全 文 ：Vol. 29 No.4
Dec. 2011
第 29 卷 第 4 期
2011 年 12 月
经 济 林 研 究
Nonwood Forest Research
正交设计优化柿属植物 SSR-PCR 反应体系
梁玉琴 1，李芳东 1，傅建敏 1，乌云塔娜 2，吴 硕 1
(1. 中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；
2. 中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004)
摘 要： 为了快速有效地确定柿属植物 SSR-PCR 反应体系，给柿属植物遗传多样性的 SSR 标记研究奠定基础，
采用正交设计的方法，利用 2×Taq PCR Master Mix，将 Taq 酶、dNTPs 和 Mg2+ 3 个因素作为整体，综合评价其
对柿属植物 SSR-PCR 反应体系的影响。结果显示：反应各因素水平对 PCR 反应均具有显著影响，其中 Mix 影
响最大，引物次之，模板 DNA 最小；确定柿属植物 SSR-PCR 反应体系为模板 DNA 2 μL(40 ～ 100 ng)、2×Taq
PCR Master Mix 10 μL、引物 1 μL，总体积 25 μL；反应体系具有较高的重复性和稳定性，筛选出 20 对多态性较
高的柿属植物 SSR 引物。
关键词： 柿属植物；正交设计；SSR-PCR 反应体系；2×Taq PCR Master Mix
中图分类号： S665.2; S718.46 文献标志码： A 文章编号：1003—8981(2011)04—0017—06
Optimization for SSR-PCR reaction system of Diospyros L. trees by
orthogonal design method
LIANG Yu-qin1, LI Fang-dong1, FU Jian-min1, WU YUN Ta-na2, WU Shuo1
(1. Non-timber Forest Research and Development Center, Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, Henan, China;
2. The Key Lab of Non-wood Forest Product of Forestry Ministry, Central South University of Forestry & Technology,
Changsha 410004, Hunan, China)
Abstract: In order to rapidly and effectively determine SSR-PCR reaction system of Diospyros L. trees and lay a
foundation for the studies on genetic diversity of Diospyros L., the effects of Taq DNA polymerase, dNTPs and Mg2+ as
a whole on SSR-PCR reaction system of Diospyros L. trees were evalued synthetically, using 2×Taq PCR Master Mix
by orthogonal design method. The results showed that the effects of every levels of each factor on PCR reaction were all
signifi cant. The most remarkable factor was 2×Taq PCR Master Mix, the least one was DNA template and the middle one
was primer. The best SSR-PCR reaction system for Diospyros L. trees was DNA template 2 μL(40-100 ng), 2×Taq PCR
Master Mix 10 μL, primer 1 μL with the totoal volume of 25 μL. The PCR reaction system had high repeatability and
stability, and 20 pairs of SSR primers with high polymorphism were gotten.
Key words: Diospyros L.; orthogonal design; SSR-PCR reaction system; 2×Taq PCR Master Mix
收稿日期：2011-09-12
基金项目：林业公益性行业科研专项项目“柿属植物种质资源保护与选育技术研究”(200904041)。
作者简介：梁玉琴 (1986— )，女，山东烟台人。硕士研究生，研究方向为经济林栽培育种。E-mail：yqliang1986@126.com。
通讯作者：李芳东 (1963— )，男，河南太康人。研究员，博士，主要从事经济林育种与栽培方面的研究。E-mail：lifangdong66@163.com。
DOI:10.14067/j.cnki.1003-8981.2011.04.009
18 第 4 期梁玉琴，等：正交设计优化柿属植物 SSR-PCR 反应体系
柿属 Diospyros L. 植物在我国分布范围广泛，种
质资源丰富多样，其中作为果树栽培的主要是柿 D.
kaki、浙江柿 D. glaucifolia、美洲柿 D. virginiana、
君迁子 D. lotus、油柿 D. oleifera 等 [1]，尤其以柿的
综合经济开发价值最高 [2]。柿作为原产于我国的重
要经济林树种，研究其遗传多样性及其与柿属其它
植物的亲缘关系，对柿栽培育种、良种选育等工作
具有重要意义。SSR(Simple senquence repeat，简单
序列重复 ) 标记是在 PCR 基础上发展起来的分子标
记，SSR 又称为微卫星，广泛分布于真核生物基因
组中，数量极其丰富、多态性高、共显性、品种间
差异大，且操作简单、稳定性好，是目前四大分子
标记之一 [3-5]。目前，国内外应用 SSR 分子标记技
术研究柿属植物种质资源遗传多样性，鉴定柿品种
资源，分析柿属植物亲缘关系等方面的研究报道较
少。确定PCR反应体系是SSR分子标记工作的基础，
通常分别研究 Taq 酶、dNTPs、Mg2+、模板 DNA、
引物共 5 个因素对 SSR-PCR 扩增的影响 [6-7]，然而
分别研究其对柿属植物 SSR-PCR 反应体系的影响
时，试验处理数量多、工作量大，笔者利用 2×Taq
PCR Master Mix将Taq 酶、dNTPs和Mg2+ 作为整体，
综合评价其对柿属植物SSR-PCR反应体系的影响，
与模板 DNA、引物一起，只设置 3 个因素，以期
简化操作步骤、节约时间、提高效率，并确定柿属
植物 SSR-PCR 反应最佳体系，筛选出多态性较高
的 SSR 引物，为柿属植物遗传多样性的 SSR 标记
研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以君迁子雌 -07、诏安元宵柿、金瓶柿、火罐
柿、摘家烘、藤八、禅寺丸、次郎、库梅共 9 个
柿属植物种质资源为试验材料，于 6 月下旬采摘
当年生已展开的成熟嫩叶，液氮保存带回实验室，
置于 -70 ℃条件下保存，以备提取 DNA 用于试验。
1.2 柿属植物基因组 DNA 提取
采用改良 CTAB 法提取柿属植物基因组
DNA，采用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA 质
量，-20 ℃保存 DNA 样品以备用，其中君迁子雌
-07 用于 SSR-PCR 反应体系的优化，其余 8 个样
品用于反应体系的验证及引物筛选。
1.3 PCR 反应因素确定及正交设计
利用购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司的
2×Taq PCR Master Mix，将 Taq 酶、dNTPs 和 Mg2+
3 个因素作为整体，综合评价其对柿属植物 SSR-
PCR 反应体系的影响。确定 PCR 反应影响因素
为模板 DNA、2×Taq PCR Master Mix、引物，各
因素水平见表 1，选择 L9(34) 正交设计方案 ( 见表
2)，每个处理重复 3 次，其中 DNA 样品质量浓度
为 20 ～ 50 ng/μL，引物浓度为 10 μmol/L，引物由
南京金斯瑞神武科技有限公司合成。
表 1 柿属植物SSR-PCR反应体系的因素水平
Table 1 The levels of factors in Diospyros L. SSR-PCR
reaction system
因素 Factor
水平 Level
1 2 3
模板 DNA Template DNA 1 2 3
Master Mix 8 9 10
引物 Primer 0.6 0.7 0.8
表 2 PCR反应因素水平的L9(34)正交试验设计
Table 2 L9(34)Orthogonal design for the factors and levels
in PCR reaction
编号 No. 模板 DNA Template DNA Master Mix 引物 Primer
1 1 8 0.6
2 1 9 0.7
3 1 10 0.8
4 2 10 0.6
5 2 8 0.7
6 2 9 0.8
7 3 9 0.6
8 3 10 0.7
9 3 8 0.8
1.4 SSR-PCR 扩增及产物检测
根据表 2 中各处理进行 PCR 扩增，反应总体
积为 25 μL，不足的用 ddH2O 补充。PCR 循环体
系为 94 ℃预变性 2 min；94 ℃变性 45 s，55 ℃退
火 1 min，72 ℃延伸 75 s，共 35 个循环；72 ℃总
延伸 5 min[8]； 4 ℃保存扩增产物。
2% 琼脂糖凝胶电泳预检测 PCR 扩增产物后，
再利用 6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，利用 Du Red 荧光
染色液对凝胶染色 1 h，然后利用 Bio-Red 凝胶成
像系统观察、照相。
μL
μL
19第 29 卷 经 济 林 研 究
1.5 反应体系的验证及引物筛选
从已发表文献搜索得到柿属植物 SSR 引物 41
对 [9-11]，随机选用引物 ssrDK16 和 ssrDK25，以诏
安元宵柿、金瓶柿、火罐柿、摘家烘、藤八、禅
寺丸、新安次郎、库梅的 DNA 样品为模板进行
SSR-PCR 扩增，6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测 PCR 扩增产物，方法同 1.4，检测反应体系重复
性及稳定性，并筛选出 20 对多态性高、扩增条带
清晰的 SSR 引物，用于后续柿属植物 SSR 标记的
遗传多样性分析。
2 结果与分析
2.1 DNA 提取效果
由图1可以看出，9个样品DNA提取效果很好，
DNA 质量较高，条带清晰完整、无杂带、杂质少、
浓度高。
图 1 DNA提取效果
Fig. 1 DNA extraction effect
图 2 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果
Fig. 2 PCR expansion effect of agarose gel electrophoresis
2.2 PCR 扩增产物检测结果
琼脂糖凝胶电泳结果 ( 见图 2) 显示：9 个处
理 3 次重复共 27 个样品，均得到目的条带，谱带
大小为 150 ～ 250 bp，符合 SSR 扩增要求。可以
初步判断各处理间有一定的差异，3、4、6、7 处
理效果较好，1、2、8、9 处理次之，5 号处理最差，
扩增产物浓度低，条带模糊；且同一处理不同重
复间差异较小。
图 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增效果
Fig. 3 PCR expansion effect of PAGE
聚丙烯酰胺凝胶电泳结果更为精确地区分开 9
个处理的 SSR-PCR 扩增谱带 ( 见图 3)，结果与琼
脂糖凝胶电泳结果一致，且可以看出 3、4 处理在
200 ～ 250 bp 间有微量的杂带，进一步比较判断
可知 6 处理效果最优。
2.3 各因素对 SSR-PCR 反应的影响
根据琼脂糖和聚丙烯胺酰胺凝胶电泳结果，
综合分析各个处理的 PCR 扩增效果后进行评分，
效果最优的记为 9 分，最差的记为 1 分 [12]，依次
类推得到各个样品的得分 ( 如表 3)。
2.3.1 极差分析
根据表 3 中正交设计各处理的评分进行极差
分析，结果见表 4。表 4 中结果显示：3 个因素评
分的极差大小依次为 Master Mix 5.00、引物 3.67、
20 第 4 期梁玉琴，等：正交设计优化柿属植物 SSR-PCR 反应体系
表 3 正交设计9个处理的评分
Table 3 Scores of 9 treatments in orthogonal design
重复
Repeat
各处理的评分 Scores of the treatments
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ⅰ 3 4 8 7 1 9 6 5 2
Ⅱ 3 2 8 7 1 9 6 4 5
Ⅲ 4 5 7 8 1 9 6 3 2
总计 Total 10 11 23 22 3 27 18 12 9
表 4 PCR反应因素正交设计的极差分析
Table 4 Range analysis of PCR reaction factors by orthogonal design
评分项
Score index
反应因素 Reaction factors
A: 模板 DNA B：Master Mix C: 引物
K1 44 22 50
K2 52 56 26
K3 39 67 59
X1 4.89 2.44 5.56
X2 5.78 6.22 2.89
X3 4.33 7.44 6.56
R 1.45 5.00 3.67
表 5 SSR-PCR反应各因素间的方差分析 †
Table 5 Variance analysis of SSR-PCR reaction factors
变异来源 Variation source 自由度 Degree of freedom 平方和 Sum of squares 均方 Mean square F 值 F value Fa
模板 DNA Template DNA 2 9.555 6 4.777 8 5.212 1*
F0.05(2，16)=2.67
F0.01(2，16)=6.23
Master Mix 2 226.000 0 113.000 0 123.272 4**
引物 Primer 2 64.666 7 32.333 4 35.272 7**
误差 Error 16 14.666 7 0.916 7
总计 Total 26 180
† “*”表示在 0.05 水平下有显著差异；“**”表示在 0.01 水平下有极显著差异。
“*”means that there were signifi cant differences at 0.05 level， and “**”means that there were extremely signifi cant differences at 0.01 level .
模板 DNA 1.45，说明 Master Mix 对 SSR-PCR 扩增
效果影响最大，其次是引物，模板 DNA 的影响最
小；3 个因素各水平的得分平均值由高到低依次为
模板 DNA 第 2 水平 (5.78)、Master Mix 第 2 水平
(7.44)、引物第 3 水平 (6.56)，说明 3 个因素的最
佳组合为 A2B2C3，即模板 DNA 用量 2 μL(40 ～
100 ng)、Master Mix 9 μL、引物各 0.8 μL( 终浓
度 0.32 μmol/L )，其结果与电泳结果一致。
2.3.2 方差分析
根据表 3 中各因素水平的 SSR-PCR 扩增效果
得分进行方差分析 (见表 5 )，3 个因素的 F 值由大
到小依次为 Master Mix 123.2724、引物 35.2727、
模板 DNA 5.2121，说明 Master Mix 对 SSR-PCR
扩增效果影响最大，其次是引物，影响最小的是
模板 DNA；3 个因素各水平对 SSR-PCR 反应的影
响均具有显著差异，且 Master Mix 与引物的影响
具有极显著差异。
2.4 反应体系的验证及引物筛选
随机选用柿属植物 SSR-PCR 引物 ssrDK02 与
ssrDK 16 对诏安元宵柿、金瓶柿、火罐柿、摘家烘、
藤八、禅寺丸、新安次郎、库梅 8 个材料的 DNA
样品进行 PCR 扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 PCR
扩增效果，对筛选出的最佳 PCR 反应体系进行验证
实验 ( 见图 4 和图 5)。结果显示：2 对引物的 PCR
扩增谱带清晰、多态性较高、大小在 100 ～ 300 bp
之间，符合 SSR 扩增要求，说明正交设计筛选出的
柿属植物 SSR-PCR 反应体系重复性和稳定性高，可
用于柿属植物 SSR-PCR 扩增。利用该体系从现有的
柿属植物 SSR-PCR 引物中筛选出 20 对稳定性好、
多态性高的引物，用于进一步的柿属植物 SSR 标记
的遗传多样性研究，引物对信息见表 6。
3 结论与讨论
从琼脂糖和聚丙烯酰胺 2 种凝胶电泳图直观
分析，均可看出柿属植物 SSR-PCR 反应体系的最
佳处理为 6 号，效果最差的是 5 号处理。极差和
方差分析结论与 2 种电泳结果相一致，进一步证
实柿属植物 SSR-PCR 最佳反应体系为：模板 DNA
用量 2 μL(40 ～ 100 ng)、Master Mix 9 μL、引物各
0.8 μL( 终浓度 0.32 μmol/L)，其中 Master Mix 对
PCR 反应影响最大，引物次之，模板 DNA 影响最
小；3 个因素各水平间对 PCR 反应效果的影响存
在显著差异，且 Master Mix、引物差异极显著。
试验得到的柿属植物 SSR-PCR 反应体系重复性和
稳定性较好，利用此体系从现有文献发表的柿属
21第 29 卷 经 济 林 研 究
表 6 柿属植物SSR标记引物信息
Table 6 The information of Diospyros L . SSR primers
编号 No. 引物名 Primer name 引物序列Primer frequences(5′-3′)
退火温度
Annealing temperature /℃
目的片段大小
Target fragment size /bp
1 ssrDK26 F:GGGAAATTAAGAGGGAAGAAR:AGGAACTGGATCAGCATAAA 55 160
2 ssrDK37 F:CAAAATGAAGCCCATAAGACR:GTGAAAGTGTGGTTGGATTT 56 160
3 ssrDK01 F:CGGCATGAAGGAATAAGGAAR:GCTCACATTCCAACCAATCA 60 165
4 ssrDK02 F:TTAATTTGGACACAAGTTCT R:TCTCTTCAAGTCTTCTATCCT 50 203
5 ssrDK06 F:CGGCATGAAGGAATAAGGAAR:GCTCACATTCCAACCAATCA 60 165
6 ssrDK08 F:GGCATTAGACTTGGCGAAAG R:TTTTTCATCCATGCCACTGA 60 187
7 ssrDK11 F:ATGTTTCAGGGGTTCCATTGR:TCACTCGTCTTTGCCTTTCC 60 161
8 ssrDK12 F:AGATGGAGTGACAGAGACTGR:CCCCTTAAGTCTTAGCTAATTAC 53 165
9 ssrDK13 F:GTAATTAGCTAAGACTTAAGGGG R:TGCTACAACAACTGGAAGAC 53 141
10 ssrDK14 F:GTGAAGGAACCCCATAGAA R:CCATCATCAGGTAGGAGAGA 55 160
11 ssrDK16 F:ACTACAACGGCGGTGAGAAC R:GTCCTTCACTTCCCGCATT 53 153
12 ssrDK25 F:GGGGTAATATGAATTGAATC R:CTCAGAGAGGAGAAGAAATAG 50 253
13 ssrDK29 F:ATCATGAGATCAGAGCCGTC R:CACGTTAACGTTACGGAACA 57 131
14 ssrDK31 F:AGTTCTTGCGATGGGATTTG R:GATGAGATGGGCTGATTGCT 60 190
15 ssrDK33 F:ACAGGGCACGAACAGATGAC R:GCAAAATGGTCTGGACTGCT 60 240
16 mDP13 F:ATGACGACAAGCCAGTTGGG R:TTGCTTGTTCTGGTTGGTTG 55 250
17 mDP15 F:ACACCCCTTCTTTTATAC R:ATCCAGGAGGGCAAAGAACT 50 116
18 mDP18 F:TACTACTGATCTACCAAGTC R:GGATCAGAAGCCCAGTTCAA 55 252
19 mDP19 F:TCAATCTCACATAGTAGGATTAAGGA R:TGACTATGGGGGTCCACTTC 48 261
20 mDP21 F:ACCGGCAGACAAATTCAATC R:AGTCGATGGATGAGGAAAGC 55 215
图 4 引物ssrDK02扩增图谱
Fig. 4 Amplified patterns of primer ssrDK02
图 5 引物ssrDK16扩增图谱
Fig. 5 Amplified patterns of primer ssrDK16
22 第 4 期梁玉琴，等：正交设计优化柿属植物 SSR-PCR 反应体系
植物 SSR 标记引物中，筛选出 20 对稳定性好、多
态性高的引物，用于后续柿属植物 SSR 标记的遗
传多样性研究。
目 前 通 常 以 Taq 酶、dNTPs、Mg2+、 模 板
DNA、引物为主要因素，研究其对 PCR 反应体系
的影响，确定并优化适合试验材料的 PCR 反应体
系。选择5个影响因素，试验处理数量多、工作量大，
2×Taq PCR Master Mix 包含 Taq 酶、dNTPs、Mg2+
及 PCR 反应缓冲液、增强剂、稳定剂等，通过
Master Mix 可以将 Taq 酶、dNTPs、Mg2+3 个因素
作为整体，综合评价其对 PCR 反应的影响，从而
将 5 个影响因素减少至 3 个，大大减少工作量、
提高工作效率，并且缩短 PCR 操作过程，有效防
止样品污染、酶失活等问题的发生。
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[ 本文编校：闻 丽 ]