全 文 ：第 30卷 第 2期 四 川 林 业 科 技 Vo1.30, No.2
2009年 4月 JournalofSichuanForestryScienceandTechnology Apr., 2009
收稿日期:2008-11-14
作者简介:1.殷继艳(1976-),女 ,内蒙古人 ,博士 ,毕业于中国林业科学研究院 ,现就职于中国武警警种指挥学院 ,教员 ,主要研究方向是林
学。
2.张建国(1963-),男 ,甘肃人 ,研究员 ,博士生导师 ,中国林科院林业所党委书记 ,副所长 ,主要研究方向是森林培育。
SSR标记技术在杨属植物研究中的应用
殷继艳 1 ,张建国 2＊
(1.中国武警警种指挥学院,北京 102202;2.中国林业科学研究院林研所 ,国家林业局林木培育重点实验室 100091)
摘 要:SSR标记具共显性和多态性等特点 , 是一种很有价值的分子标记 , 微卫星在林木基因组中广泛存在。本文
综合国内外 SSR标记在杨属植物研究中的应用 ,并探讨了该技术存在的问题及发展趋势。
关键词:杨属植物;SSR标记 ;分子标记
中图分类号:S718.46 文献标识码:A 文章编号:1003-5508(2009)02-0025-05
TheApplicationoftheSSRMarkertoResearchonPopulusL.
YINJi-yan1 ZHANGJian-guo2＊
(1.TheServicesCommandColegeofChinesePeoplesArmedPoliceForce, Beijing 102202, China;
2.ResearchInstituteofForestry, CAFKeyLaboratorySilvicultureoftheStateForestryAdministration, Beijing 100091, China)
Abstract:SSRmarkersarevaluableasgeneticmarkersbecausetheyareco-dominantanddetecthighlev-
elsofalelicdiversityandthemostabundantmicrosatelitemotifsreportedinforest.Theapplicationofthe
SSRmarkerstotheresearchonPopulusL.andtheexistingproblemsandprospectofthistechnologyare
alsodiscussedinthispaper.
Keywords:PopulusL., SSRmarkers, Geneticmarkers
1 SSR(SimpleSequenceRepeat)标记技术特
点及运用
1.1 技术特点
SSR(SSLP)由 Moore等于 1991年创立。 SSR
即微卫星 DNA,也是基于 PCR的分子标记 ,是一类
由几个(多为 1 ～ 5个)碱基组成的基序(motif)串联
重复而成的 DNA序列 ,其长度一般较短 ,广泛分布
于基因组的不同位置 ,不同遗传材料重复次数的高
度变异性 ,这一变异性正是 SSR标记产生的基础 。
可以利用某个微卫星 DNA两端的保守序列设计一
对特异引物 ,扩增这个位点的微卫星 DNA序列 ,经
聚丙烯酰胺电泳即可显示不同基因型个体在这个
SSR位点上的多态性 ,微卫星 DNA是中性的 ,而且
SSR标记呈共显性的孟德尔式遗传 ,它能检测到更
多的等位基因 , 能提供更细致的基因变化范围。
SSR标记的主要特点有:简单 、稳定 、数量丰富 ,广泛
分布于整个基因组;具有较多的等位性变 1异;共显
性标记 ,可鉴别出杂合子和纯合子;DNA用量少 ,实
验重复性好 ,结果分析容易且可靠 。
SSR标记是物种的基因型鉴定与品种保护 、种
子纯度评价和种质保存 、多样性研究 、基因和 QTL
分析 、系谱分析和分子标记辅助选择育种 、资源鉴
定 、连续图谱绘制和克隆并筛选大片段文库等领域
的有用工具 ,是应用较为广泛的遗传标记。但由于
创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息 ,
因此其开发有一定困难 ,费用也较高。
SSR(SimpleSequenceRepeat)标记是近年来发
展起来的分子标记 ,已被广泛用于遗传图谱的构建 、
QTL定位 、亲本分析 、群体遗传结构分析 、品种鉴定 、
亲缘关系等[ 1 ～ 6] 。 DNA主要是存在于细胞核内 ,也
有少量的存在于线粒体和叶绿体中 , SSR标记是对
核内 DNA的分析 。核基因是双亲遗传的 ,利用其序
列变异探讨植物的系统发育过程更优于叶绿体基
因 ,特别是解决网状进化问题[ 7] 。 SSR标记以 PCR
为基础 ,快速简便 ,可靠性强 ,重复性高且品种间多
态性丰富[ 8] 。 SSR可以在不同谱系 、群体 、甚至在属
内相近的种之间通用[ 9] 。因此 , SSR标记能从分子
水平直接揭示林木的多态性 ,构建遗传连锁图谱 ,鉴
定优良品种或无性系的谱系以及分析植物群体遗
传 。因其极高的突变率 、共显性和极好的重复性 ,已
成为鉴别杨树无性系或品种的理想标记 [ 2 ～ 6, 10] 。
1.2 技术流程
微卫星序列通常是通过检索 GenBank, EMBL
和 DDBL等 DNA序列数据库来获得 ,也可以通过其
他文献来检索得到相应的序列。杨属植物的 SSR
标记研究的并不多 。在 htp://www.ornl.gov中提
供的杨树 SSR引物序列 ,选择其中已作图标记的引
物序列对进行引物合成 ,表 1中的引物序列是在杨
属植物研究中筛选出可利用的引物对 [ 11] 。
SSR扩增 ,扩增在 PCR仪上进行 , PCR反应条
件:94℃保温 4 min,然后热循环程序为 94℃ 30S,
55℃ 30S, 72℃ 30S,共 35个循环 ,最后 72℃保持 10
min,然后 4℃保存即可 。反应条件中 Mg2+浓度 ,
dNTP浓度以及 Taq酶的选择都对其有很大程度的
影响 ,其中引物退火温度根据引物的 Tm值变化 1 ～
3℃,经过反复重复实验才能得到最佳的方案 [ 11] 。
SSR扩增产物的检测 ,由于扩增片段短(一般小
于 300 bps),基因型间的差异小(一般是几个 bps),
故通常使用分辨率高的聚丙酰胺凝胶电泳。通过制
板 、预电泳 、样品变性和电泳等过程完成产物的初步
检测 。通过银染检测 ,可得到清晰的指纹条带 ,用以
进一步的统计分析 。具体过程是固定—水洗—银
染—水洗 —显影—定影 —水洗—干燥等步骤 。
SSR数据分析 ,分析是借助软件来完成的 ,有带
时赋值为 1,无带时赋值为 0。每一对 SSR引物检测
一个位点 ,每一条多态性带为一个等位基因。可采
用 NTSYSpc2.10e、DNAMAN、Popgen32等软件进行
分析 。
表 1 杨属植物 SSR引物特征表
Tab.1 AtributesofSSRprimersinPopulusL.
Name LeftPrimer RightPrimer Length Motif Repeats GC%
GCPM 1011 ATGAAATAATCGTTTGGTGC CACCCGAGTTTATCTCACTC 221 at 11 35 50
GCPM 1037 ATGAAATTCGCAAAGTCAGT AAAAGAGGAAATTACGGTCC 123 ta 11 35 40
GCPM 1063 AGTTAATTGCGCATGTTCTT AAACAAACTCCAGCAAACAT 165 ca 16 35 35
GCPM 1074 TCAAGTGAAAAGATTGAAAGTG TTGAAAAGCAAATCTGAGGT 103 ga 11 32 35
GCPM 1158 ATGCACTTCCTTCCAAATTA ATCAGTTCCTTCAGCTTCAA 225 ctg 6 35 40
GCPM 1186 TGTATTTGTGTGGGTTGAAA AAGTAAGTGTTGGCTGCATT 141 ta 14 35 40
GCPM 1192 CATGCATCATTAGAGAAGAGG TAATTGGTGAATCAAAGCCT 199 ac 9 43 35
GCPM 1214 GGAAGCATCCTATGATTTTACT CCTCGCATAATATTGCTTTC 214 at 24 36 40
GCPM 124 TTTGAGCACTTCAACTACCA TGTCTTCCCTTAGTCACCAC 198 cac 6 40 50
GCPM 1252 AGCGTCTCAATGTTTTGTTT TTTGCTTCAGGTTTATTTCC 149 aata 4 35 35
GCPM 1255 GAACCTTAAAACCAGAACCC GAGCCACAGAAATACTGCTC 207 ag 23 45 50
GCPM 1260 CACAGGAACCTGGTTATCAT CTGGCATTCCTTCTAAGCTA 134 tg 11 45 45
GCPM 1274 GCCTGATACTTGTGGACCTA CCCGTATAATATGATGATCCA 195 tat 5 50 38
GCPM 1353 GAAAACTGATTCCTGATTCG CAAGAATCAATGCATGTCTG 150 at 9 40 40
GCPM 1376 TGTCAAATAGTAGCATCCCC CCACCTTGACTTTTCTTCTG 105 at 11 45 45
GCPM 1381 CAATGTCAAGTGCTCAGAAA GTATTGGGTGAAGGTTGAGA 224 aat 6 40 45
GCPM 139 ATGACATGACATGATTGGAA CTTCTGCTGGAAGAAGAAAA 227 gt 15 35 40
GCPM 1414 TCCCTTTACCTACCTTTCCT AAGAAAGGAAGGACTTTTGC 104 tct 7 45 40
2 SSR(SimpleSequenceRepeat)标记技术在
杨属植物研究中的应用
杨树种类多 ,分布广 ,其遗传多样性大多与其地
域起源 、分布有很大关系。国内外在派间 、种间 、种
内及群体等水平对杨属植物的遗传进化等进行了较
为系统的研究 ,揭示了杨属植物丰富的遗传多样性 ,
为今后杨属植物的系统发育 、遗传进化和植物分类
26 四 川 林 业 科 技 30卷
奠定了基础 。
2.1 SSR标记技术在种内研究中的应用
SSR标记简单 、稳定 、数量丰富 ,广泛分布于整
个基因组 ,具有较多的等位性变异。根据这个特点 ,
Dayanandan等 [ 12]分离并描述了颤杨的 SSR位点 ,
检验了颤杨 SSR引物对于杨属其它树种微卫星的
兼容性和可利用性。对于 36个颤杨个体 ,在 4个
SSR位点上共检测到 29对等位基因 ,在 SSR位点
上 ,等位基因的数目为 5 ～ 11 ,每位点平均 7.25对
等位基因 ,观测到的杂合性为 0.19 ～ 0.82,每位点
平均为 0.46。这是微卫星技术在杨树上首次应用 。
随后 , Schoot等 [ 13] 对黑杨的微卫星位点进行了克
隆 、测序 , 并合成了序列标记微卫星 (Sequence-
taggedmicrosatelite, STMS)分析的引物。 12对二核
苷酸重复的引物所产生的片段表现出黑杨的多态
性 。在检测此标记的多态性特征方面 ,由部分基因
文库进行了颤杨的 8个新微卫星 DNA或简单序列
重复(SSR)位点标记 ,通过测定的 38个 P.tremu-
loides个体的多态性检测[ 14] 。对比几种方法 ,利用
10个 SSR位点和 248个 RAPD位点 ,鉴别 17个杨
树品种的 DNA指纹及其分化 ,确定其遗传关系 ,同
时与等位酶标记比较 。结果发现 ,所测品种均有很
高的微卫星 DNA和 RAPD遗传多样性 ,在 4个 SSR
位点上 17个品种均可利用其多位点基因型所鉴
别 [ 15] 。 2006年对新疆额尔齐斯河流域天然杨属黑
杨派 、青杨派和白杨派种内的亲缘关系进行了 SSR
分析。从 50对 SSR引物中筛选出 18对引物 ,共扩
增出 202个等位基因 ,平均每个位点有 11.22个等
位基因 。银白杨种内相似系数为 0.70 ～ 0.96,欧洲
山杨为 0.68 ～ 0.96 ,银灰杨为 0.50 ～ 1.00,可见白
杨组 3个树种内部均有不同程度的遗传分化 ,特别
是银灰杨更大 ,来自不同地点的银灰杨种群遗传差
异非常巨大的 ,但种群内分化相对比较小 [ 11] 。
ChristopherT.Cole[ 16]为建立一个完整的关于
群体遗传和进化的基础推论 ,在美国威斯康星河
(密西西比河支流)的 11个地点采集 192个美洲山
杨 ,取分布在杨树整个基因组的 16个 SSR位点分
析其群体变异。 3个个体被证明是三倍体 ,所有 16
个位点都是多态的 ,共有 132个等位基因在 189个
二倍体中 ,每一个位点的等位基因数变化很大(平
均 8.25,范围 2 ～ 20),期望杂合度和观测杂合度也
很高(分别为 0.45和 0.41),群体内分化很小 (Fst
= 0.006 ～ 0.045), 近亲交配水平适中 (Fis=
0.09)。 Squirel曾表示还没有这样的文章 ,用植物
微卫星分析足够的个体以提供种群水平的变异信
息[ 17] ,然而 ,分布的等位基因频率能在种群历史上
提供重要的信息 ,如:瓶颈效应[ 18 ～ 21] 。白杨被认为
是一种遗传变异很大的树种 , 而群体内的分化很
小[ 22] ,微卫星引物在很少位点和个体上的应用和测
试[ 3, 14, 23 ～ 24]在解决白杨群体遗传变异问题可能是有
用的 。
近年来基于黑杨组的基因流的研究有很多 ,基
因流(geneflow)就是基因在群体之内和群体之间的
运动 ,基因流是借助花粉 、种子 、孢子 、营养体等遗传
物质载体的迁移来实现的 ,其中花粉和种子的扩散
和传播是两种最主要的形式 [ 25] 。Smulders[ 3, 13]指出
了解不同河流的黑杨遗传变异是很重要的 , Ericim-
bert[ 4]使用遗传标记研究法国 Drôme河流域先锋树
种黑杨的基因流 ,这种雌雄异株的树种被认为是具
更有效率的传播花粉和种子的机制相比其它树。沿
河采集 22个 forestfragments的样本 ,运用 6对 SSR
引物分析其遗传多样性 ,发现群体内很高的多样性
和明显的分化 ,并且得出基因流系数在山脉高的区
域要比下游平滩高的结论。
2.2 SSR标记技术在种间研究中的应用
T.Fosati使用 6对 SSR引物沿意大利北部的
Ticino河流域的 60个三角杨和加杨(黑杨和三角杨
的杂交)无性系 、以及自然群体黑杨进行分析 ,研究
的主要目的想证实是否黑杨老树群体是年轻一代的
祖先和在栽培的杂交种与无性系三角杨之间是否在
这个地区存在基因渐渗。分析 3个阶段的自然群
体 ,百年的老树 、年轻群体(2 a～ 30 a)和这些群体
的 3个雌株种苗。其中 4对引物有三角杨种之间的
等位基因位点 ,因此可以用来标记三角杨到黑杨的
基因渐渗 。核与叶绿体标记的联合增加了检测基因
渐渗现象的可能性 ,研究证实 SSR标记可以区别欧
洲黑杨和三角杨的个体 ,能鉴别无性系和自然群体
中的杂交个体 [ 5] 。目前同工酶[ 26] ,重组 DNA(rD-
NA)[ 27]和叶绿体标记 [ 28]已经被广泛应用到杨属种
和杂交种的鉴定 ,可这种使用是有限的 ,只有很少的
多态性 (同工酶 , rDNA)或只有通过母系链来认识
基因渐渗 (叶绿体)。 M.J.M.Smulders[ 3, 13]在研究
黑杨重复序列变异中指出通过独一无二的多位点基
因型来鉴别每一个个体已不是问题。
对白杨组的研究 ,早在 1992年 RajoraandDan-
cik[ 29]利用同工酶分析并确定银灰杨的杂交起源和
观察到杂交种与银白杨有更近的遗传关系 ,到现在
没有使用现代的分子标记来证实杂交和种的关系。
272期 殷继艳 ,等:SSR标记技术在杨属植物研究中的应用
接着 , T.Fossati[ 6]又分析自然群体欧洲山杨到银白
杨的基因渐渗水平 。此研究有效的运用 SSR标记 ,
通过分析一系列的银白杨 、银灰杨和欧洲山杨个体
来分析鉴别杂交 。结果得出很明确的区别在两树种
和它们的杂交种之间 ,使用这些标记 ,沿意大利北部
的 Ticino河盆地银白杨天然林分和与银白杨树种混
合生长的银灰杨个体进行采样分析 。SSR分析 5对
引物 ,很有效地认证欧洲山杨和银白杨之间的杂交 ,
并且把杂交种分成了 4个类群。欧洲山杨和银白杨
的杂交最早被描述为是一个独特的种 ,并命名为灰
杨 ,但现在是被认为是天然出现在双亲分布范围的
交界处的一个杂交种(银灰杨)[ 30] 。银灰杨杂交种
多群居在离银白杨很近的河滩森林中 [ 31 ～ 33] ,而欧洲
山杨没有生长在漫滩地区和多瑙河以及它的支流附
近 ,相反的是群居在几公里以外阿尔卑斯山脉的山
脚下和山区领域 [ 32] 。研究表明银灰杨变异很大 ,
可能是因为混合的等位基因来源于每一个双亲物
种 。在欧洲几个河谷地区发现了银白杨和欧洲山杨
的回交杂种 [ 6, 29] 。在 2005年 C.Lexer[ 34]分析了多
瑙河流域欧洲山杨和银白杨两种模式树的基因流屏
障 ,以及生态和生活史在基因渐渗中的角色 。使用
20个 SSR位点和 8个质体 DNA限制位点的多态性
从 4个双亲群体中选择 93个基因型的杂交模式标
本和个体。结果推断出基因渐渗通过欧洲山杨授粉
优先存在从欧洲山杨到银白杨 ,并且杂交领域是个
有价值的工具在研究这两种生态分支杨树的基因流
屏障的遗传体系机构 ,山杨和银白杨都存在不同的
分化。结果证实 ,尽管都是通过风的传播 ,欧洲山杨
花粉的传播要比种子的扩散更有效率 ,这就是很重
要的暗示来解释两种树种的杂交方式 。
共显性和重复性极好的 SSR标记 ,成为鉴别无
性系的理想标记 ,曾用微卫星 DNA指纹研究 6个不
同种的无性系和品种之间的遗传差异及关系 [ 35] 。
10个简单序列重复位点的微卫星 DNA标记用于来
自 3个组 6个不同种的 96个杨树无性系 /变种和品
种的区分及遗传指纹的构建。基于其单位点或多位
点微卫星基因型 ,所有的无性系 /变种都有独特的指
纹 。来自于同一个种的不同无性系 /品种较来自不
同种的表现出更高的微卫星 DNA相似性 。用 SSR
标记对欧洲山杨(Populustremula)无性系进行鉴定
和其结构的研究 [ 36] ,形态特征和 9个微卫星位点鉴
别无性系 ,微卫星要比形态上鉴别出更多的无性系 ,
形态相似的无性系运用 SSR区别出其遗传分化 。
3 展望
随着分子标记技术的迅猛发展 , SSR标记的应
用技术也日趋完善 。SSR标记 ,在我国作物育种 、遗
传改良等领域的应用研究发展很快 ,在大豆 、小麦 、
玉米 、水稻等的遗传多态性检测 、杂种优势群划分 、
亲缘关系分析 、遗传连锁图谱构建等方面获得了一
系列的成绩。SSR标记信息含量高 ,可用来高效 、准
确的检测生物体中的遗传变异 ,在林业研究中具有
良好的应用前景。但还有一些问题需要解决 ,如成
本相对较高 、引物开发问题以及 SSR变异的机制和
机理等 ,通过其他途径得以完善 ,从而使其成为一种
成熟的遗传分析手段而更适合于推广应用。天然分
布的杨属植物由于长期处于自然杂交 、回交等状态
中 ,其分类问题已成为研究的热点问题 , 相信 SSR
技术将会极大地推动林木分类 、遗传育种 、种质资源
利用等方面的发展与进步。随着这项技术的不断发
展和完善 ,它将会推动植物遗传研究进入一个新的
阶段 。
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