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草莓属间体细胞融合研究
冯 颖，顾地周，朱俊义，梁 宇
(通化师范学院生物系，吉林通化 134002)
摘要:以长白山区的东方草莓和安娜草莓叶片为试材，PEG 结合高浓度 Ca2 +、高 pH 值的方法进行原生质体融
合，将融合后的杂种细胞接种到适宜培养基中进行细胞增殖形成细胞团和细胞团再分化芽苗培养。对融合、融合前后
及融合后细胞增殖形成的细胞团分化的再生芽苗进行染色体鉴定，结果表明，1． 0%纤维素酶 + 0． 5%果胶酶 +
0． 6 mol /L甘露醇 + 0． 1% 2 － (N － 吗啡啉)乙磺酸 MES + 0． 05 mol /L CaCl2 组合原生质体产量和活力最高;当
PEG6000 浓度为 30%时，原生质体一对一融合概率最高，达 10． 67%;融合后形成的第一代类愈伤组织细胞及再分化
的芽苗有 60%染色体倍性为 6x，说明草莓属间体细胞已经融合，进一步开展育种是可行的。
关键词:东方草莓;四季草莓;体细胞;融合
中图分类号:S668． 4 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)03 － 0029 － 03
收稿日期:2012 － 07 － 27
项目基金:吉林省教育厅“十二五”科学技术研究 (编号:吉教科合字
［2011］－ 306)。
作者简介:冯 颖(1983—) ，女，吉林通化人，硕士，讲师，主要从事长
白山区植物细胞生物学研究。Tel:(0435)3208073。
通信作者:顾地周，讲师，主要从事长白山区植物研究。Tel: (0435)
3208073;E － mail:gudizhou@ 163． com。
我国草莓产业发展很快，近些年不断育成和引进新的品
种，这些草莓品种虽然各有差别，但共同的缺点为一季品种，
只在每年 1 月中旬(温室栽培)至初夏季节集中上市，7 月中
旬至 12 月末是草莓市场的空缺期。草莓生产的经济效益首
先取决于品种，四季草莓可多季结果，能够满足淡季市场需
求，可见，选育和引种四季草莓品种尤为重要。目前关于草莓
品种选育的报道较多［1 － 6］，但关于四季草莓的育种研究报道
极少。东方草莓(Fragaria orientalis Losina － Losinsk．)是蔷薇
科草莓属多年生草本植物，呈小群落分布于长白山海拔
800 ～ 1 200 m 的草地和林下等生境，其聚合果肉质、膨大较
小、味酸甜、有香气、果形为球形或卵形、产量极低，成熟后呈
紫红色，是草莓育种的优良野生种质资源。安娜草莓(Anna
strawberry)是美国四季草莓品种，果实短楔形，呈深橘红色，
有光泽，果肉较硬，具有极耐运输、汁多、味浓香、植株生长直
立、健壮、抗病力极强等特性;但安娜草莓在我国北方等高寒
地区栽培易受冻害。本研究采用体细胞融合技术，以东方草
莓和安娜草莓为材料，开展抗寒四季草莓的选育工作，揭示草
莓体细胞融合的可行性，以期为进一步选育四季草莓新品种
奠定理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试材料 以东方草莓和安娜草莓试管苗(由通化
师范学院生物系植物组织培养实验室提供)为试材。
1． 1． 2 试剂 酶液:1． 0%纤维素酶，0． 5%果胶酶，0． 6 mol /L
甘露 醇，0． 05 mol /L CaCl2 · 2H2O，pH 值 5． 8 ～ 6． 2;
CPW －13%甘露醇:27． 2 mg /L KH2PO4，101． 0 mg /L KNO3，
1 480． 0 mg /L CaCl2 · 2H2O，246． 0 mg /L MgSO4 · 7H2O，
0． 16 mg /L KI，0． 025 mg /L CuSO4·5H2O，13%甘露醇，pH值
6． 0;台盼蓝染液:0． 4 g 台盼蓝，100 mL 0． 6 mol /L 甘露醇，
0. 05 mol /L CaCl2·2H2O;PEG 液:PEG － 4000，PEG － 6000，
8 mmol /L CaCl2·2H2O，0． 7 mmol /L KH2PO4，0． 3 mmol /L 葡
萄糖，pH 值 5． 8;高浓度 Ca2 +、高 pH 值洗液:50 mmol /L
—92—江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 3 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.03.136
CaCl2·2H2O，甘氨酸 － 氢氧化钠缓冲溶液(pH 值 9． 4) ，
0． 2 mol /L 甘氨酸，0． 2 mol /L氢氧化钠;20%蔗糖;70%乙醇。
1． 2 方法
1． 2． 1 草莓叶肉原生质体分离和纯化 将东方草莓和安娜
草莓试管苗移入降低了蔗糖浓度的 MS 培养基培养 10 d 左
右，或者暗培养 1 周，将叶片剪成细碎的小条并去除叶脉;材
料与酶液按照 1 ∶ 10 比例混合，置于摇床上 26 ℃ 恒温
60 r /min 进行暗酶解，镜下定时观察酶解情况。将酶解完全
的 2 种草莓叶肉原生质体悬浮液经 200 目尼龙纱网过滤后，
离心，去上清液，将沉淀的原生质体悬浮于 0． 2 mol /L 2 mL
CaCl2 溶液中。用移液器向离心管底部缓缓注入 20%蔗糖溶
液后离心，取两相溶液的界面处纯化的原生质体带，悬浮在
0． 2 mol /L 6 mL CaCl2 溶液中
［7］，测定原生质体的活力。
1． 2． 2 草莓叶肉原生质体融合及培养 将 2 种草莓的原生
质体以 1 ∶ 1 比例混合，用移液器将混合好的原生质体滴在 6
孔板内，静置 10 min左右，使原生质体贴在 6 孔板底部，观察
其形态。吸取 PEG 溶液，等体积滴在每滴原生质体上，轻轻
转动 6 孔板，使其混匀，静止 10 min 左右，观察原生质体的聚
集现象，并统计聚集体所占百分率，1 000 r /min 离心 4 min，
将融合体密度调至 0． 5 × 105 ～ 0． 8 × 105 个 /mL，接种于适宜
培养基中进行细胞增殖培养，前 2 周暗培养，然后转至光照培
养，光照周期为 14 h /d，光照度为 1 200 lx。
1． 2． 3 草莓叶肉细胞增殖、细胞团形成和芽苗再分化 将试
管苗的嫩叶细胞融合后，接种到 MS + 6 － BA 1． 20 mg /L +
NAA 0． 45 mg /L培养基中进行细胞增殖和细胞团形成培养，
培养基中添加蔗糖 50 g /L、琼脂粉 6． 8 g /L，调节 pH 值为
5. 8，温度(25 ± 2)℃下暗培养。当融合后的细胞增殖并形成
细胞团后，将细胞团转移到 MS + 6 － BA 1． 70 mg /L + NAA
0. 05 mg /L培养基中进行芽苗再分化培养，培养基中添加蔗
糖 30 g /L、琼脂粉 6． 8 g /L，调节 pH 值为 5． 8，温度(25 ±
2)℃，光照度为 1 200 lx，光照周期为 14 h /d。
1． 2． 4 染色体鉴定 分别取亲本东方草莓、安娜草莓以及融
合后的再生植株幼嫩根尖放入 0 ～ 4 ℃对二氯苯饱和溶液中
预处理 6 h，蒸馏水冲洗 3 次，每次 5 min，卡诺氏固定液固定
2 ～24 h，蒸馏水冲洗 3次，每次 5 min，在预热的 60 ℃ 1 mol /L
盐酸溶液中酸解 10 min，蒸馏水冲洗 3 次，每次 5 min，改良石
炭酸品红染色 1 h，切取根尖后压片，显微镜下观察计数并照
相。融合后的细胞增殖培养 10 d后，取生长状态良好的细胞
团，放入 0 ～ 4 ℃对二氯苯饱和溶液中预处理 6 h，蒸馏水冲洗
3 次，0． 075 mol /L KCl溶液中低渗 30 min，蒸馏水冲洗 3 次，
卡诺氏固定液固定 2 ～ 24 h，将愈伤组织切成 1 mm大小组织
块后放入 3%纤维素酶和 2%果胶酶混合液中酶解 3 h［8］，蒸
馏水冲洗 3 次，蒸馏水低渗 15 min，火焰涂片制片，改良石炭
酸品红染色，显微镜下观察计数并照相。
2 结果与分析
2． 1 草莓叶肉原生质体分离和纯化
在原生质体分离过程中，酶的种类、浓度、酶解时间、酶解
方式等都对原生质体产量和活力影响较大。试验结果表明:
在同一纤维素酶浓度下，随着果胶酶浓度的提高，原生质体活
力降低，产量先增加后降低，这可能是由于高浓度的果胶酶对
原生质体损害较为严重，从而导致完整原生质体减少。在同
一果胶酶浓度下，纤维素酶的浓度在 0． 5% ～ 1． 0%范围内，
原生质体的产量和活力随纤维素酶的浓度的升高而升高。
1. 0%纤维素酶 + 0． 5% 果胶酶 + 0． 6mol /L 甘露醇 + 0． 1%
2 －(N －吗啡啉)乙磺酸 MES + 0． 05 mol /L CaCl2 组合所得
原生质体产量和活力最高。纯化过程中形成了界面清晰的原
生质体聚集带(图 1) ，纯化后的原生质体大多呈圆形，淡绿
色，用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复 3 次，取平均
值，成活率达 90%，调整原生质体密度为 0． 5 × 105 个 /mL。
在 40 倍 × 10 倍显微镜下能明显观察到安娜草莓叶肉原生质
体直径大于东方草莓，二者较易区分。
2． 2 草莓叶肉原生质体融合
由表 1 可知，当 PEG 分子量为 6 000，浓度为 30%时，原
生质体一对一融合概率最高，可达到 10． 67%。加入 PEG 后，
在倒置显微镜下观察到原生质体快速移动，部分原生质体聚
集到一起(图 2) ，随着 PEG 处理时间的延长，聚集的数目越
来越多，有一对一聚集的，也有多个聚集在一起的，加高浓度
Ca2 +、高 pH值洗液后，聚集在一起的原生质体质膜开始发生
融合，形成细胞桥，逐渐完成胞质渗透和细胞核融合，融合后
的杂交细胞直径大于 2 个亲本细胞。
表 1 不同 PEG种类及浓度对草莓叶肉原生质体融合率的影响
编号
PEG浓度
(%)
一对一的融合率(%)
PEG4000 PEG6000
1 20 0． 68 6． 47
2 25 2． 97 10． 17
3 30 6． 03 10． 67
4 35 4． 63 9． 23
5 40 2． 80 7． 33
注:同水平试验重复 3 次，取平均值。当 PEG 为 4 000 时，P =
0. 008 7 ＜ 0． 05;当 PEG 为 6000 时，P = 6． 14 × 10 －6 ＜ 0． 05，差异
显著。
—03— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 3 期
2． 3 融合后的细胞增殖、细胞团形成和芽苗再分化
按“1． 2． 3”节的方法，将融合后的细胞在 MS + 6 － BA
1． 20 mg /L + NAA 0． 45 mg /L培养基中培养 8 d，细胞开始增
殖，继续培养至 28 d，融合后的细胞增殖后逐渐形成白色细胞
团;再将形成的细胞团转接到 MS +6 － BA 1． 70 mg /L + NAA
0． 05 mg /L培养基中进行芽苗再分化培养，培养 12 d 发现细
胞团表面出现球形颗粒，继续培养至 30 d，颗粒逐渐由球形转
变为锥状，48 d后锥状体逐渐伸长，成为带有 2 ～ 3 个小叶片
的芽苗，55 d后苗高可达 1． 00 cm以上;待细胞团分化的芽苗
长至 2． 00 cm时，将芽苗切下转接到 1 /2MS + IAA 0． 05 mg /L
培养基上进行生根培养，培养 20 d 即可生出 5 条以上不
定根。
2． 4 染色体鉴定
对野生东方草莓和安娜草莓根尖染色体数目进行观察可
知，东方草莓为 2x倍性(2n = 2x = 14) ，其中 2x 体占 90%，4x
体占 10%;安娜草莓为 4x 倍性(2n = 4x = 28) ，其中 4x 体占
85%，6x 体占 15%。根尖细胞均为 50 个。对融合后形成的
第一代类愈伤组织细胞染色体数目进行观察，统计 50 个细
胞，结果表明，6x倍性(2n = 6x = 42)细胞占较大比例，其中 4x
体占 10%，6x 体占 78%，8x 体占 8%，更高及非整倍体占
4%。对新生植株根尖染色体数目进行观察，根尖细胞为 50
个，6x倍性(2n = 6x = 42)细胞所占比例较大，其中 4x 体占
10%，6x体占 60%，8x体占 10%，更高及非整倍体占 10%。
3 结论与讨论
我国草莓品种多引自国外［9］，真正适合我国气候条件的
品种不多，迫切需要选育适宜我国的优良品种［10］。研究表
明，当酶解时间为 7 h时，只有极少量的原生质体释放。随着
酶解时间的延长，原生质体产量逐渐增高，酶解 13 h 产量达
到最高，酶解 17 h原生质体产量逐渐下降，酶解液中碎片较
多说明原生质体产量下降是最早游离的原生质体大量破碎所
致［11］。在酶解时间相同的条件下，采用摇床振荡酶解原质体
产量和活力均比静置酶解高，各自到达产量峰值所需时间也
不同，摇床振荡酶解在 15 h 达到最高产量，静置酶解在 16 h
时达最高产量。这主要是由于缓慢转动有利于原生质体释
放，酶液处理时间相对于静置酶解要短，对原生质体的伤害较
小［12］。草莓属植物的染色体基数为 x = 7。由融合前后的染
色体测定结果可知，融合后生成的类愈伤组织以及新生植株
染色体倍性均以 6x为主，在染色体水平上融合 2 个亲本东方
草莓的 2x倍性和安娜草莓的 4x 倍性，草莓类愈伤组织继代
培养时间越长，染色体倍性越复杂，不利于植株再生［13］。原
生质体是植物细胞工程进行遗传操作、基因转移的良好材料，
原生质体融合对改良品种，建立新的异源杂交种和进一步探
索生命机理具有重要意义［14］。本研究以长白山的野生，东方
草莓和四季草莓安娜品种为材料，采用 PEG 结合高浓度
Ca2 +、高 pH值的方法，成功完成了二者的体细胞融合、融合
细胞增殖、类愈伤组织细胞团形成和细胞团芽苗分化，在染色
体水平上证明了二者的融合，田间栽培观察结果也证明了原
生质体融合获得的植株为杂种。本研究为草莓和其他种植物
的属间体细胞融合选育新品种(系)提供了理论依据，同时为
生物技术育种提供方法，但分子水平上的生物学鉴定有待进
一步研究。
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