全 文 ：柳属植物ITS序列分析
刘明航 朱芳明 刘 峥 张汉尧 *
（西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南，昆明650224）
摘 要： 本文分析了垂柳、曲枝垂柳、旱柳和龙爪柳以及其他柳属植物属内种间系统发育关系。提取垂
柳、曲枝垂柳和龙爪柳基因组DNA，对其内转录间隔区（ITS） 序列进行PCR扩增和序列测定。采用BLAST方
法将植物内转录间隔区（ITS） 序列在GenBank中进行同源搜索，应用邻接距离距阵法，建立柳属共19种的ITS
序列的系统发育树，并探讨了其亲缘关系。结果表明，垂柳、曲枝垂柳、旱柳和龙爪柳应属于同一种，其关系
为种内变异水平，与经典分类方法中垂柳与旱柳为两个不同种存在分歧。
关键词：柳属；ITS序列；系统发育树；亲缘关系
中国分类号：S718.49 文献标识码：B
Phylogenetic Relationship Among Salix Species Based on ITS Sequences
LIU Ming-Hang, ZHU Fang-Ming, LIU Zheng, ZHANG Han-Yao*
(Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China, State Forest Administration, Southwest Forestry University,
Kunming, Yunnan 650224, China)
Abstract: Phylogenetic relationships among spec ies of Salix were revealed in this paper. Genomic
DNA of Salix babylonica, Salix babylonica f. tortuosa and Salix matsudana f. tortuosa were extracted, and
their internal transcribed spacer region (ITS) sequences were amplified by PCR, and sequenced. The other
ITS sequences of Salix species were acquired from the GenBank by the means of BLAST. Neighbor joining
method was used to construct phylogenetic tree of those species, and genetic relationships among them were
discussed. Sequences analysis indicated that Salix babylonica, Salix babylonica f. tortuosa, Salix matsudana
f. tortuosa and Salix matsudana actually belong to one species. The results are different with the classical
classification that Salix babylonica and Salix matsudana are two species.
Key words：Salicaceae; ITS sequences; Phylogenetic tree; Relationship
收稿日期：2012-11-09
作者简介：刘明航（1990－），男，本科生，西南林业大学林学院，林学专业。
*通讯作者：张汉尧，男，1975年6月出生，教授，归国博士后，研究方向为分子遗传。E-mail：hanyaoz@163.com
基金项目：云南省省院省校教育合作咨询、共建省级重点学科项目和国家林业局948项目（编号：2012-4-62）资助。
杨柳科（Salicales） 是双子叶植物纲，杨柳目
唯一的科，含3个属，分别为杨属（Populus）、钻
天柳属 （Chosenia）、柳属 （Salix），约 620 多种。
柳属植物为乔木或匍匐状、垫状、直立灌木。叶互
生，稀对生，通常狭而长，多为披针形。葇荑花
序，雄蕊2-多数，雌蕊由2心皮组成。蒴果2瓣
裂，种子小。主产北半球温带地区，寒带次之，亚
热带和南半球极少。我国257种，122变种，33变
第40卷 第4期
2012年11月
贵 州 林 业 科 技
GuizhouForestryScienceandTechnology
Vol.40，No.4
N v.，2012
4期
型，各省区均产[1]。柳属植物具有生态适应性强，
生长快，繁殖易，轮伐期短，易管理和用途广的特
点[2]，为重要的保土、固堤和护岸、防沙树种，还
常作庭园观赏与行道树。柳属植物因其单位面积
产生的生物量高、对温室气体具有独特的吸收作
用，具有很高的开发价值，在这方面国际上已有
广泛研究[3]。
目前对柳属植物分类，主要采用经典分类方
法，以形态特征和生态分布为依据，与系统演化的
联系较少。然而该属植物雌雄异株，极易杂交，多
先叶开花，花期短，叶形多变，在识别上造成了较
大困难[1]，难以反映分类群之间的系统发育和亲缘
关系。一般认为杨柳科包括三个属，即杨属、钻天
柳属及柳属。但由于柳属划分出来的钻天柳属是否
成立尚存在较大争议，而从柳属划分出来的心叶柳
属也得到少数柳属分类学者的支持，还有的学者则
将柳属划分为若干个属。因此，柳属的范围（即是
否为一个自然类群） 仍然有较大争议。关于柳属的
外类群，以往的系统都认为是杨属，但杨柳科近年
来根据分子系统学及形态学的研究结果，被并入了
很多大风子科的类群[4~9]。因此，开展柳属植物系统
发育和分子进化研究为分类提供证据，有着重要意
义。其中，垂柳、曲枝垂柳、旱柳和龙爪柳之间传
统分类学关系为垂柳、旱柳同为柳组，曲枝垂柳为
垂柳的变型，两者主要区别为曲枝柳枝卷曲，龙爪
柳为旱柳变型，两者主要区别为龙爪柳枝卷曲。龙
爪柳与曲枝垂柳在外形上极为相似，较难区别。
核 糖 体 DNA（nrDNA） 和 叶 绿 体 DNA
（cpDNA） 是植物系统学研究中常用的分子标记，
nrDNA的转录间隔区（ITS） 进化速率较快，可以
提供较丰富的变异位点和信息位点，并且具有高度
变异性和长度的高度保守性，被子植物大多数科属
其ITS序列的种间差异值为1.2%~10.2%，属间差
异值差异值为9.6%~28.8%。相对其他常用的片断
（如matk， rbcL等） 的高度变异性又使得该序列
较适合于属内及属间的分类研究[10~14]。
本研究选取 ITS片段进行PCR 产物直接测序
并利用MEGA5.05软件构建系统发育树，从分子水
平上对柳属一些植物进行系统分类，以期为该属植
物系统演化、系统分类提供理论根据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料垂柳、龙爪柳采集于昆明城区月牙潭
公园，曲枝垂柳采集于西南林业大学校园。
1.2 总 DNA提取
实验采用垂柳、龙爪柳和曲枝垂柳新鲜幼嫩的
叶片为材料，在液氮环境中研磨成粉末，用
BioTeKe新型快速植物基因组 DNA 提取试剂盒提
取高质量的样品总DNA。
1.3 ITS序列的扩增及测序
使用通用引物，上游引物ITS1：5TCCGTAG-
GTGAACCTGCGG3;下游引物 ITS4:5TCCTCCGCT-
TATTGATATGC3， 2×power Taq PCR MasterMix
为北京百泰克生物技术有限公司产品。PCR 反应
体系为 25μL，内含：双链总 DNA 模板 1.0μL；
上下游引物各1.0μL；2×power Taq PCR Master-
Mix 12.5μL；用双蒸水补足至 25μL。PCR 反应
程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火
50s，72℃延伸60s，共32 个循环；最后72℃终延
伸7min， 产物于4℃ 保存。PCR产物检测：PCR
产物5ul用EB染色，在浓度为1.0%的琼脂糖凝胶
电泳检测，用凝胶成像仪照相。
PCR产物测序：将剩余的PCR产物委托中美
泰和生物技术（北京） 有限公司测序。
1.4 ITS序列分析
采用BLAST方法在GenBank中搜索柳属植物
ITS序列，利用Mega5.05进行序列的完全对比，碱
基对位排列结果中的空位作完全删除处理，采用邻
接距离距阵法 （Neighbor-joining） 构建系统发育
树，系统发育树的每个分支的统计学显著性分析以
自展法（Bootstrap，1000 replicates） 进行可行度测
试，重复 1000 次，进行距离使用 Kimura 2-pa-
rameter模型进行计算。
2 结果与分析
2.1 柳属植物 ITS序列长度和 G+C含量和变异位
点及信息位点
刘明航等：柳属植物ITS序列分析 31
贵 州 林 业 科 技 40卷
采用引物序列ITS1/ITS4，以垂柳、曲枝 、
龙爪柳基因组的DNA模板扩增ITS序列，获得了
ITS1、5.8s、 ITS2 片段和小部分的 18S 和 26S 片
段共 640bp 左右。通过与 GenBank 中记录的柳属
的ITS序列进行对比，GenBank中序列与样品同源
性达 95%以上，其对应的 GenBank 序列登记号、
长度和G+C含量见表1。
表 1 杨柳科植物 GenBank序列登记号、ITS序列长度和 G+C含量
ITS序列全长
编号 种 名
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
垂柳（Salix babylonica）
曲枝垂柳（Salix babylonica f. tortuosa）
龙爪柳（Salix matsudana f. tortuosa）
旱柳（Salix matsudana）
白柳（Salix alba）
五蕊柳（Salix pentandra）
爆竹柳（Salix fragilis）
大叶柳（Salix magnifica）
腺柳（Salix chaenomeloides）
三蕊柳（Salix triandra）
毛枝柳 （Salix dasyclados）
蒿柳（Salix viminalis）
龙江柳（Salix sachalinensis）
黄花柳（Salix caprea）
蔓柳（Salix turczaninowii）
戟柳（Salix hastata）
粉枝柳（Salix rorida）
白皮柳（Salix pierotii）
北极柳亚种（Salix arctica subsp.）
长度/bp G+C/%
612
612
612
612
601
616
615
615
616
617
616
616
616
616
616
616
616
616
616
66.2
66.0
66.2
66.2
64.9
65.7
65.9
64.7
64.9
64.7
64.9
64.9
64.4
64.9
64.9
64.8
64.6
64.8
64.9
GenBank序列登记号
-
-
-
JQ898643.1
EF060381.1
EF060376.1
AJ006427.1
EF060379.1
EF060386.1
EF060385.1
AJ006425.1
AJ006435.1
GU556179.1
FR744741.1
FR693631.1
HE800881.1
FR744735.1
HE800865.1
FR693640.2
柳属平均ITS 长度为614.3bp，G+C平均含量
为65.2%。每一个物种的DNA中G+C含量的数值
是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化
而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA 中
G+C含量的数值差异不会太大。由表1中可知，垂
柳、龙爪柳、旱柳 G+C 含量都为 66.2%，曲枝垂
柳为 66.0%，四者 G+C 含量几乎相等。爆竹柳的
65.9%、及五蕊柳的65.7%与四者相近，其余柳树
G+C含量为64.4%~64.9%范围内。
19个柳属植物材料的ITS为 617个位点，经
比较存在578个保守位点，38个变异位点，19个
简约信息位点，19个单突变位点。变异位点比例
仅为6.1%，而信息位点比例达93.7%，说明ITS序
列变化不大，而且有较多的遗传信息点，适于作遗
传分析。垂柳、曲枝垂柳、龙爪柳和旱柳，仅存在
1个变异位点。
2.2 柳属植物的 ITS聚类分析
实验样本3个与GenBank中同源搜索的16个
近缘种的ITS序列，再用MEGA5.05软件，对序列
进行完全的比对，采用邻接距离矩阵法 （Neigh-
bor-joining） 构建系统发育进化树见图 1，完全删
除序列的Gaps/Missing Data，采用Pairwise distance
calculation法，选用Kimura 2-parameter参数模型，
所得的遗传距离见表2。
由系统发育图显示：19个样本植物构成了一个
大的稳定分支，其支持率为100%，垂柳、龙爪柳、
曲枝垂柳、旱柳以及五蕊柳、爆竹柳、白柳七个样
关系较为亲密，形成一个分支，支持率为97%，且
垂柳、龙爪柳、曲枝垂柳及旱柳显示为差异极小，
为一个种，支持率为99%。三蕊柳与戟柳聚为一小
支，支持率为50%，其他的柳属植物，由于分支的
靠前结点存在38%置信度，14%置信度，40%置信
度，置信度不高，可能无法真实反映系统发育关系，
仍需要更多的资料，来进行进一步探讨。
32
4期
图1 邻接距离矩阵法构建的柳属植物ITS序列系统发育树
表 2 柳属植物 ITS序列间的遗传距离
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
1
0.002
0.000
0.000
0.022
0.012
0.010
0.019
0.021
0.021
0.019
0.022
0.022
0.021
0.021
0.022
0.019
0.021
0.021
0.002
0.002
0.024
0.014
0.012
0.021
0.022
0.022
0.021
0.024
0.024
0.022
0.022
0.024
0.021
0.022
0.022
0.000
0.022
0.012
0.010
0.019
0.021
0.021
0.019
0.022
0.022
0.021
0.021
0.022
0.019
0.021
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0.019
0.021
0.021
0.019
0.022
0.022
0.021
0.021
0.022
0.019
0.021
0.021
0.014
0.012
0.021
0.022
0.022
0.021
0.024
0.024
0.022
0.022
0.024
0.021
0.022
0.026
0.002
0.010
0.012
0.012
0.010
0.014
0.014
0.012
0.012
0.014
0.010
0.012
0.015
0.008
0.010
0.010
0.009
0.012
0.012
0.010
0.010
0.012
0.009
0.010
0.014
0.002
0.005
0.000
0.003
0.003
0.002
0.002
0.003
0.000
0.002
0.005
0.007
0.002
0.005
0.005
0.000
0.003
0.005
0.002
0.003
0.007
2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
11
12
13
14
15
16
17
18
19
0.005
0.008
0.008
0.007
0.007
0.005
0.005
0.007
0.010
0.003
0.003
0.002
0.002
0.003
0.000
0.002
0.005
0.007
0.005
0.005
0.007
0.003
0.005
0.008
0.005
0.005
0.007
0.003
0.005
0.005
0.003
0.005
0.002
0.003
0.007
0.005
0.002
0.000
0.003
0.003
0.005
0.008
0.002
0.005 0.003
注：表2中序号对应柳属植物与表1相同。
刘明航等：柳属植物ITS序列分析 33
贵 州 林 业 科 技 40卷
由上表可知，垂柳、龙爪柳、旱柳间的遗传距
离为0，三者与曲枝垂柳遗传距离为0.002，四个
样与爆竹柳、五蕊柳遗传距离较相近，为0.010与
0.012，与其他柳属植物遗传距离在0.019-0.022之
间。结果表明，垂柳、曲枝垂柳、龙爪柳、旱柳遗
传距离十分小，可认为是一个种，关系为种内变
异，四个样与爆竹柳、五蕊柳有较为亲密的遗传关
系，而与其他种遗传关系相对疏远。
3 讨论
本研究对垂柳、曲枝垂柳、龙爪柳进行了ITS
序列扩征及测序分析，并在 GenBank 中下载了柳
属跟实验材料序列同源的物种ITS序列构建了系统
树，分析了其在系统树中的进化关系。结果证明：
垂柳、曲枝垂柳、龙爪柳、旱柳差异为种内变异水
平，应为一个种。 《中国植物志》 中对柳属分类
中，柳属下存在组一级的分类单位，即根据雄蕊、
雌花、枝、叶、习性、地理分布等总结出来的综合
特征划分[1]。我们得到的系统发育树对柳树的分类
与《中国植物志》中柳属下组的分类单位结构存在
明显的出入。
经典分类学方法，主要以枝、叶与花器官特征
作为分类的依据，对柳属进行分类，研究的方法较
单一，可作为依据的信息量也较少，也难以较系统
全面的评价柳属植物遗传多样性及亲缘关系。刘峥
和张汉尧在《旋花科植物ITS序列分析》一文中，
对花器官有明显变异的紫色重瓣圆叶牵牛进行ITS
测序，结果表明，疑似新种的紫色重瓣圆叶牵牛并
非是一个新种，而是属于圆叶牵牛（Ipomoea pur－
purea） 种下分类水平的变种或是变型[15]。本实验运
用ITS测序方法，对612个遗传位点进行了研究，
能较好地反映植物种间亲缘关系。笔者认为垂柳、
曲枝垂柳、龙爪柳、旱柳是否同属一个种，还需进
一步要采用杂交的方法，通过杂交能产生可育的后
代，来作为进一步的依据。验证柳树属植物杂交后
代是否可育需要的时间较长，这是制约其分类准确
性的一个重要因素。对于柳属植物分类学研究有必
要采用一些新的方法， 选取更多的种来对该属植
物的遗传多样性及亲缘关系作更深入的研究， 为
其分类和系统发育研究提供理论依据。
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34
4期
（上接第 29页） 件恶劣，如在施工后遇到雨水天
气，则极易发生水土流失，因此可选择这些草本植
物作为先锋种，快速形成高盖度的边坡群落，起到
快速固坡的作用。
（4） 本实验只采取了单播的方式来研究乔灌草
植物的生长规律，在实际边坡绿化修复中，大部分
禾草植物在后期的生长能力衰退，长期持续的生存
能力较差，因此在后期的研究和选择中，还应选择
更多乔灌豆科植物如刺槐、双荚决明、多花木兰等
与禾草科植物混播，为土壤提供氮素的来源，以形
成更加稳定的边坡植物群落结构。
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刘明航等：柳属植物ITS序列分析 35