全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2014 年
收稿日期：2014－07－15
基金项目：国家自然科学基金项目（31171929）；公益性行业（农业）科研专项（201203047）
作者简介：罗 纯（1984－），女，湖北武汉人，助理研究员，博士，主要从事果树种质资源与分子遗传育种研究，（电话）0759－2859312
（电子信箱）luochunclock＠126．com；通讯作者，罗正荣，（电子信箱）luozhr＠mail．hzau．edu．cn。
第 53 卷第 22期
2014年 11月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 53 No.22
Nov.，2014
简单重复序列 （Simple sequence repeats，SSR）
分子标记技术通常又称为微卫星标记（Microsatel-
lites），它是指以 1～6 个核苷酸为单位多次串联重复
的 DNA序列。 与其他分子标记技术相比，SSR 标记
具有多态性高、 共显特性、 易用聚合酶链式反应
（Polymerase chain reaction，PCR）检测、重复性强 、
数量丰富和对基因组有很好的覆盖性等特点 ［1］。 根
据 SSR 的来源可将其分为基因组 SSR 和表达序列
标签（Expressed sequence tag，EST）－SSR。 EST是来
自随机选取的特定处理的 cDNA 克隆末端序列，能
反映 mRNA 的信息，在功能基因组研究中具有重要
意义。 EST－SSR 与基因组 SSR 标记相比，具有不同
物种间通用性较好、开发方法简单及成本低廉等优
点［2］。 而且 EST－SSR 标记来自于基因的编码序列，
更容易获得基因表达的信息，所以现在已成为重要
的农作物农艺性状定位、遗传作图、遗传多样性、比
较基因组学研究的新型工具。 目前，大麦（Hordeum
vulgare L．） ［3］、小麦 （Triticum aestivum L．） ［3］、油菜
（Brassica campestris L．） ［4］、柑橘 （Citrus reticulata
Blanco）［5］等许多农作物已从公共数据库中成功地开
柿 EST－SSR标记在柿属植物中的通用性研究
罗 纯 1，2，张青林 1，罗正荣 1
（1.华中农业大学园艺林学学院 ／园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070；
2.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 ／农业部热带果树生物学重点实验室，广东 湛江 524091）
摘要：公共数据库和柿转录组测序产生的大量 EST 序列为开发新的 SSR 标记提供了有效资源。我们在前
期利用这些数据开发出 112 个 EST－SSR 标记，此次研究选用其中 11 个标记对柿属（Diospyros L.）15 个
种 20 份试材进行了标记通用性检测。 结果表明，所有引物均能扩增出产物，多态性引物比率达 100％，并
且 UPGMA 聚类结果可靠，说明柿 EST－SSR 标记在近缘种中可以通用。 上述通用性标记为柿属植物遗传
多样性研究提供了标记资源。
关键词：柿属植物（Diospyros L.）；EST－SSR 标记；通用性
中图分类号：Q949．775．3；Q943．2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2014）22－5434-04
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2014．22．026
Transferability of the EST－SSRs Developed from Diospyros kaki to other Diospyros Species
LUO Chun1，2，ZHANG Qing－lin1，LUO Zheng－rong1
（1． College of Horticulture ＆ Forestry Science， Huazhong Agricultural University ／ Key Laboratory of Horticultural Plant Biology， Wuhan
430070， China； 2． South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences ／ Key Laboratory of
Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang 524091， Guangdong， China）
Abstract：The data of transcriptomic sequencing and growing availability of EST （Expressed sequence tag） sequences from
Diospyros kaki Thunb． provide a potential valuable source of new SSR （Simple sequence repeats） markers． One hundred and
twelve EST－SSR markers were developed explored in previous studies and eleven markers were used to amplify 20 genotypes
of 15 species of Diospyros L． to assess the transferability and polymorphism． The results showed that all primers amplified
successfully with the rate of polymorphic primer of 100％ indicating that the EST－SSR markers developed from D． kaki could
be applied in its related species． These transferable markers are useful for analyzing genetic diversity of Diospyros.
Key words： Diospyros L．； EST－SSR markers； transferability
第 22 期
发出了大量的 EST－SSR标记。
柿（Diospyros kaki Thunb．）是柿科（Ebenaceae）
柿属（Diospyros L．）植物中作为果树栽培的代表种，
其栽培历史已有二千余年。中国是柿属植物的分布中
心和原产中心之一，拥有丰富的种质资源。目前，已利
用多种分子标记技术对柿属植物进行了遗传分析，
如Du等［6］在柿上开发了反转座子标记，Guo等［7］利用
简单序列重复区间扩增多态性 （Inter－simple se-
quence repeat，ISSR）技术开发了 SSR 标记。 我们也
开发了 EST－SSR和靶位区域扩增多态性（Target re-
gion amplified polymorphism，TRAP）标记 ［8，9］，并在柿
品种间进行了遗传分析，但是这些标记对于柿属其他
种植物是否能通用尚需进一步试验。本研究利用前期
开发的 11 个 EST－SSR 标记对柿属 15 个种 20 份试
材进行了标记通用性评价，旨在为柿及其近缘种种质
鉴定及遗传多样性分析提供实用、高效的研究工具。
1 材料与方法
1．1 材料和模板 DNA的提取
利用柿属 15 个种的 20 份材料（表 1）进行标记
通用性评价。 采用 CTAB 法提取材料基因组 DNA，
参照程运江等［10］的方法并作适当改动。 试验所用引
物序列基本信息见表 2。
1．2 扩增反应体系
PCR反应体系 20 μL，其中包括：1×Buffer，20 ng
DNA 模板，1．5 mmol/L MgCl2，0．1 mmol/L dNTPs，0．8
μmol/L 引物 ，1 U Taq 酶 。 扩增反应是在德国
Biometra TProfessional PCR 仪上进行， 扩增程序如
下：94 ℃预变性 2 min；94 ℃变性 45 s，55 ℃（不同引
物退火温度不同）复性 1 min，72 ℃延伸 75 s，35 个
循环；72 ℃延伸 5 min。 试验所用引物序列的基本信
息及各引物退火温度见表 2。
1．3 凝胶电泳及银染
SSR 扩增产物通过 6％变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳分离后进行银染 ［11，12］，用数码相机拍照保存电泳
图谱。 根据图谱分析各 EST－SSR 位点的扩增情况，
包括是否扩增、各位点在不同种中所得到的等位基
因数量， 根据 DNA 分子量标准估算等位基因片段
的大小。
1．4 遗传多样性分析
对 11 个柿 EST－SSR 位点在 20 份柿近缘种中
的扩增结果 DNA 谱带进行数字化统计， 有带的位
置记为 1， 无带的位置记为 0。 将所有试验数据在
Microsft Office Excel 2003 软件里进行标准化处
理， 利用 NTSYSpc 2．10e 分析软件构建数据矩阵；
在 Simint程序下选择 Dice 系数计算 20 份柿近缘种
间的遗传相似系数 ， 采用非加权组平均法 （Un-
weighted pair－group method with arithmetic means，
UPGMA）建立相应的系统树状树，通过聚类划分类
表 1 用于 EST-SSR 通用性研究的柿属试材
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
中文名
版纳柿
法国柿
黑皮柿
野毛柿
乌柿
岭南柿
油柿
金枣柿
美洲柿
浙江柿
青茶柿
乌材
象牙树
君迁子
丽江君迁子 1
丽江君迁子 3
丽江君迁子 4
丽江君迁子 5
丽江君迁子 6
苗山柿
学名
Diospyros xishuangbannaensis
C.Y.Wu et H.Chu.
D. argentea Griff.
D. nigrocarter C. Y. Wu.
Diospyros sp.
D. cathayensis Steward.
D. tutcheri Dunn.
D. oleifera Cheng.
Diospyros sp.
D. virginiana L.
D. glaucifolia Metc.
D. rubra Lec.
D. eriantha Champ. ex Benth.
D． ferrea （Willd．） Bakh．
D. lotus L.
D. lotus L.
D. lotus L.
D. lotus L.
D. lotus L.
D. lotus L.
D. miaoshanica S. Lee.
染色体倍性
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝4x＝60
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝4x＝60
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
2n＝2x＝30
起源地
中国
阿根廷
中国
中国
中国
中国
中国
中国
美国
中国
中国
中国
中国台湾
中国
中国
中国
中国
中国
中国
中国
表 2 11 对柿 EST-SSR 引物的信息
引物
编号
1554
1430
6615
5845
8125
4379
8917
6665
9004
460
5553
重复
基元
（CAT）6
（GAG）5
（CTT）7
（CCCT）3
（GGC）4
（GAG）9
（AT）10
（TA）9
（GCAGGA）3
（AT）12
（GTAGTG）3
预期产
物//bp
190
270
229
173
185
205
163
180
243
189
223
退火温
度//℃
55
60
55
58
58
58
55
60
55
55
58
引物序列
（5′→3′）
F: CACCGCATCCTCTTCGACATCC
R: ACGCATCCGTCAAATCACAACA
F: AGCTGCGGGCATCTGATCCAGT
R: GCCGACGACGAGGCACAGTTTT
F: ACACTCCACTCTACCCAAATACC
R: GACATCATAAGTCAAAGCACGAA
F: AAACTGCGTCTTCTTCTTGCGATTC
R: CGGGTGCTCCATCACTTCTTCA
F: TTATCCCATCAAAGCAACCCAC
R: CTGCCAACTTCTTCTCCATCTCC
F: TGACTCTGCTCCACAGGCACTTC
R: CTCGTCTGGCAATTCTGCTTCG
F: ACACGTTCAGTACCATGAGGGA
R: AGTACCACAAACCACCAGTGG
F: TGACCAACCCCAAAGTGTGGGAG
R: AGGTCCCTCTGGTGAGCACATGC
F: GCCACAAACTTCACAGAGGACC
R: AGGCGAGTGCGAGTAAGACGAA
F: CACAACAGTGAGACAGCCAACTG
R: ACAAACCACCAGTGGCCGGAG
F: CCAGTTGATGGCAATGGGAGGC
R: GGTGCGATGTTGGAGGGAAGAG
罗 纯等：柿 EST－SSR 标记在柿属植物中的通用性研究 5435
湖 北 农 业 科 学 2014 年
表 3 11 对柿 EST-SSR 引物在 20 份近缘种中的扩增情况
物种中文名
版纳柿
法国柿
黑皮柿
野毛柿
乌柿
岭南柿
油柿
金枣柿
美洲柿
浙江柿
青茶柿
乌材
象牙树
君迁子
丽江君迁子 1
丽江君迁子 3
丽江君迁子 4
丽江君迁子 5
丽江君迁子 6
苗山柿
1554
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
3
-
1
1
-
1
1
1
-
-
1430
3
2
2
4
3
2
2
2
2
2
2
2
4
4
2
2
2
2
2
2
6615
2
1
1
1
2
2
1
1
2
1
1
-
1
2
-
2
-
2
-
1
5845
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
6665
2
1
2
2
2
1
1
2
2
2
1
1
2
2
-
2
-
2
2
1
8125
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
-
-
1
1
1
-
1
1
1
4379
1
1
1
1
1
1
2
1
2
2
-
1
1
2
-
2
-
2
2
1
8917
3
3
3
2
4
8
2
2
5
5
2
-
3
4
-
3
-
1
-
4
9004
1
1
2
1
2
2
3
1
4
2
1
1
3
1
-
-
1
1
-
1
460
3
4
3
3
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
-
2
2
2
1
1
5553
1
1
2
2
3
4
1
2
3
3
4
1
1
3
1
1
1
1
2
2
EST-SSR 引物//条
群来完成聚类分析。
2 结果与分析
2．1 柿 EST－SSR引物在柿近缘种中的扩增结果
11 对柿 EST－SSR 引物在 20 份柿近缘种中的
扩增结果分别见表 3、图 1。 由表 3 可以看出，在所
有的 11 对 EST－SSR 引物中， 以引物 1430、5845 与
5553 的通用性最高， 可在所有 20 份柿近缘种材料
中得到扩增片段；而其他 8 对引物都在某些材料中
没有扩增产物出现，如引物 460 在丽江君迁子 1 以
外的其他近缘种中都得到了扩增产物； 引物 6665
也有较高的通用性，除了在丽江君迁子 1 和丽江君
迁子 4 中没有得到扩增产物外，在其他的近缘种中
都得到了清晰的扩增条带。引物 8125、4379和 9004
在 3个近缘种中无扩增产物。引物 1554、6615、8917
在 4个近缘种中无扩增产物，通用性稍低。
2．2 EST－SSR扩增图谱分析
对 11 个 EST－SSR 位点在 20 份柿属植物中的
扩增图谱（图 1）进行分析。结果表明，在扩增与否和
各位点扩增的等位基因数量方面，不同种间存在着
差异。 从 EST－SSR位点的扩增情况来看，丽江君迁
子 1 除了引物 1430、5845、8125 和 5553 可得到目
1～20:柿属 15 个种的 20 份材料；M:pBR322 DNA ／MspI 分子量标准；A:引物 5845；B：引物 4379；C:引物 9004；D：引物 6615
图 1 4 对柿 EST－SSR 引物在柿近缘种中的扩增图谱
5436
第 22 期
的扩增产物外， 在其他 7 个位点中均无扩增产物，
可扩增位点较少；乌材、丽江君迁子 4 和丽江君迁
子 6 分别得到 7、6、7 个可扩增位点；青茶柿、象牙
树、 丽江君迁子 3 和苗山柿各自除一个位点外，其
他 10 个位点均能有效扩增；其他 12 份近缘种材料
在所供试的 EST－SSR位点均有目的产物扩增出来。
从表 3 各 EST－SSR 位点所得到的等位基因数
目来看， 各近缘种所得到的等位基因数目差异较
小。 各个近缘种材料在 8917、1430位点上扩增得到
的等位基因数较多，其中，岭南柿在 8917 位点上得
到等位基因数目最多，为 8个。 位点 1554所表现的
多态性较低，除黑皮柿和青茶柿分别扩增出 2 个和
3 个等位基因外， 所检测的其他材料在该位点上表
现为单态或无扩增。
2．3 UPGMA聚类分析
20 份柿近缘种 EST－SSR 分析的 UPGMA 聚类
分析结果见图 2。从图 2可见，由于试验材料是柿属
中不同的种，除各类君迁子外，其他种间的相似系
数都比较低。 所有材料中，最大的 Dice 相似系数为
0．909（丽江君迁子 3 和丽江君迁子 5 之间），最小的
为 0．059（乌材和岭南柿之间）。 乌材与供试其他材
料之间的相似系数均很小，说明乌材与之的亲缘关
系都非常远，是否是个更古老的野生种，有待进一
步确认。 而各类君迁子之间的亲缘关系较近，聚在
一起后与浙江柿相聚，说明浙江柿是与君迁子亲缘
关系最近的一个近缘种。
3 小结与讨论
为检测在柿栽培种中开发的 EST－SSR 引物对
其近缘种的通用性高低， 我们利用 11 对 EST－SSR
引物，以 20份柿近缘种为试材进行了测试。 结果这
11 对引物均能扩增出产物， 且多态性引物比例为
100％， 表明柿 EST－SSR 引物对其近缘种是可通用
的，而且显示的多态性频率很高。 EST-SSR 标记引
物是根据其侧翼序列设计的，因此侧翼序列的保守
程度决定着 EST－SSR引物在不同种间的通用性。试
验中 ， 不同 EST－SSR 引物的通用性不同 ， 引物
1430、5845 与 5553 在所有 20 份柿近缘种材料中都
能成功扩增， 而引物 1554、6615、8917 在 4 个近缘
种中无目的扩增产物，这很可能就是它们各自对应
EST-SSR的侧翼序列的保守程度不同所造成的。
20 份柿近缘种的 UPGMA 聚类分析结果表明，
供试的 EST－SSR 标记在种间进行遗传分析是比较
可靠的。 比如各类君迁子属于同一个种，它们能够
很好地聚在一起， 并且与浙江柿亲缘关系较近，此
结果与前人研究的一致［13］。
与基因组 SSR 标记相比， 由于 EST－SSR 来源
于基因组编码序列，其保守程度更高，因此比基因
组 SSR具有更高的种间通用性［2，14，15］。 目前，高通量
测序技术可以产生海量的 EST 序列，这为大量开发
EST－SSR标记提供了充足的序列来源。 试验前期分
别利用公共数据库及自主转录组测序获得的柿 EST
序列开发了 100余个 EST－SSR 标记，根据本试验的
结果， 柿 EST－SSR标记具有很高的种间通用性，这
就有效地弥补了柿近缘种分子标记的不足，提高了
该标记的利用价值，为柿近缘种的种质鉴定及遗传
分析等研究工作提供了标记资源。
参考文献：
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vealed by simple sequence repeat［J］． Trends in Plant Science，
1996，1（7）：215－222．
［2］ VARSHNEY R K， GRANER A， SORRELLS M E． Genic mi-
crosatellite markers in plants： Features and applications ［J］．
Trends in Biotechnology， 2005， 23 （1）： 48－55．
［3］ THIEL T， MICHALEK W， VARSHNEY R K， et al． Exploit-
ing EST database derived for the development and characteri-
zation of gene SSR－markers in barley （Hordeum vulgare L．）
［J］．Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）： 411－422．
［4］ 李小白，张明龙，崔海瑞．油菜 EST 资源的 SSR 信息分析［J］．中
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［5］ CHEN C， ZHOU P， CHOI Y A， et al． Mining and charac-
terizing microsatellitesfrom citrus ESTs［J］． Theoretical and Ap-
plied Genetics， 2006， 112 （7）： 1248－1257．
［6］ DU X Y， ZHANG Q L， LUO Z R． Development of retrotrans-
poson primers and their utilization for germplasm identification
in Diospyros spp． （Ebenaceae） ［J］． Tree Genetics ＆ Genomes，
2009， 5 （1）： 235－245．
［7］ GUO D L， LUO Z R． Development of SSR primers using IS-
SR－PCR in Diospyros kaki Thunb． ［J］． Molecular Ecology
Notes， 2006， 6 （3）： 886－887．
图 2 20 份柿近缘种材料 EST－SSR 分析
的 UPGMA 聚类图
版纳柿
法国柿
野毛柿
油柿
黑皮柿
象牙树
乌柿
岭南柿
美洲柿
苗山柿
浙江柿
君迁子
丽江君迁子 1
丽江君迁子 3
丽江君迁子 5
丽江君迁子 4
丽江君迁子 6
金枣柿
青茶柿
乌材
0.12 0.33 0.53 0.74 0.95
（下转第 5462页）
罗 纯等：柿 EST－SSR 标记在柿属植物中的通用性研究 5437
湖 北 农 业 科 学 2014 年
产生决定性影响［4］。由表 6可知，试验Ⅰ组 pH24高于
试验Ⅱ组，且二者均在正常范围内；剪切力是肌肉
嫩度的衡量标准，其可以反映猪肉质地和肌肉蛋白
质结构特性。 试验Ⅰ组的测定值低于Ⅱ组，可以反
映出试验Ⅰ组的口感要更嫩一些；滴水损失是推断
肌肉保水力的指标之一， 试验Ⅱ组的保水性能更
强；熟肉率是猪肉烹调损失的衡量指标，试验Ⅰ组
烹调损失高于Ⅱ组，与滴水损失测定结果相对应。
3 小结与讨论
可乐猪是贵州省优良地方品种，主产于在喀斯
特高寒山区，具有适应性强、耐粗饲、生长速度缓
慢、胴体瘦肉率偏低等特点。 采用全舍饲饲养，虽提
高了生长速度，但可乐猪的发病率有所增高，并且
猪肉品质有所下降。 本研究发现，相对于全舍饲饲
养，半舍饲半放牧的饲养方式虽日增重偏低，延长
了出栏时间，但饲料转化率和饲料报酬有所提高 ［6］。
与张宗庆等 ［7］报道的“可乐猪新品系”肥育性能相
比，试验Ⅱ组的日增重较低，这与“可乐猪新品系”
导入了一定比例杜洛克血液有关；二者饲料报酬两
者差异不大，说明本课题组组建的被毛全黑的可乐
猪群体与导入杜洛克血液的“可乐猪新品系”饲料
转化率相近。 营养是可乐猪达到最佳增重和产肉效
果的重要因素，可通过调整种植牧草种类等措施来
保证可乐猪营养需要。 屠宰测定结果表明，半舍饲
半放牧模式对可乐猪胴体品质无明显影响，而屠宰
率、大理石纹评分、滴水损失和熟肉率等指标有所
改善和提高。 说明良好自然环境，充足的牧草和水
源及充分的活动空间有利于可乐猪健康生长。
本项目实施区毕节地区平均海拔 1 600 m，年平
均气温 13．6 ℃，降雨量 1 129．04 mm。 每年 4～10 月
份月平均气温在 10 ℃以上 ［8］，为适合放牧的季节，
故每年最多放养两批肥育猪，同时由于可用的放养
区有限，目前进行多批次、大规模饲养还有一定难
度。 但通过合理开发利用山地资源，进行人工牧草
种植，合理放牧，生产特色优质猪肉，将会有广阔的
市场前景和良好的经济效益。
参考文献：
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牧兽医，2007，31（5）：28－30．
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［3］ 陈润生．优质猪肉的指标及其度量方法［J］．养猪业，2003（3）：1－5．
［4］ 金深逊，戴 燚，张忠庆，等．贵州喀斯特高寒山区可乐猪肉质研
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［5］ 周训军，张依裕，胡 尚，等．贵州高坡猪肉质测定初报［J］．猪业
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表 6 不同试验组可乐猪 pH24、剪切力、滴水损失和熟肉率
组别
试验Ⅰ组
试验Ⅱ组
pH24
6.13±0.32
6.00±0.28
剪切力//kg
2.73±0.37
2.90±0.48
滴水损失//%
2.54±0.29
2.16±0.77
熟肉率//%
60.31±1.03
61.76±2.20
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（责任编辑 王 珞）
（上接第 5437页）
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（责任编辑 程碧军）
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