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[基金项目]国家自然科学基金资助项目(编号:30960503);贵州省科学技术基金资助项目[编号:黔科合J字(2008)2143号] [作者简介]任
广聪,男,硕士,电话:15011931497,E-mail:renguangcong@yahoo.com.cn [通讯作者]董立莎,女,硕士生导师,教授,电话:18984079597,E-
mail:dlsha1216@yahoo.cn
贵州产菝葜属及肖菝葜属8个品种中落新妇苷分析及抗炎作用的比较
任广聪1,何席呈2,龚明鹏3,董立莎2 (1.贵阳护理职业学院,贵州 贵阳550081;2.贵阳中医学院,贵州 贵阳550002;3.
广州康和药业有限公司,广东 广州511440)
[摘要] 目的:采用高效液相色谱分析贵州产菝葜属及肖菝葜属8个品种中的活性成分落新妇苷,并通过对8个品种间慢性
抗炎试验的对比研究,以对品种间进行药效与质量的评价。方法:RP-HPLC测定落新妇苷含量,色谱条件:依利特 Hypersil
ODS2 色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm),流动相为乙腈-0.1%冰醋酸(21∶79);流速1 mL·min
-1;柱温为30℃;检测波长291
nm,理论塔板数以落新妇苷计不得低于5 000。结果:结论:落新妇苷在0.003~3.168μg范围内与峰面积呈良好线性关系,加
样回收率(n=9)为100.43%,RSD%=1.5%,8个品种中落新妇苷含量为0.005%~4.493%,含量最低者是小叶菝葜与托柄
菝葜,均为0.005 1%,而菝葜中落新妇苷的含量仅为0.009 0%,土茯苓中落新妇苷含量最高为4.5%,是2010年版中国药典
(一部)中土茯苓药材中落新妇苷最低限量的10倍以上。通过抗炎试验研究,8个品种对小鼠棉球肉芽形成均具有显著抑制
作用,其中土茯苓较其他品种抗炎作用好。本实验可为贵州产菝葜属及肖菝葜属新的药用资源开发利用及土茯苓药材的质
量控制提供一定的参考依据。
[关键词] 菝葜属;肖菝葜属;落新妇苷;高效液相色谱;抗炎试验
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2011)17-1401-03
Comparison of anti-inflammatory effect and analysis of astilbin in 8 varieties from Guizhou n-
ative Smilaxand Heterosmilax
REN Guang-cong1,He Xi-cheng2,GONG Ming-peng3,DONG Li-sha2(1.Guiyang Nursing Vocational Colege,
Guizhou Guiyang 550081,China;2.Guiyang Colege of Traditional Chinese Medicine,Guizhou Guiyang 550002,China;3.GKH
Pharmaceutical Ltd,Guangdong Guangzhou 511440,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To evaluate the quality of astilbin contained in 8 varieties fromSmilaxL.and Heterosmilax K.in
Guizhou province by HPLC.METHODS Astilbin was determined by HPLC,Elite Hypersil ODS2column(5μm,4.6 mm×
250 mm)was used,the mobile phase was methyl cyanides-0.1%glacial acetic acid(21∶79),and delivered at a flow rate of 1.0
mL·min-1;Column temperature was 30℃ Detection wavelength was 291 nm.The theoretical plate number of astilbin was not
be less than 5 000.RESULTS Determination of astilbin was carried out by HPLC with a linear range from0.003μg to 3.168
μg.The recovery rate(n=9)was 100.43%,RSD% was equal to 1.46%.The content of astilbin was from0.005%to
4.493%,Both S.microphylla and S.discotis contained the lowest content which were 0.005 1%,while the astilbin is only
0.009 0%in S.China,and the highest one that was 4.5%in S.glabra was 10 more times than the minimum limit in the Phar-
macopoeia of People's Republic of China 2010.Astibin of 8 varieties could significant inhibit the formation of cotton bal granu-
lation in mice by anti-inflammatory experiments.CONCLUSION This research can provide some references for development of
new medicinal resources and qualitative control of Smilaxand Heterosmilaxplants.
KEY WORDS:astilbin;Smilax;Heterosmilax;HPLC;anti-inflammatory experiment
百合科菝葜属(Smilax L.)及肖菝葜属(Het-
erosmilax K.)中多种药用植物的根及根茎在贵州
省均为民间用药,蕴藏量较大[1]。本类植物中活性
成分之一的落新妇苷具有抗炎及利尿作用[2],在临
床上以土茯苓为主药治疗慢性盆腔炎,疗效较为显
著[3]。贵州产8种品种的研究目前尚未见相关报
道,为了研究本类药用品种间的化学成分与药效学
有否相关性,为开发新的药用资源及土茯苓药材质
量控制提供科学依据。本实验以该类药用植物中活
性成分落新妇苷为指标,对8个品种中落新妇苷含
量进行了分析研究,并通过慢性抗炎试验(小鼠棉球
肉芽肿试验)为主要药效指标来进行相关评价。
·1041·中国医院药学杂志2011年第31卷第17期Chin Hosp Pharm J,2011 Sep,Vol 31,No.17
1 材料
1.1 仪器 美国惠普 Agilent 1100高效液相色谱
仪:四元泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器、
G1315B DAD检测器(美国 Agilent公司);依利特
Hypersil ODS2 色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm),大
连依利特分析仪器有限公司;SK8310LHC型恒温超
声波提取器(500 W,50/60 Hz),上海科导超声仪器有
限公司;分析天平(METTLE R TOLEDO,AB104-N,
十万分之一,百万分之一,梅特勒上海有限公司)。
1.2 试药 落新妇苷对照品(批号30-2007),购于
上海中药标准化研究中心;乙腈、甲醇为色谱纯,水
为纯净水,其他试剂均为分析纯。
1.3 药材 菝葜属及肖菝葜属8种植物全株由作
者于春季在贵州各地采集,并经贵阳中医学院药学
系生药教研室董立莎教授鉴定为小叶菝葜(S.mi-
crophylla)、黑叶菝葜(S.nigrescens)、短梗菝葜(S.
scobinincaulis)、菝葜(S.china)、托柄菝葜(S.dis-
cotis)、光叶菝葜(土茯苓S.glabra)、柔毛菝葜(S.
chingii)及短柱肖菝葜(H.yunnanensis)。除去地
上部分后,根茎或根洗净、切片,阴干备用。
2 含量测定
2.1 供试品溶液制备 参照中国药典2010年
版[4],精密称取8个品种药材粉末(过2号筛)各
0.8 g分别于250 mL平底烧瓶中,加60%甲醇100
mL,称重,加热回流提取1 h,放冷,再称定,用60%
甲醇补足减失的质量,摇匀,用0.45μm微孔滤膜过
滤,取续滤液作为供试品溶液。
2.2 对照品溶液制备 精密称取落新妇苷对照品
10.56 mg于10 mL量瓶中,用60%甲醇溶解并定
容至刻度,得落新妇苷对照品储备液(质量浓度为
1.056 mg·mL-1)。
2.3 色谱条件与系统适应性试验 依利特 Hyper-
sil ODS2 色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm),流动相
乙腈-0.1%冰醋酸(21∶79),流速1 mL·min-1,检测
波长291 nm,柱温25℃,进样量10μL,采集时间
12.5 min,理论塔板数以落新妇苷峰面积计不得低
于5 000。在此条件下,供试品中落新妇苷峰能与其
他组分达到完全基线分离,分离度大于1.5,且峰形
较好,结果见图1。
2.4 线性范围考察 分别精密移取落新妇苷标准
品储备液(1.056 mg·mL-1),配制成一系列浓度的
对照品溶液 (0.338,8.44,21.12,42.24,105.6,
211.2,316.8μg·mL
-1),分别吸取上述对照品溶液
各10μL,注入液相色谱仪,记录色谱,以对照品浓
度C对峰面积A进行线性回归,得线性回归方程:
图1 对照品及样品落新妇苷高效液相色谱图
A.对照品;B.土茯苓;1-落新妇苷
Fig 1 HPLC chromatograms of reference substance and sample of
astilbin
A.reference substance;B.S.glabra;1-astilbin
C=2.542 2×10-5 A-0.842 6,r=0.999 9。结果
表明:落新妇苷进样量在0.003 4~3.168μg范围内
与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液制备项下
的土茯苓样品溶液10μL,在上述色谱条件下重复
进样6次,测定峰面积,落新妇苷RSD为0.78%(n
=6),结果表明精密度良好。
2.6 重复性试验 精密称取同一土茯苓药材粗粉
(过24目筛)各6份,按“2.1”项下方法制备供试品
溶液,在上述色谱条件下进行分析测定。落新妇苷
含量的RSD为0.15%(n=6),故重复性良好。
2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液10μL,分别
在0,1,2,3,4,5,6,7,8 h进样,测得落新妇苷含量
的RSD为0.82%(n=9),表明供试品溶液在8 h内
稳定。
2.8 加样回收率试验 精密称取土茯苓药材粉末
25 mg(落新妇苷含量4.475 6%)9份于250 mL平
底烧瓶中,加60%甲醇100 mL,其中1~3份,4~6
份和7~9份分别加入相当于样品含量的80%
100%和120%的对照品。样品处理方法同前落新
妇苷含量测定方法精密度考察下方法,记录色谱。
结果落新妇苷平均加样回收率(n=9)为100.43%,
RSD为1.5%。
2.9 样品含量测定 分别取不同品种药材粉末,按
“2.1”项下方法制备供试品溶液,每个样品平行制备
2份。在上述色谱条件下,因 HPLC含量测定是在
线检测,必须用对照品溶液与样品溶液随行,这样的
结果样品含量测定才会准确,故分别精密吸取对照
品溶液(0.105 6 mg·mL-1)与供试品溶液各10
μL,注入液相色谱仪,测定峰面积值,代入回归方
程,计算出落新妇苷含量,测定结果见表1。
3 小鼠棉球肉芽肿试验[4]
3.1 试验药物
3.1.1 受试药物 8个品种根茎及根的60%乙醇
提取浸膏粉。实验前分别精密称取8个品种的浸膏
粉2.5 g,加0.2 mL聚山梨酯-80作为助溶剂,酌加
少量纯化水研磨溶解后,加纯化水稀释配制成生药
·2041· 中国医院药学杂志2011年第31卷第17期Chin Hosp Pharm J,2011 Sep,Vol 31,No.17
表1 贵州产8个品种中落新妇苷的含量(%,n=4)
Tab 1 Astilbin content of 8 species in Guizhou province
(%,n=4)
品种来源 产地 落新妇苷
小叶菝葜 (S.microphylla) 贵州平坝 0.005 1
黑叶菝葜 (S.nigrescens) 贵州贵定 0.008 3
短梗菝葜(S.scobinincaulis) 贵州贵阳 0.014
菝葜(金刚藤S.china) 贵州安龙 0.009 0
托柄菝葜 (S.discotis) 贵州大方 0.005 1
光叶菝葜(土茯苓S.glabra) 贵州清镇 4.493 1
柔毛菝葜(S.chingii) 贵阳水田 0.005 4
短柱肖菝葜(H.yunnanensis) 贵州兴义 0.007 3
注:上述品种已测定水分,均以干燥品计算
为0.25 g·mL-1的混悬液。
3.1.2 阳性对照药物 阿司匹林肠溶片,规格:每
片50 mg,江苏平光制药有限责任公司,批号
081009。实验前将阿司匹林肠溶片捣碎、酌加少量
纯化水研磨溶解后,加适量纯化水稀释制备成为25
mg·mL-1的混悬液供用。
3.2 试验动物 昆明种小鼠,一级,6~8周龄,体
质量(20±2)g,♀♂各半。由贵阳医学院实验动物
中心提供,动物质量合格证:SCXK(黔)2008-0001。
3.3 试验方法 取昆明种小鼠140只,按随机分组
的原则,将其平均分为10组,分别作为空白对照(生
理盐水)组、阿司匹林组、菝葜组、土茯苓组、柔毛菝
葜组、托柄菝葜组、短梗菝葜组、小叶菝葜组、黑叶菝
葜组及短柱肖菝葜组,每组14只。在戊巴比妥纳麻
醉(30 mg·kg-1)无菌条件下(在每只鼠的左右蹊部
用碘酒消毒,75%酒精棉球脱碘后),于小鼠胸部切
开1 cm的小口,植入(10±1)mg的灭菌(高压灭
菌)棉球2个分别放于左右腋下(皮下),缝合。术后
当日开始灌胃给药0.2 mL/10 g,qd,连续13 d。于
第14天处死小鼠后取出棉球,剔除脂肪组织,在80
℃烘箱中烘6 h,称重,减去棉球原质量,即为肉芽
肿质量。抑制率(%)=[(空白对照组肉芽质量均值
-给药组肉芽质量均值)/空白对照组肉芽质量均
值]×100%。
3.4 统计学处理 数据采用SPSS15.0统计分析
软件分析处理,数据采用珚x±s表示,两组之间的比
较用 Dunnett t检验。显著性检验的标准为P<
0.05。
3.5 试验结果 见表2。
从表2可见,菝葜属及肖菝葜属8个品种对小
鼠棉球肉芽形成均具有显著抑制作用,并且在相同
有效剂量下,土茯苓较其他品种抗炎效果好。
4 讨论
按2010年版中国药典(一部)中土茯苓项下[5]
表2 对小鼠棉球肉芽肿形成的影响(珚x±s)
Tab 2 Effect of Astilbin on the form ation of cotton bal
granuloma in mice(珚x±s)
组别
剂量g(生药)/
kg
动物数/
只
肉芽质量/
mg
抑制率/
%
生理盐水组 - 14 32.7±6.2 -
阿司匹林组 0.5 14 23.6±4.1a 27.83
柔毛菝葜组 5 14 25.9±4.2a 20.73
黑叶菝葜组 5 14 25.7±6.7a 21.38
菝葜组 5 14 25.6±4.4a 21.62
托柄菝葜组 5 14 27.0±5.2a 17.46
短梗菝葜组 5 14 26.2±4.3a 19.79
土茯苓组 5 14 24.7±3.8a 24.46
小叶菝葜组 5 14 26.3±2.6a 19.63
短柱肖菝葜组 5 14 25.4±5.9a 22.35
注:与生理盐水组比较,aP<0.05
含量测定的色谱条件及供试品制备方法对8个品种
进行了含量测定,发现土茯苓中落新妇苷的峰未能
被完全分开,故对流动相进行了选择,分别考察了甲
醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶
液3个溶剂系统及不同的比例。结果表明,以乙腈-
0.1%冰醋酸溶液(21∶79)为流动相,所得各样品色
谱峰峰形较好,分离效果最佳。
在对不同品牌色谱柱的选择中,分别考察了依
利特 Hypersil ODS2 色谱柱、迪马柱 Diamonsil色
谱柱及 Agilent色谱柱。结果,依利特 Hypersil
ODS2 色谱柱对落新妇苷的分离度较好。
8个品种均含有落新妇苷,其含量为0.005 1%
~4.493%,含量最低者是小叶菝葜与托柄菝葜,均
为0.005 1%,菝葜中落新妇苷的含量仅为0.009%,
而土茯苓中落新妇苷含量最高为4.493%,故土茯苓
与其他不同品种间落新妇苷的含量有较大差异,此
是2010年版中国药典(一部)中土茯苓药材中落新
妇苷最低限量的10倍以上,为此我们做了土茯苓样
品专属性的峰纯度检查,此为一纯峰。下一步我们
拟将贵州不同产地、不同采收期的土茯苓与全国各
地产者再进行落新妇苷的含量分析,可为贵州产土
茯苓的成分与疗效研究奠定理论基础,并为开发贵
州原产药材的内在质量提供较好的参考依据。
参考文献:
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[2] 张白嘉,刘亚欧.土茯苓及落新妇苷抗炎镇痛利尿作用研究
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[5] 中国药典.一部[S].2010:17-18.
[收稿日期]2010-10-15
·3041·中国医院药学杂志2011年第31卷第17期Chin Hosp Pharm J,2011 Sep,Vol 31,No.17