全 文 ：巩艳明，宗成文，曹后男，等． 6 个梨属砧木的 S基因型鉴定［J］． 江苏农业科学，2011，39(6) :235 － 236．
6 个梨属砧木的 S基因型鉴定
巩艳明，宗成文，曹后男，金 灿，朴日子
(延边大学农学院，吉林延吉 133002)
摘要:利用梨的自交不亲和基因(S － RNase )特异引物“FTQQYQ”和“ anti － IIWPNV”，对 6 个梨砧木品种(山
梨、S2、S5、S7、PDR54、极矮化种质)的基因组 DNA进行 S基因特异扩增，并对扩增片段进行回收、克隆、测序，使用生物
信息学软件对各序列进行分析和同源性搜索比对，最终确定各品种的 S基因型。鉴定结果:山梨为 S12 Sx，S2 为 S1S17，
S5 为 S17S31，S7 为 S1S17，PDR54为 S4S8S17，极矮化种质为 S1S17。
关键词:梨;自交不亲和性;DNA序列;S基因型
中图分类号:S661． 203． 6 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2011)06 － 0235 － 02
收稿日期:2011 － 01 － 28
基金项目:国家自然科学基金(编号:30560091、30960231) ;延边大学
研究生科研项目(编号:延大研科合字 2010 － 35)。
作者简介:巩艳明(1985—) ，女，吉林梅河口人，硕士研究生，主要从
事果树生物技术研究。E － mail:qiuzi198504@ 163． com。
通信作者:宗成文，博士，副教授。Tel: (0433)3264624;E － mail:
zongchengwen@ yahoo． com． cn。
我国是世界栽培梨的重要起源中心之一，梨品种资源丰
富，是世界产梨第一大国。梨树可以通过嫁接来提高抗逆性、
改良品种性状以及实现矮化密植栽培等，因此砧木的优良品
种培育非常重要。梨是典型的配子体自交不亲和性果树，其
自交不亲和性由 S基因位点的复等位基因所控制［1］，确定梨
砧木品种 S基因型可以为杂交育种的亲本选配、授粉品种的
选择提供依据。试验所用试材中，山梨为野生秋子梨，是我国
华北、东北、河北东北部梨区广泛应用的砧木，耐寒性强;S2、
S5、S7、PDR54是由中国农业科学院果树研究所贾敬贤等培育
的有矮化潜力的梨属砧木［2 － 4］，这些砧木表现出抗病、促矮
化、早结果、早丰产的优良特性;极矮化种质是从延边小香水
梨实生后代中发现的矮化紧凑的突变体，其抗寒性强于 S2、
OH × F51、OH × F69、PDR54等砧木，且抗病性也较强，是矮化砧
木育种非常珍贵的种质资源［5］。本试验对以上砧木资源的 S
基因进行鉴定，丰富了我国梨 S基因型信息，同时为梨属砧木
育种的亲本选配提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供试砧木品种为山梨、S2、S5、S7、PDR54、极矮化种质。山
梨采自延边大学农学院果树试验场，S2、S5、S7、PDR54采自中
国农业科学院兴城果树研究所，极矮化种质采自吉林省珲春
市北山果园。于春季采集各品种幼嫩叶片，－ 20 ℃保存
备用。
1． 2 试剂
试剂有 rTaq 聚合酶、Ex Taq 酶、dNTPs、载体 PMD19 － T
vector，均购自大连宝生物工程有限公司，引物由南京基天生
物公司合成，凝胶回收试剂盒、DNA 提取试剂盒购于长春市
德双科技有限责任公司。
1． 3 基因组 DNA提取
参照植物基因组 DNA 提取试剂盒说明书(柱式植物
DNAout2． 0，北京天恩泽基因科技有限公司生产)提取梨基因
组 DNA，在 1%琼脂糖凝胶、1 × TAE缓冲液、3 ～ 5 V /cm下电
泳，电泳结果用上海复日 FR － 980 凝胶图成像系统照相，检
测 DNA样品。
1． 4 PCR扩增及检测
根据 S基因一级结构特点，利用 S 基因高变区(hyper
variable region，HV)的保守序列设计合成引物。正向引物:
FFQQYQ(5 － TTTACGCAGCAATATCAG －3) ，反向引物:anti
－ IIWPNV(5 － AC(A /G)TTCGGCCAAATAATT － 3)。在谭
晓风等扩增反应体系［6］的基础上略作调整，使用 Ex Taq 酶保
证扩增结果的可靠性，扩增产物在 1． 4% 琼脂糖凝胶上于
100 V电泳 30 ～ 45 min，上海复日 FR － 980 凝胶图像系统分析
拍照并记录分析。
1． 5 PCR产物回收、克隆、测序
利用凝胶回收试剂盒回收目的 DNA 片段，与 PMD19 － T
载体(TaKaRa)16 ℃条件下过夜连接，连接产物转化至感受
态大肠杆菌 DH5α，涂于 LB /Amp50 固体培养基上 37 ℃过
夜。挑选阳性克隆，菌液 PCR 筛选带有目的片段长度的克
隆，菌液 PCR体系程序见“1． 4”(DNA 聚合酶改用 rTaq 酶)。
每个 S基因片段挑选 4 个阳性克隆，送南京基天生物公司测
序。测序结果利用 Blastn与 GenBank 中已知的 S － RNase 基
因序列比较，确定其 S基因型。
2 结果与分析
2． 1 S基因特异性扩增
采用 S等位基因特异性引物 PF(FTQQYQ)和 PR(anti －
IIWPNV)进行 PCR扩增，其结果如图 1 所示。
电泳结果显示每个梨品种都扩增得到了 1 条或 2 条 S 基
因特异片段，大小在 300 ～ 1 300 bp。S5、S7 扩增出 2 条带;极
矮化种质、S2、山梨只扩增出 1 条带，说明这 3 个梨砧木品种
的 S等位基因片段大小相差很小;PDR54扩增出 3 条带，2 条
带明显，1 条带不明显。
—532—江苏农业科学 2011 年第 39 卷第 6 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2011.06.215
2． 2 梨品种 S基因型的鉴定
将测定的序列进行多序列比对，参考 GenBank 已登录的
梨 S基因的特点，首先按照植物内含子特有的 5 － GT、
3 － AG的界线，确定内含子边界，推导氨基酸序列，然后再通
过 Blast搜索分析确定其身份，最终这 6 个梨砧木品种的 S基
因型如表 1 所示。
各品种中，S基因的核苷酸序列与 GenBank 中已登录的
梨 S基因有极高的相似性。山梨中的 S基因与 S12，S2 中的 S
基因与 S17，S7 的 S基因与 S17，PDR54中的 S基因与 S4，极矮化
种质中的 S 基因与 S17、S1 等 6 个 S 基因的相似性高达
100%，所以可以确定它们的 S 基因。S2 中的 S 基因与 S1，S5
中的 S基因与 S17，S7 中的 S 基因与 S1，PDR54中的 S 基因与
S17、S8 等 5 个 S 基因的相似性高达 99%。S5 中的 S 基因与
S31同源性达 96． 0%。
表 1 梨砧木品种的 S基因型
品种或类型 来源或亲本
PCR产物大小
(bp)
内含子长度
(bp) S基因型
核苷酸相似性
(%)
山梨 野生 536 342 S12、Sx 100
S2 锦香梨(南果梨 ×巴梨)实生 341、367 141、167 S17、S1 100、99
S5 锦香梨(南果梨 ×巴梨)实生 341、511 141、317 S17、S31 99、96
S7 锦香梨(南果梨 ×巴梨)实生 341、1 415 141、1 215 S17、S1 100、99
PDR54 香水梨 ×巴梨 341、368、434 141、168、234 S17、S4、S8 99、100、99
极矮化种质 延边小香水梨实生 341、367 141、167 S17、S1 100、100
以上 S基因扩增片段，其 HV 区和 GenBank 中登录的相
应的 S基因完全一致，推导的氨基酸序列和对应 S 基因的氨
基酸序列的相似性也达到了 100%，可以认定为同一基因。
3 结论与讨论
极矮化种质是延边小香水梨偶然实生矮化突变体，其叶
片大、叶色浓绿、枝皮率高、树冠矮小紧凑，具有较强的光合性
能;同时对梨黑星病和中国梨木虱等梨的主要病虫害具有较
强的抗性。如果能够根据极矮化种质的 S基因型推测出其亲
本，将对其致矮机理的研究起到一定辅助作用。延边地区多
采用鸭梨和雪花梨花粉为当地主栽梨品种授粉，而鸭梨和雪
花梨的 S基因分别为 S21 S24
［7］和 S4 S10
［8］，并不与极矮化种质
存在至少 1 条 S基因相同，不符合孟德尔遗传规律，因此可以
排除。在附近同时期种植的梨品种中，苹果梨花期较极矮化
种质晚，延边大香水、延边小香水、小香水芽变、延边明月梨为
雄性不育品种。谢花甜与小香水花期基本相同，且 S 基因型
为 S17 S31，因此，可以初步推断，极矮化种质的父本有可能是
谢花甜。此结论有待于进一步验证。
锦香梨是南国梨和巴梨杂交的实生后代，南国梨的 S 基
因型为纯合的 S34 S34
［9］，因此可以确定锦香梨的 1 条 S基因为
S34;矮化砧木 S2、S5、S7 均为锦香梨实生后代，S 基因型分别
为 S1S17、S17 S31、S1S17，共同拥有 1 条 S17，因此可以初步推断，
锦香梨的 S基因型为 S17 S34。
PDR54的 S基因型为 S4S8 S17，为三倍体。山梨、S2、S5、S7、
极矮化种质的 S 基因型分别为 S12 Sx、S1 S17、S17 S31、S1S17、
S1 S17。
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—632— 江苏农业科学 2011 年第 39 卷第 6 期