全 文 ：第 30 卷 第 2 期 浙 江 林 业 科 技 Vol. 30 No.2
2 0 1 0年 3月 JOUR. OF ZHEJIANG FOR. SCI. & TECH. Mar., 2 0 1 0

文章编号：1001-3776（2010）02-0022-04

景宁木兰与木兰属其它植物之间亲缘关系与遗传基础研究

蒋燕锋 1，刘 饶 2，斯金平 1*
（1. 浙江林学院 林业与生物技术学院，浙江 临安 311300；2. 浙江省景宁县科技开发服务部，浙江 景宁 323500）

摘要：采用 ISSR（Inter simple sequence repeat）分子标记研究景宁木兰（Magnolia sinostellata）与 17个木兰科木兰
属其它植物之间的亲缘关系，揭示景宁木兰的遗传基础。在本试验条件下，从 120个 ISSR引物中筛选出 20个具有
多态性的引物，共检测到 178条清晰的条带，其中 163条具有多态性，占 91.60%。通过 POPGENE 32软件分析，除
了木兰亚属的山玉兰独自成一类外，符合赫钦生的木兰属分类系统：厚朴、广玉兰及其变种为木兰亚属一类，其
余包括景宁木兰、天目木兰、武当木兰等为玉兰亚属一类；玉兰与辛夷的杂交种二乔木兰与辛夷的遗传距离最近，
为 0.231 4，与玉兰的遗传距离也只有 0.316 7；木兰属内遗传距离最近的为天目木兰与日本辛夷，为 2.232 1，遗
传距离最远的为山玉兰与日本辛夷，为 0.736 9；景宁木兰与本属其它植物间的遗传距离在 0.278 2 ~ 0.610 9，其中
与天目木兰的遗传距离最近，为 0.278 2，与山玉兰的遗传距离最远，为 0.610 9。这表明景宁木兰具有其特有的遗
传基础，且与天目木兰亲缘关系最近。
关键词：景宁木兰；ISSR；遗传关系
中图分类号：S718.3 文献标识码：A

Study on Genetic Relation among Magnolia sinostellata and
Other Species of Magnolia

JIANG Yan-feng1，LIU Rao2，SI Jin-ping1
（1. School of Forestry and Biological Technology, Zhejiang Forestry University, Lin’an 311300, China;
2. Jingning Science and Technology Extension Station of Zhejiang, Jingning 323500, China）

Abstract: Study was conducted on genetic relation among Magnolia sinostellata and other 16 species of Magnolia by inter simple sequence repeat
(ISSR). 20 polymorphism primers were selected from 120 primers, and 193 bands were detected, of which 160 polymorphism. POPGENE 32 was
used to calculate the genetic distance among these plants. Result showed that the polymorphism ratio was 82.90%, and the distance between M.
sinostellata and other Magnolia ranged from 0.278 2 ( M. amoena) to 0.610 9(M. delavayi).Unweighted pair-group mean analysis (UPGMA) grouped
them into three clusters: M. amoerna; M. officinalis, M. grandiflora and their varieties; M. sinostellata, M. amoena, M. sprengeri and so on. The
results suggested that M. sinostellata had close genetic relation with M. amoena, M. kobus and M. zenii.
Key words: Magnolia sinostellata; ISSR; genetic relation

景宁木兰（Magnolia sinostellata）是 1984年发现、1989年定名的木兰属新种[1~2]，原分布区十分狭窄，至
今仅在浙江省景宁畲族自治县东坑镇大张坑村与景宁林业总场草鱼塘林场交界处（29.9° N、119.6° E）发现有自
然分布，整个分布区约 25 hm2，集中分布区仅 0.2 hm2，种群数量少，刚发现时约有 120株（丛），因该种具有
收稿日期：2009-11-20；修回日期：2010-02-08
基金项目：浙江省重大科技计划项目（2005C32052）
作者简介：蒋燕锋（1984－），男，浙江嘉兴人，硕士研究生，从事药用植物遗传研究；*通讯作者。

2期 蒋燕锋，等：景宁木兰与木兰属其它植物之间亲缘关系与遗传基础研究 23

较高的观赏价值，后因一些个体木兰园和养花爱好者盲目乱挖，现存野生植株约 60株（丛），使该种刚刚发现
就濒临灭绝。景宁木兰的资源现状及保护价值[3]在第一届国际木兰大会交流后引起有关专家的高度重视，被大
会列为最有闪光点的报告之一[4]。浙江省也将该种列入珍稀濒危植物名录。本文采用 ISSR[5]（Inter simple sequence
repeat）分子标记技术研究景宁木兰与木兰属其它植物之间的亲缘关系，揭示景宁木兰的遗传基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为植物嫩芽。于杭州植物园采集 17种木兰科木兰属植物以及浙江景宁林业总场草鱼塘林场的景宁
木兰嫩叶（表 1），用硅胶干燥，－70℃冰箱存放备用。
表 1 实验材料
Table 1 Test material
编号 样品 种源 编号 样品 种源
1 山玉兰Magnolia delavayi 云南 10 二乔木兰M. soulangeana 浙江
2 狭叶荷花玉兰M. grandiflora var. lanceolata 上海 11 景宁木兰M. sinostellata 浙江
3 宝华玉兰M. zenii 江苏 12 厚朴M. officinalis 浙江
4 武当玉兰M. sprengeri 湖南 13 凹叶厚朴M. officinalis subsp. biloba 广西
5 华中玉兰M. biondii 山东 14 广玉兰M. grandiflora. 上海
6 玉兰M. denudata 浙江 15 红花日本木兰M. stellata var. rosea 江苏
7 辛夷M. liliflora 河南 16 狭萼辛夷M. liliflora var. gracilis 河南
8 日本辛夷M. kobus 日本 17 黄山木兰M. cylindrical 安徽
9 天目木兰M. amoena 浙江
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）—硅珠吸附法提取植物基因组 DNA[6]，用 NanoDrop
微量分光光度计（ND-1000）测定 DNA的纯度和浓度。同时每个样品取 5μL，加 1μL上样缓冲液混合后，于
0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测[6]，在凝胶成像系统（Gel DocTM，Bio-Rad）下观察并照相。
1.2.2 PCR扩增 扩增体系参考陈亮明等广玉兰 ISSR-PCR反应体系[7]，20μL体系：50 ng DNA模板，0.5μ
mol/L ISSR引物，100.0μmol/L dNTPs，1.5 mmol/L氯化镁，1U Taq DNA聚合酶，10×PCR反应缓冲液。PCR
反应程序：94℃预变性 5.0min；94℃变性 30 s，引物最适退火温度退火 40 s；72℃延伸 50 s，35个循环；72℃
延伸 5.0 min。PCR 扩增产物于 10.0 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测并于凝胶成像系统拍照分析。本实验在
Perkin-Elmer 9700（PE9700）扩增仪上进行。
1.2.3 引物筛选 所用 ISSR引物参考加拿大 UBC大学提供的引物序列，由上海生工生物工程技术服务有限公
司合成。引物先用一个模板 DNA从 100个 ISSR引物中初筛。然后用 4个模板 DNA进行复筛，筛选出条带清
晰而且具有多态性的引物，用于正式的 PCR扩增[8]。
1.2.4 数据统计与分析 同一引物，同一位点，根据扩增产物的有（1）无（0）得到二元资料，形成 0,1矩阵。
用 POPGENE32软件[9]进行分析，计算遗传相似系数，运用 UPMGA法构建树状聚类图。
2 结果与分析
2.1 基因组 DNA 结果检测与分析
获取高质量的基因组 DNA是实验成功的关键步骤之一。本实验采用 CTAB—硅珠法从植物嫩芽中提取模板
DNA，经过琼脂糖凝胶电泳检测，发现条带十分清晰而且明亮无拖尾、背景干扰等现象，表明蛋白质等杂质去
除较干净，纯度较高，经测定 260/280比值在 1.8左右，其浓度、纯度均符合实验要求。
2.2 ISSR 引物筛选分析
随机用 1个样品对 120个引物进行筛选，结果有较多引物都有扩增，每个引物可扩增出 1 ~ 15条带不等；
再次对条带清晰、主带明显的初筛引物进行筛选，最终选用的 20个引物（见表 2）反应稳定、扩增性强和重复

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性好。
2.3 ISSR 多态性分析
筛选出的 20 个引物共检
测到 178条带，平均每条引物
扩增出 8.9条带，ISSR扩增片
段大约集中在 300 ~ 1 500 bp。
其中 163条带表现为多态性，
占总条带数的 91.6%。扩增出
条带最多的引物为 809，共 12
条；条带最少的是引物 807；
多态性最高的是引物 899，多
态率高达 100%（表 2）。图 1
是引物 810扩增的结果。
表 2 引物序列及其扩增结果
Table 2 Primer sequence and amplification result
引物 序列 5′-3′ 总条
带数
多态性
带数
多态性
百分比/%
引物 序列 5′-3′ 总条
带数
多态性
带数
多态性
百分比/%
810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 11 10 90.91 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 10 7 70.00
815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 9 8 88.89 845 CTCTCTCTCTCTCTCTRG 7 7 100.00
817 CACACACACACACACAA 11 9 81.82 847 CACACACACACACACARC 11 8 72.73
818 CACACACACACACACAG 13 11 84.63 848 CACACACACACACACARG 12 11 91.67
821 CACACACACACACACAT 10 9 90.00 850 GTGTGTGTGTGTGTGTYC 7 5 71.43
822 TCTCTCTCTCTCTCTCA 8 8 100.00 857 ACACACACACACACACYG 12 10 83.33
824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 15 13 86.67 858 TGTGTGTGTGTGTGTGRG 6 4 66.67
825 ACACACACACACACACT 7 6 85.71 873 GACAGACAGACAGACA 11 9 81.82
827 ACACACACACACACACG 9 8 88.89 899 CATGGTGTTGGCATTGTTCCA 9 6 66.67
828 TGTGTGTGTGTGTGTGA 9 7 77.78 900 ACTTCCACAGGTTAACACA 6 4 66.67
2.4 遗传距离聚类分析
利用聚类分析软件 POPGENE 32对 ISSR-PCR扩增所得的多态性位点进行分析，计算得到 17个样品的Nei’s
遗传距离[10]及遗传相似矩阵（图 2）。从聚类结果可以看出，17 个样本在系数为 0.6 左右明显可分为 3 类：第
一类仅有山玉兰；第二类由厚朴及其变种凹叶厚朴和广玉兰及其变种狭叶荷花玉兰组成；第三类则包含景宁木
兰、天目木兰、日本辛夷、宝华玉兰及其余的木兰科植物。
与形态学分类对比分析，除了木兰亚属的山玉兰独自成一类外，符合赫钦生的木兰属分类系统：厚朴、广
玉兰及其变种为木兰亚属一类，其余包括景宁木兰、天目木兰、武当木兰等为玉兰亚属一类；玉兰与辛夷的杂
bp
2000
1000
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
序号 1～17同表 1，下同
图 1 引物 810 扩增结果
Figure 1 Amplification result with primer of 810
图 2 木兰科植物遗传聚类图
Figure 2 Dedrogram of 17 species of Magnolia
1
2
12
13
14
3
8
9
11
6
7
10
5
4
15
16
17
0.820.760.690.62 0.56

2期 蒋燕锋，等：景宁木兰与木兰属其它植物之间亲缘关系与遗传基础研究 25

交种二乔木兰与辛夷的遗传距离最近，为 0.231 4，与玉兰的遗传距离也只有 0.316 7。木兰属内遗传距离最近的
为天目木兰与日本辛夷，为 0.232 1，遗传距离最远的为山玉兰与日本辛夷，为 0.736 9。景宁木兰与本属其它植
物间的遗传距离在 0.278 2 ~ 0.610 9，其中与天目木兰的遗传距离最近，为 0.278 2，与山玉兰的遗传距离最远，
为 0.610 9。表明景宁木兰具有其特有的遗传基础，且与天目木兰亲缘关系最近。
3 讨论
景宁木兰喜温暖湿润、水分充足的环境，其树形呈灌木状，丛生，叶片较小，特别是花被轮多数、花被片
数量多，颜色紫红色至淡红色，且株间存在较大差异，花被片倒披针形或倒卵状匙形，不仅具有直接园艺开发
的价值，而且具有木兰科植物间杂交、景宁木兰自身诱变育种等诸多方面的价值。
分子标记技术用于种质鉴定具有不受栽培环境影响的优势，对珍贵濒危的景宁木兰的遗传结构和遗传地位
的研究具有非常重要的意义。
本研究运用 ISSR分子标记技术对景宁木兰与其它 17种木兰属植物的遗传结构研究表明，木兰属内各植物
之间具有较大的遗传差异，遗传基础较宽。厚朴及其变种凹叶厚朴和广玉兰及其变种狭叶荷花玉兰之间遗传距
离较近；二乔木兰、辛夷（紫玉兰）和玉兰三者间的遗传距离也比较近，这与其形态特征的相似相对应，特别
是二乔木兰，是辛夷与玉兰的杂交种。相比之下，景宁木兰与山玉兰的遗传距离最远，亲缘关系较远，而与天
目木兰的遗传距离最近，亲缘关系也最近。

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