全 文 :·研究论文 ·
柿属植物 IS S R 分析技术的建立 *
张育林 罗正荣 * *
(华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 ,武汉 43 00 70 )
摘要 : 以部分柿属 ( D矛O邵少or s )植物为材料 ,对 Is R 一 PC R 反应体系的 M扩 、 dN T sP 、 引物 、模板 ND A 和 aT q D N A 聚合酶
浓度 ,退火温度及扩增循环次数进行了探讨 ,确立了适合柿属植物 I s s R 分析技术体系 :在 25 卜L 反应体系中 , 含 lx B u fe r .
M扩+ 2 . 0 或 2 . s
mo 比
,
dN T p s 0
.
2
mo
比 ,引物 0 , 6 卜m o比 , aT q ND A 聚合酶 l u , 甲酞胺 2 % ,模板 D N A 2 . 4 n留卜L ; CP R 扩
增程序 : 94 ,C 变性 3 m in ; 94 ,C 30 5 , (T m十 2 ) ,C (根据引物不同设定 ) 45 5 , 7 2 ,C 1. 5 m i n , 35 个循环 ; 7 2 ,C延伸 7 m i n ; 2%琼脂
糖电泳分离 PC R产物。 结果为柿属植物遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持。
关健词 : 柿属植物 ; IS S;R 技术程序
E s t a b li s hm e n t o f ln t e r
一 s im P l e S e qu
e n c e R e Pe a t T e c hn i q
u e i n G e n u s D万O冬砂oT s s PP .
Z H A N G Q i n -g L in L U O hZ e n g
一
R o n g * 申
伍 e y加 ob art o yr fo r H o irt e u lut r a l P lan t B io lo gy , M in is ytr o f E d u e at io n , H u ` 山o n g A hg e u l ut ar l U n iv e sr i yt , Whu an 4 300 70 , C hin a )
冉加栩以 : A P or tOC o l o f r e Pr do u c ib le in t e -r s i呷 le se 卿cen e er pe at ( IS SR ) w as e s abt li s h ed fo r D IO邵少or s sP P . hT e am in afC ot sr
in if ue cn ign ISS R
一
P C R in e dlu ign ht
e e
con
e n atr ti o n o f M犷 , dN 冲s , p n m e r , et 哪 laet D N A , sT q po l丫nr e ra s e , 几n n e al in g et m eP ar tU花 ,
an d PC R
e
cy l
e s w e邝 ivn e s it g aet d
.
hT
e oP it am l er ac it
o n e o n d iit o n s w e er as fo l lo w s ( in 2 5 林L er a e it on s y set m ): 1 x B u fe r , M广 2 . o or
2
.
5 r n r n o比 , dN 作 5 0 . 2 nmr o lL/ , Pir me r 0
.
6 林m o比 , aT q po lyn e在比 e IU , fo n ” 别的 i d e Z% an d et mP laet D N A 2 . 4 n g/ 林L . hT e o Pt im a l
am P liif
e at i o n P or g ar m w as : 3 m in i n i tial de n a tU m tion set P (94 ,C )
,
fo ll o w ed by 3 5 e cy le s o f 30 s (94 ℃ ) , 4 5 5 [(Tm + 2 ) ℃ , c o n fo
nur
g
ot d i fe 邝 n t Pir m e 招 ] , 明d 1 . 5 m in (7 2 ℃ ) . hT e er ac it o n s w e er e o mP l e te d by a if an l e x et n s io n set P o f 7 m i n ( 72 ℃ ) . hT e CP R P找月u c st
w e er an a lyZ e d by e le e tr o Ph oer
s is us i n g a Z% a g aJ 旧s e g e l . hT e er s u lt w il l b e u se fu l fo r ht e an l y
s i s o f ht e in et rS Pe c ie s g e n e it e di v esr i yt
an d m
o le e u alr
s y s te m iat e s in D初邵小 or s sP P . b y IS SR ·
兀可 , . 自 : O of 邵少 or s sP p . ; 加 t e卜 s im Plo se qu e n c e r epe 叫 sI S )R ; p or oct of
S S R技术广泛应用于多种作物的遗传育种研究 ,
目前 ,在水稻【l] 、柑桔冈 、梨 ls] 、核桃 l4] 、桃阎等作物上进
行了品种鉴定 、亲缘关系分析 、分子遗传图谱构建等
方面的工作 。 柿属植物 sI S R 反应体系的建立和运
用该技术构建种质资源的指纹图谱迄今未见报道 。
由于 sI SR 是一种基于 PC R 反应的分子标记 , 其反
应受到各种因素 ( 如 M犷 、 引物城N T sP , aT q D N A
聚合酶等 ) 的影响 。 本研究拟 建立柿属植物
sI S R
一
P C R 技术体系 , 为进一步开展柿属植物的遗
传多样性和分子系统学等方面研究奠定技术基础 。
1 材料和方法
,
.
, 试材
实验采用的柿属植物见表 1,其中美洲柿采自武
汉植物园 ,其余试材均采自华中农业大学果树标本园
柿圃。 在供试材料中 ,金枣柿的分类地位尚不清楚 。
,
.
2 O NA提取
基因组总 DN A 提取参考 D o y le 和 D o yt el 6]及程
运江【刀等的方法进行 。 D N A质量及浓度用 C ayr 一 50
紫外分光光度计检测并稀释至 1o n留林 L备用 。
1
.
3 ! S S R
一
PC R
所用 sI SR 引物参考加拿大 UB C 大学提供的
引物序列 , 由上海生工生物工程技术服务有限公司
* 基金项 目: 国家自然科学基金项 目 ( N o 3 0 2 7 092 )资助 。
张育林 :男 , 19 7 年生 , 博士研究生 。
巾* 通讯作者。 A u ht or fo r co er spo n d en ce
.
E
一
m ial
: < luo hz 岖冲 ial 加比 u .“ u .c n >.
收稿 日期 : 20 3· 11。 2 0 接受日期 :2 0() 4刀 1一 02
农 业 生 物 技 术 学 报 2 ( 0抖 年
合成 , 引物编号 、序列及其 Tm 见表 2 。
衰 1供试柿. 植物及其倍性
aT bl el 肠 ti n n a r n es , c hr o r o o so r n e n u r n be sr
iB o m e atr T
一
G ar d ien t 梯度 PC R 仪上进行 。 扩增程
序 : 94 ℃ 3 m in ; 94 ℃ 30 5 , (T +m 2) ℃ (根据引物不
同设定 ) 4 5 5 ; 72 ,C 1 . 5而 n ,不同循环数 ( 20 , 27 , 30 ,
3 5
,
40 ) ; 7 2 oC 延伸 7 m in 。
an d op lyP lo i勿 o f侧。邵少or s s ep e ie s
代号 供试材料
C ed e M at ier al
s
学名
1界 t } n n a口 e s
倍性及染色体数目
P ol yP fo i勿胡 d c hr o m。 -
so m e n U〔n be 招
衰 3 is s R一 P CR 反应体系各成分浓度优化实脸设计 *
T ab le 3 OP t
l r n u r n
de
s i gn o f e o m op n e n t c o cn e n lat tio sn fo r
IS S R
一
CP R Por toc
o l*
君迁子
D a t e lP um金枣柿
J in邓 n hs i
浙江柿
bC山 an g ep r s~ 。 n油柿
以 ly Per s im o n美洲柿
C o l l川l o n ep sr l n u n o n
罗田甜柿
L u iot 幼 t云, 。 。卜i
次郎
J ir 0 U
前川次郎
M a eka w
a
-j如u富有
uF yU
u
上西早生
U即 i hs i一w 创记
西村早生
N i曲 i一功 切旧 w 自s e
平核无
H iar 加口 e n a` h i
D
.
fo 勿 5 iL n . 2 0 二 ZX = 3 0 反应成分 浓度梯度
肠啤少即 s sP . Z n = ZX = 3 0
D
.
g8I
u e ifo ila M
e t。目f Z n = Z x = 3 0
.D
o ld 企口伪en g
CO m pe en ntS 压压湘。 t co n cen lt 妞 t io sn o f改h co m po nen st
M扩 Iun o l
·
-L , 1
.
5 2
.
0 2
.
5 3
.
0
dN I
,
P澎n un o l . L 一 1 0 . 1 0 . 15 0 2 0 . 2 5
氏而州卜m o l · L 一1 0 . 2 0 4 0 6 0 . 8
了油口 。 。 1明m e 邝曰犷U 0 . 5 1. 0 1 5 2 . 0
.D 响脚 ian a L Zn = 6 x = 9 0
.D 幻止矛hT un b
.
2 1 = 6 x 钊扣
n k司灯仆助b . Z n = 6 X = 9 0
. 反应总体积 25 林以含 xl B u fe r 和 2% 甲酸胺)o
. T o回 vo lum e o f r e a ` t io n aws 2 5 卜以con at i n in g l x Bu fe r an d Z%
fo
n n 别旧lde )
.
D h 卜 丁七山山 . Z n 二6 x = 9()
n 上司石仆助b . Z n = 6 x = 9()
.D 盆ak j Tb un b . Z n = 6 x = 9 0
D 如企泣hT un b . Z n 二 6又= 卯
D
.盆吐 j T七un b . Z n = x9 = 13 5
,
.
4 产物电泳检测
P C R 扩增产物在 .0 s x T B E 缓冲液中 , 含 .0 5
卜创m工 EB 的 2%琼脂糖凝胶 (西班牙 iB o we st 公司 )
上电泳 3一4 h , S YN G EN’E 凝胶成像系统观察和摄影
记录 。
衰 2 所用 sI SR 引物序列及 T m 值
T ab l
e 2 S e qu e cn e s a n d Tm o f id fe er n t Pn r n e sr
引物编号
C ed
e o f Pir m e sr T m /℃
石2
:0
乃刃.954261
序列
Seq
u e n e e
( 5
,
* 3
,
)
(A G )荞3
(C刀沪
(A C、 T
(G A 、 Y C
(C A )尹 C
(A C儿YG
(T G )
. R C
(A C C )
.
802541796
民 P面n 。: Y , Pyn m id in e ; H , n o n 一G : V , n o n 一T .
25 卜L 反应体系中各成分浓度优化条件见表 3 。
以 sI S R 820 为引物 , 用君迁子 、 罗田甜柿 、上西早
生 、平核无的模板 D N A ,对 sI S R 反应体系中各主要
成 分进 行 4 或 1 个 水 平筛 选 。 P C R 反 应置
2 结果和分析
2
.
, M g+2 浓度对 IS S R反应的影响
图 l 中 , 引物 Is s R 82 o 在 M考十浓 度为 2 . 0
m r n o比 时表现良好的扩增效果 , 在 1 . s r n l n o比 时
由于 M才+影响 aT q ND A 聚合酶活力显著降低
, 导
致无扩增谱带或扩增谱带缺失 ; .2 5 ~ 。比 和 3
.
0
lnI
o讥 时则部分谱带较弱或缺失及非特异谱带产
生 。 结合其 它引物扩增结 果 , M考+ 浓 度在 .2 0
~
0比 时主带清晰稳定 , 因此多数引物采用 M扩+
2
.
0
un
o比 ; 而部分引物如 I SS R 8 4 7 在 M扩+ 2 . 5
r 。刃n 。比 时能得到更为清晰稳定的图谱 ( 图 2 ) , 原
因尚待进一步研究 。 因此 , 确定 M梦+ .2 0 或 .2 5
m ln 。比 为适宜浓度 。
2
.
2 d N T P s 浓度对 IS S R 反应的影响
图 3 结果表明当 dN T sP 浓度为 1 . 0 、 1 . 5 、 .2 0 和
.2 5
~
。比 时 , 均有扩增产物 。 在 1 . 0 、 1 . 5 和 .2 5
r n r n o比 时 , 出现部分谱带缺失或谱带不清晰 ,在 2 . 0
~
o比 时扩增产物效率最高 , 因此选择 dN T P s .2 0
~
。比 为适宜浓度 。
第5 期 张青林等: 柿属植物 S S IR分析技术的建立
D NA 聚合酶浓度在5 0 U .5 / 2林 L时 , CP R 扩增不充
分 , 产物量减少 , 部分谱带缺失 : 1 . 0 、 1 . 5 和 .2 0
口2 5卜L 时 ,谱带相似且稳定清晰 ,从经济适用的角
度考虑 , 确定 1 . 0 U/ 25 p L 为适宜 aT q D N A 聚合酶
浓度 。
图 1. M广浓度对 sI sR 反应的影响 ( 引物 sI s R 820 )
F i g
.
1
.
E价 c st o f M广 加 n c e n ot 拓 o n s on IS S R er ac it on
印面份 ISS R 82 0)
M, D U (以 )口山心份冲闭 分别代表君迁子 、罗田甜柿 、上西早生和平核
无 ; 1礴分别代表 M广浓度 1. 5、 .2 0念 5和 .3 o un O UL
。 从 D L Z(川〕
m akz 鱿 .刁 代甲~
t〔恤 te lPum
,切涌阳 t ian s h i , U en lhis w 山姆 明 d
Hiar ant
。山明hi , 侧拼涌v e】苏 1礴 代甲
~
t
het co
n c . n
atr it
o ns of M广
1
.
5
,
2
.
0
,
2
.
5助d 3 .0
no
lL/
, 馏衅 t iv e ly ·
图 2 . M广 浓度对 sI s R 反应的影响 ( 引物 sI sR 84 7 )
Fi g
.
2
.
E fe c st o f M广 c o n c e n七. dons o n IS SR 二 ac iot n
印d m er IS S R 84 7 )
M
,
D LZ IX用 功 . t “ ;分刁分别代表君迁子 、罗田甜柿 、上西早生和平核
无日~4 分别代表 M广浓度 1 5 、 .2 0 、 .2 5 和 .3 0
~
比。 M , D LZ创洲〕
m . 触鱿 .刁 代甲
~
t 〔峨 te P lum
,
L u o it an t i an
s h l
,
U 。 吐由 j w 创姆 助 d
H in 劝明er 困山 i , m印“ d姆】;y 1一 4 欢p er 翔 t ht e c o n c e n o a t10 ns of M广
1
.
5
,
2
.
0
,
2
.
5 . d 3
.
0 目u n o F L , 拍即优 it vel y
·
图 4 . 几q ND A 聚合酶浓度对 sI S R 反应的影响 ( 引物
ISS R 82 0 )
F i g
.
4
.
E fl 七c st o f aT q D N A po l帅 e~ c o nc en 加 it on s o n IS SR传解it on 印对m e r sI S R 820)
M, D以侧X )切目山斌 合刁分别代表君迁子 、罗田甜柿 、上西早生和平核
无 ; l礴分别代表 ,匆 D N A琅合醉浓度 .0 5、 1. 0 、 1. 5和 .2 O U理 5 卜oL
M, D U (洲x ) m . 服“ ;* 刁 民甲
~
t D at e P I山城切涌助 t i助 hs i,
U曰心咖 w . 姆助 d肠比 . 口曰以 . b i, 找 , 州, 石拍 ;ly 卜 4 找争” 契健湘 t ht e
伪 n c切atr 石o n s o f aT叼D N A po lym~
0
.
5
,
1
.
0
,
1
.
5 an d 2
.
0 jU 2 5泌 ,
心户沁石侧 .y
.2 4 引物浓度对 ls S R 反应的影晌
不同引物浓度对扩增结果也有较大影响 。 图 5 显
示 , 当引物浓度为 .0 6脚。比 时谱带清晰稳定 ,引物浓度太低 ( 0 . 2阿。比 )或太高 ( 0 . 8卜m o比 ) , 由于和模板 D N A配对结合量过少或错配结合位点过多 ,在扩
增指数增长期得到的产物不足或产生非特异性谱带 ,
导致主带不清晰 ,影响分析 。 当引物浓度 .0 4 卜m 。比
出现产物谱带缺失 。 在获得清晰图谱的前提下 , 选择
引物浓度 .0 6 卜mo 比时重复结果较好 。
图 3 . d N T p s 浓度对 sI S R 反应的影响 ( 引物 sI sR 820 )
F ig
.
3
.
E fe
e st o f 山们甲 5 e on e en 加 it osn on ISS R r e a c it on
印d m e r IS S 8R 2 0)
M
,
D L20 0 m akr er ;
份 .刁分别代表君迁子 、罗田甜柿 、上西早生和平核
无 ; 1礴 分别代表 dN丁 P s 浓度 1 . 0 、 1. 5 、 2 . 0和 2 . 5 n ” ” o lL/ 。 M ,
D 2L 0X() m ar k
. r ; 卜d 代甲代 eS n t L址et PI 切m , L习 o it an t ian s ih , U en isb iw 山笼
叨d Hi口心m en 山由i , . 即忱 it件;vI 1闷 介甲邝峨泊 t het c o n c en tr 时拍拙 of
dN即5 1. 0 , 1 5 , 2 . o an d
2
.
5 m m o 】几` , 代圈侧留 it v e ly .
2
.
3 aT q O NA 取合酶浓度对 sI S R 反应的影响
图 4 结果表明 , aT q D N A 聚合酶浓度为 .0 5 、
1
.
0
、
1
.
5 和 .2 0 u/ 25 匹 时 , 均有扩增产物 。 当 aT q
图 5 . 引物浓度对 sI S R反应的影响 ( 引物 IS S R8 20 )
F ig
.
5
.
E fe e st o f Pln n er e ocn
e n。妞it on s on I S S R er a c tio n
印对m e r IS S 8R 2 0)
M
,
D皿以均 m山火e r冲刁 分别代表君迁子 、罗田甜柿 、上西早生和平核
无 ; 1礴 分别代表引物浓度 .0 2 、 .0 4 、 .0 6和 .0 8 拼m o比 .
M
,
D LZ IX )K m 山如er ; 合刁 代甲八粼川 〔以. PImU . 切以 ian t ian s h l ,
eU in hs i~
如d H in 劝犯周山 . ih ,旧户沁6vel ;y 1礴 “甲~
t
hct
c
onc
e n。妞 t ion o f P r u n er .o 2 , .0 4 . .0 6 aD d .0 8 卜m o比 , 传印忱 t i姆 ly ·
.2 5 退火温度对 sI S R 反应的影晌
农 业 生 物 技 术 学 报 0 2 (抖 年
退火温度对扩增结果影响较大 ,如图 6 显示 , 君
迁子中 sI S 8R 20 进行不同退火温度 CP R 扩增结果
表明 : 退火温度 54 ℃左右时扩增效果稳定 , 杂带及
弱带少 。 另外从 sI S R 861 不同退火温度扩增结果
看 , 在较低的退火温度下 , 扩增谱带产生 ~ asr
,扩
增出较多的弱带 , 电泳结果背景很重 ;在较高的退火
温度下 ,则主带变强且非特异性谱带减弱 ,为获得稳
定有效谱带 ,其退火温度选择低于其 T m Z℃ 。 解决
sm
e
asr 产生的部分途径可通过添加 2 % 甲酞胺和选
择合适的退火温度同 。 选择退火温度高于其 Tm Z~
4℃ , 均可得到良好的结果 , 同 B O r o e t 和 B arn e h山对网
和 H uan g 和 s un lq[ 的结果相一致
。 实验得 到
IS SR 80 9
、
8 20
、
82 5
、
84 1
、
847
、
857
、
859 和 86 1 的退火
温度分别选择为 57 、 54 、 54 、 5 7 、 5 7 、 57 、 5 7 和 6 0 ℃ 。
到稳定清晰的图谱 ,扩增片段大小在 30 一 15 0 如
之间 。 图 9 可以看出次郎及前川次郎 (次郎芽变品
种 ) 有 1条 70 bP 谱带差异 ,而富有则同上西早生
(富有系芽变品种 ) 和西村早生 (疑为富有杂交后
代 ) 则无谱带差异 ,所以要鉴别品种需要筛选适宜
的引物种类和数量 。
卜 M a l aZ a3 a4 as 面7 a s ag a l o a l l M b l bbZ 3M b s b命几b8 9卜l o b l l
10以
5以
飞 4 气 6 7 月 Q 1 0 1 1 1 ,
bP咪绷
图 6 . 退火温度对 IS SR反应的影响 ( 引物 sI S R 820 ,君迁子 )
Fi g
.
6
.
E fe e st o f an
侧吐in g et 侧eP浏汕韶 o n IS SR 化 ac it on
印俪“ IS S8R 20 , D a et PInUI )
.M D公侧 )o m . t er ; l ~ 12 分别代表退火沮度 4 9、 6 1℃ 。
M
,
D以口阅 . 目改“ ; 1一 12 叹甲
~
t
het 越山曰目吨 怡口伴伪加川韶
礴9阳 6 1℃ . 比即忱it姆 l y ·
图 7 . 模板 D N A 浓度对 Is R 反应的影响 ( 引物 IS S R 820 )
F ig
.
7
.
E fe e st o f et m Plat e D N A e onc
e n atr 石ons on IS S R er 朗it o n
印丘m e r 1SS R 82 0 ) ]
M, D U侧义】口曰生试 a 和 b分别代表君迁子和上西早生 ;卜 1 分别代
表模板 D N A浓度 10 , 2卜 10 和 12 0 n叭 5泌 。
城 D 2[ 弓洲洲】m毗眠 a an d b 哪n , 沈旧 t 〔恤et lP um an d U . lsb i w别记 ,
找 , 户 , it ve ly : 1一 1 1氏下
~
t ht e co 。创泊 tr川 i姗 o f t em PI心 DN A 1 0,
2小 l o an d 120 n叭 5泌滩印“ it v e ly .
M a l aZ a3 a4 as b l bZ b3从 b , M e l e Z e 3哄 c s d l dZ d3 d4 ds
1 0 0仆
.2 6 模板 O NA浓度对 IS S R反应的影响
反应体系中模板 D N A浓度对产物量有一定影
响 ,但其影响比上述因子小 。 图 7 中 , 以 sI SR 820 为
引物 , 当 25 灿反应体系中含有 10 一 12 0 gn 君迁子
模板 D N A 时 , 均能获得比较清晰的谱带 。 而在 25
两 反应体系中含有 40 一 120 gn 上西早生模板
D N A 时 , 均能获得比较清晰的谱带 ,考虑到结果稳
定性和降低模板 D N A 的用量 , 选择 2 .4 n岁卜L 为适
宜的模板 D N A 浓度 。
2 7 扩增循环数对 !S S R反应的影晌
CP R循环数对反应产物量有明显的影响 ,图 8 表
明在 35 个循环时 P C R 产物其丰度才能达到比较高
的程度 , 而 4 0 个循环时则有部分 mr e asr 产生 , 因此
循环数选择 35 。 电泳时凝胶浓度选择 2% 即可获得较
好的产物分离效果 ,且减少点样量和 s幻n e aI’s 产生 。
.2 8 柿月植物指纹圈谱构建
由柿属植物 6 个种 sI SR 820 ( 图 9 )以及不同
引物在君迁子中扩增电泳图 ( 图 10 )显示均可以得
图 8 . 扩增循环数对 IS S R反应的影响 ( 引物 ISS 8R 20 )
Fi g
.
8
.
E fe e st o f P CR eyc les on IS SR I’e a ` it o n (P ir m e r 1S SR 82 0 )
M
,
D口O阅 口目浅留 ;十 d 分别代表君迁子 、罗田甜柿 、上西早生和平核
无 ; l一5分别代表扩增循环数 2 0 、 2 7 、 30 、 3 5和 4() 。
M
.
D L2 1洲洲) m毗斌 卜d 娜“ , 沈口 t刀抽 t e IP侧口 , 切以 lan t i山招b i ,
U 。 吐如~ an d H汕
. at 口曰田妞加 , 找沼侧戈 it ve ly ; 卜5 叫国。 en t阮 p C R
c界 leS 2 0 , 27 , 3 0 , 3 5 an d 40 ,心衅石ve ly .
10 1 1 12
坤侧5o
图 9 . 柿属植物 sI S R 指纹图谱 ( 引物 sI S 8R 20 )
F ig
.
9
.
IS SR 血 g e pr inr int g o f D i创甲笋or s (P ir m e r IS SR 82 0 )
M
,
D U 《以 ) m毗留 ;
M
,
D皿O以】m . 永份 ;
泳道 1一 12 试材编号见表 1。
l ` 1 2 m 皿州ia N o二 e e Tab le l
第 5期 张青林等 :柿属植物 ISS R分析技术的建立
综上所述 , 适合于柿属植物 I S SR 分析的反应体
系 : 1 x B u fe r , M扩+ 2 . 0 或 2 . 5 n o比
,
dN T p s 0
.
2
~
。比 , 引物 .0 6 卜m 。比 , aT q D N A 聚合酶 IU , 甲酞
胺 2 % ,模板 ND A .2 4呵林L ,反应总体积 25 林;L P C R
扩增程序 : 94 ℃变性 3 m in , 94 ℃ 30 : ,仃m + 2) ℃ (根
据引物不同设定 ) 45 5 , 72 ℃ 1 . 5 m in , 35 个循环 ; 72 ℃
延伸 7 m i n ; 2%琼月剖睹凝胶电泳分离 P C R产物 。
的谱带 ,说明在不同的物种中 SS R 的序列及分布存在
差异 。 sI SR 反应得到的谱带较多 ,且难以分离开时 ,
选用 PA G E (加 ly a c守l田 rn id e 罗 1 e le e otr p ho er s i s )胶电
泳可获得较为理想的分辩效果阅 ,但是 P A G E 电泳存
在操作复杂 、费用较高等缺点 。
参 考 文 献
1阅
50
图 10 . 不同引物扩增产物电泳图 ( 君迁子 )
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.
10
.
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,
DU 峨x洲) m akr er ; 1一8 分别代表引物 IS S R 809 , 8 2 0 , 82 5 , 84 1, 8 4 7 ,
85 7
,
8 5 9 和 8 6 1。
M
,
D LZ峨x洲) m 出触er : l一8 代甲比断泊 t P n m er IS S R 809 , 8 2 0 , 8 2 5 , 84 1 , 84 7 ,
8 5 7
,
85 9 an d 8 6 1
, 代 s沐 c it 姆 ly .
3 讨论
CP R 扩增实验反应体系对于不同的物种 ,其实验
参数均有差异 ,没有一种普遍适宜的反应条件 。 本实
验建立了适于柿属植物 sI S -R P C R 反应体系 。 由于
PC R 扩增受到许多因素的影响 ,因此筛选并固化该反
应翻拟寸于获得稳定清晰的电泳结果是十分必要的。
影响 PC R 扩增比较重要的因素有 M广 浓度 ,
由汀 P s 浓度 , aT q D N A 聚合酶活性 , 引物浓度 ,退火
温度 , 循环次数 ,模板 D N A 浓度等 。 在本实验中 ,适
宜的 M扩+ 浓度对于 I s R 反应起着重要作用 , 因为
M广 能够增强酶蛋白的稳定性且是维持酶活性的
重要辅助因子 , 增加 ds D N A 的 T m 值 , 提高了融合
温度 , 与游离的 d N T P s 形成可溶性复合物 , 有利于
d N T p s 的掺人 , 因此本实验中采用较高的 M广 浓
度 , 但不同引物所需 M扩十浓度不同 ,其原因尚待进
一步研究 。为获得清晰稳定的扩增效果 , 本实验普遍
提高了引物退火温度及 dN T P s 浓度 , 同 B o m et 和
B arn hc adr
网 、余艳 1 ’ l等的报道相一致 。 由于 曲汀 P s 能
鳌合 M广 , 当 d N丁 , s浓度选择 .2 0~ 。比
,也要相
应增加 M犷 浓度 , 部分解释了 M广浓度为何要选
择大于 2 . 0 ~ 。比 。 而 aT q ND A 聚合酶的活性对于实验也起着不可忽视的作用 , 因此购买同一批次的
试剂对于实验的可重复性有重要意义 。
不同物种有效的 sI S R 引物不同 , 需要经过对大
量 sI S R 引物筛选才能获得稳定 、 清晰的可用于分析
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