酸高剂量干预组血浆、
脑、肝脏、肾脏的活性硫水平明显升高(P ＜ 0． 05) ，甘草次酸低剂量干预组血浆的活性硫水平明显升高(P ＜ 0． 05)。结论:该
方法简便、准确，灵敏度高。甘草次酸对雄黄所引起的血浆、脑、肝脏、肾脏中活性硫水平的降低有明显的保护作用。
关键词 甘草次酸;雄黄;活性硫;高效液相色谱法
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2016)08-1435-05
Effect of Glycyrrhetinic Acid on Active Sulfur Level in Ｒealgar-poisoned Mice
Yuan Jie1，2，Huo Taoguang2，Feng Cong2，Yuan Mingmei2，Wang Shouyun2，Jiang Hong2(1． Guizhou Center for Disease Control and
Prevention，Guiyang 550004，China;2． School of Public Health China Medical University)
ABSTＲACT Objective:To establish an HPLC method for the determination of active sulfur level in plasma，brain，heart，liver，
spleen，lung，kidney and testis of mice．Methods:Totally 70 ICＲ mice were randomly divided into the control group，realgar groups
respectively at low，medium and high dosage，glycyrrhetinic acid control group，glycyrrhetinic acid intervention groups respectively at
low and high dosage (n = 10)with 10 ones in each，intragastric administration，once a day，and poisoned for 8 weeks． HPLC was
used to determine the content of active sulfur in plasma，brain，heart，liver，spleen，lung，kidney and testis of mice． Ｒesults:Com-
pared with those in the control group，the levels of active sulfur in plasma，brain，liver and kidney in realgar high dose group were sig-
nificantly reduced (P ＜ 0． 05)． Compared with those in realgar high dose group，the levels of active sulfur in plasma，brain，liver and
kidney in glycyrrhetinic acid high dose intervention group were significantly increased (P ＜ 0． 05)and those in plasma in glycyrrhetinic
acid high dose intervention group were significantly increased as well(P ＜ 0． 05)． Conclusion:The method is simple，accurate and
sensitive． Glycyrrhetinic acid has obvious protective effect on the level decrease of active sulfur in plasma，brain，liver and kidney
caused by realgar．
KEY WOＲDS Glycyrrhetinic acid;Ｒealgar;Active sulfur;HPLC
甘草次酸(glycyrrhetinic acid)是甘草的主要成
分甘草酸及其盐(即甘草甜素)在体内的代谢产物，
是甘草发挥药效的主要有效成分。研究表明，甘草
次酸具有抗肿瘤、抗炎抗病毒、免疫调节及抗氧化等
诸多药理活性［1］。中医药学的研究表明，甘草对雄
黄有配伍解毒的效应［2］。活性硫广泛参与神经系
统、消化系统、氧化应激、细胞代谢、炎症反应及癌症
等众多病理生理调节过程，在生物体内发挥着重要
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中国药师 2016 年第 19 卷第 8 期 China Pharmacist 2016，Vol． 19 No． 8