全 文 ：中国农学通报 2011,27(6):50-53
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
ISSR（Inter-simple sequence repeat）技术是分子标
记的一种，是根据SSR (Simple sequence repeat)的特点
由Ziekiewicz于1994年创建的一种简单重复区间扩增
多态性的分子标记技术[1]。目前，ISSR已广泛用于绘制
DNA指纹图谱、遗传多样性分析、品种鉴定等领域[2]，但
是在果树上应用较少，在梨属植物种质资源研究中的
应用国内报道较少。研究对 ISSR反应体系进行了系
统地摸索和优化，旨在为 ISSR技术在梨属植物种质资
源的利用方面提供适宜方法。
基金项目：河北省自然科学基金（303240）。
第一作者简介：张玉星，男，1961年出生，河北沧州人，教授，博士，主要从事果树结实生理与分子生物学研究。通信地址：071001河北农业大学学科
学位办公室，E-mail：jonsonzhyx@yahoo.com.cn。
收稿日期：2010-05-14，修回日期：2010-08-02。
梨属植物 ISSR技术体系的建立与优化
张玉星 1，马艳芝 1,2，赵国芳 1,3
(1河北农业大学园艺学院河北省梨工程技术研究中心，河北保定 071001；
2唐山师范学院生命科学系，河北唐山 063000；
3北京金泰恒业有限责任公司富地分公司，北京 100031)
摘 要：以雪花梨为材料，对 ISSR反应体系中的模板用量、引物浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量
等一些重要参数进行探索和优化，初步建立了稳定的具有广泛适用性的梨属植物 ISSR技术的反应体系
及扩增程序，即 20 μL体系中含 1×buffer (内含 1.5 mmol/L MgCl2)、模板DNA 40~60 ng、引物浓度为
0.2 μmol/L、dNTP 200 μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U。扩增程序为：94℃ 5 min、退火60 s、72℃延伸120 s，
然后连续39个循环为94℃ 60 s、退火温度(52℃左右)60 s、72℃延伸120 s，完成最后1个循环后，在72℃
继续延伸10 min，然后在4℃保温，最后通过1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物。
关键词：梨；ISSR；反应体系；扩增程序
中图分类号：S661.2 文献标志码：A 论文编号：2010-1483
Establishment and Optimization of ISSR Technique in Pyrus L.
Zhang Yuxing1, Ma Yanzhi1,2, Zhao Guofang1,3
（1Bio-control Center of Pear of Hebei Province, College of Horticulture, Agricultural University of Hebei, Baoding Hebei 071001;
2Department of Life Science, Tang Shan Normal College, Tangshan Hebei 063000;
3Beijing Golden Tide Co. Ltd Fudi Branch, Beijing 100031)
Abstract: In this study, the genome DNA was extracted from Xuehua pear and was used for inter-simple
sequence repeat (ISSR) analysis. By evaluating amplification concentrations and conditions, the optimum
reaction system of ISSR-PCR for Pyrus L. were established in a total volume of 20 μL, containing template
DNA 40 ng, 1.0 U Taq-DNA polymerase, 0.2 μmol/L ISSR primer, 200 μmol/L, dNTP, Buffer (Tris-HCl
(pH8.3) 10 mmol/L、KCl 50 mmol/L、MgCl2 1.5 mmol/L). Amplified procedure was programmed for 5 min at
94℃ , at annealing temperature for 60s, extension 120 s at 72℃ ; 39 cycles: 60 s at 94℃ , at annealing
temperature (52℃) for 60 s, extension 120 s at 72℃ and then a final extension 72℃ for 10 min after the last
cycle and then keep at 4℃. Amplified products were detected by electrophoresis in 1.4 agarose gel (containing
1 μg/mL EB).
Key words: Pyrus L.; ISSR; reaction system; amplified procedure
张玉星等：梨属植物 ISSR技术体系的建立与优化
1 材料与方法
1.1 材料
材料采自雪花梨叶片（河北农业大学标本园）。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取和检测 2002年 5月上旬采
取雪花梨健壮植株新梢上的叶片用于提取DNA，DNA
提取采用CTAB法 [3-7]。0.7%琼脂糖凝胶电泳，EB染
色，测定光密度值，确定DNA质量，-20℃保存备用。
供试试剂：ISSR引物购自加拿大 University of
British Combulia，Taq DNA polymerase、dNTP及λDNA
购自大连宝生物工程有限公司，Marker、AgroseI琼脂
糖、无菌超纯水等购自上海生工生物工程技术服务有
限公司，其它试剂均购自保定市化学试剂经营部。
1.2.2 ISSR扩增及产物检测 ISSR扩增在Whatman
Biometra型PCR仪上进行，各个反应成分的用量如表
1(20 μL的反应体系)，扩增程序见表2。
ISSR-PCR扩增产物用1.4%的琼脂糖凝胶电泳分
离。根据扩增片段的大小，适时停止电泳，并于紫外透
射仪上观察、记录并照相。
2 结果与分析
2.1 梨基因组DNA的提取和检测
试验用CTAB法提取梨基因组DNA，结果表明提
取的总DNA经 0.7%琼脂糖凝胶电泳检测呈一亮带，
无弥散和降解现象(部分结果见图 1)。此试验中各样
品的OD260/OD280值均在 1.6~2.0，表明蛋白质等杂质较
少，DNA纯度较高。
2.2 ISSR反应体优化
ISSR反应体系和其他基于PCR的扩增标记技术
一样语言不通，均含有 buffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA
聚合酶、模板DNA及无菌超纯水6种成份。此研究参
照 ISSR引物在棉花、水稻、柑橘等作物上的反应体系，
设立了包括模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、
循环参数及退火温度共6个变量，进行比较试验，建立
了适合于梨属植物的 ISSR-PCR最佳反应体系[8-9]。
2.2.1 适宜模板DNA浓度的确定 试验在 20 μL反应
体系中，设定DNA用量自左至右依次为0、20、40、60、
80、100 ng共 6个浓度梯度处理，其他各成份分别为：
TaqDNA聚合酶 1 U，引物 0.2 μmol/L，1 × buffer (含
MgCl2 1.5 mmol/L)，dNTP 200 μmol/L，扩增后检测结
果表明，在其他条件一致的情况下，模板DNA在设定
浓度范围内，对其扩增产物影响很小，40~60 ng带型基
本保持稳定且带型清晰(如图 2)。故此研究确定加入
模板DNA浓度以40~60 ng为宜。
2.2.2 引物浓度的优化 在其他因素不变的条件
（TaqDNA聚合酶 1 U，1×buffer，含MgCl2 1.5 mmol/L，
模板DNA 40 ng，dNTP 200 μmol/L）下，在 20 μL反应
体系中，设定 0.1~0.5 μmol/L 5个引物浓度进行测试。
结果表明从 0.2~0.5 μmol/L，扩增谱带均保持稳定，而
且条带清晰可辨，但0.2 μmol/L浓度时主带最清晰，条
带最多，因此选择0.2 μmol/L浓度为最适浓度。
2.2.3 dNTP适宜浓度的确定 dNTP浓度分别设为 0、
50、100、150、200、250 μmol/L共6个浓度梯度，其它成
份分别为：引物 0.2 μmol/L，1 × buffer（含 MgCl2
1.5 mmol/L），模板DNA 40 ng，TaqDNA聚合酶 1 U。
其扩增产物如图 4表明：200 μM时，扩增产物清晰而
且条带整齐，没有带缺失现象，但浓度过高，会与
表1 ISSR- PCR反应成分用量
注：* Tris-HCl(pH8.3)10 mmol/L，KCl 50mmol/L。
程序
Step1
Step2
Step3
Step4
Step5
Step6
Step7
Step8
反应温度/℃
94
94
-
72
39 cycles
72
4
-
反应时间/s
300
60
60
120
Go to 2
600
KEEP
End
表2 ISSR-PCR反应程序
图1 梨基因组琼脂糖凝胶电泳检测结果
原液
ddH2O
Buffer10×(Mg2+15 mmol/L)
dNTP
Taq DNA polymerase
Primer
Template(DNA)
母液
2.5 mmo/L
5 U/μL
15 μmo/L
20 ng/μL
终浓度
1×
200 μmo/L
1 U
0.2 μmo/L
40 ng
用量/μL
13.9
2.0
1.6
0.2
0.3
2.0
·· 51
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
TaqDNA聚合酶竞争Mg2+，影响TaqDNA聚合酶活性，
导致带型缺失现象。研究确定200 μmol/L为20 μL反
应体系最佳浓度。
2.2.4 TaqDNA聚合酶适宜浓度的确定 试验在 20 μL
反应体系设置 6个TaqDNA聚合酶用量，分别在每管
中加入 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U，其他成份分别为：引
物物浓度0.2 μmol/L，1×buffer (含MgCl2 1.5 mmol/L)，
模板 DNA 40 ng，dNTP 200 μmol/L。扩增产物见图
5。酶用量为0 U时无扩增，0.5 U时有扩增，但带有缺
失现象；1.0、1.5 U时扩增带型清晰、整齐，是比较理想
的结果；2.0、2.5 U时，有条带缺失或稍弥散。在节约
酶的用量条件下，研究认为在20 μL ISSR-PCR反应体
系中采用1.0 U Taq-DNA聚合酶比较适宜。
2.2.5 循环参数对 ISSR-PCR的影响 研究表明，在扩
增反应体系成份不变的情况下，PCR反应的循环数对
ISSR结果也有一定影响。当循环数减少至 35个循环
时，其扩增产物明显减少，当循环数增加至 50个循环
时，其扩增产物也有一定程度的减少且略有弥散。研
（从左到右）模板DNA用量依次为：1：CK（不加模板）；
2：20 ng；3：40 ng；4：60 ng；5：80ng；6：100 ng;7：
Marker；8~14同1~7
图2 模板DNA浓度对 ISSR-PCR的影响
（从左至右）泳道1，2：CK；3，4：0.1；5，6：0.2；7，8：
0.3；9，10：0.4；11，12：0.5 μM；Marker
图3 引物浓度对 ISSR-PCR的影响
（从左至右）泳道1，2：CK（不加dNTP）；3，4：50；5，6：
100；7，8：150；9，10：200；11，12：250 μmol/L；Marker
图4 dNTP浓度对 ISSR-PCR的影响
（从左到右）泳道1，2：CK(不加TaqDNA聚合酶)；3，4：0.5 U；
5，6：1 U；7，8：1.5 U；9，10:2.0 U；11,12:2.5 U；Marker
图5 TaqDNA聚合酶浓度对 ISSR-PCR的影响
（从左到右）泳道1，2，3：N=35；4，5，6：N=40；
7，8，9：N=45；10，11，12：N=50
图6 PCR循环数对 ISSR-PCR的影响
（从左到右）泳道1，2：T=48℃；3，4：T=50℃；5，6：
T=52℃；7，8：T=55℃；9，10：T=58℃；Marker
图7 退火温度对 ISSR-PCR的影响
·· 52
张玉星等：梨属植物 ISSR技术体系的建立与优化
究表明以 40~45个循环扩增效果最好，故此研究在保
证扩增效果的的情况下，选择 ISSR-PCR循环数为 40
个循环。
2.2.6 适宜退火温度的确定 在引物浓度、模板DNA用
量、dNTP以及TaqDNA聚合酶等用量固定的情况下，
不同退火温度对 ISSR-PCR扩增结果影响较大。大多
数引物在退火温度T=52℃时，均有清晰、稳定扩增片
段，但少数引物表现出退火温度偏高或偏低现象。如
图 7为引物UBC845在不同退火温度时扩增结果，其
结果表明：该引物最适退火温度为52℃。所以，不同引
物应适当调整其退火温度，才能达到最佳效果。
3 讨论
此研究利用 PCR扩增仪，通过对影响 ISSR反应
体系的主要因素，即模板DNA浓度、引物浓度、dNTP、
TaqDNA聚合酶、循环数及退火温度 6个变量进行优
化，建立了梨属植物 ISSR分子标记最佳反应体系。在
相同反应条件下，同一模板DNA可以产生完全一致的
PCR产物，这从此试验图 3、4、5中均可看出。在一定
程度上反映了 ISSR-PCR的稳定性，而且该体系在试
验过程中，很少出现由于随机因素造成反应不稳定的
现象。该现象可能是由于 ISSR引物长度一般都在
16~18 bp，反应退火温度较高，引物与模板结合复合物
比较稳定，从而能够得到比较稳定的扩增结果。
在 ISSR-PCR过程中，有时也出现条带缺失，或者
弥散，甚至出现空扩增等不稳定现象，但这并不是
ISSR技术本身不稳定造成的，当扩增所用 buffer
(Mg2+)、dNTP、引物等反复冻融或使用时没有混匀，会
出现空扩增或部分条带缺失现象。这在其它基于
PCR扩增反应的技术中也同样存在此现象。另外，此
研究还发现，虽然buffer(Mg2+)、引物浓度、退火温度及
TaqDNA聚合酶等用量都对扩增结果有影响，但尤其
以退火温度影响更明显，这与 J.C.Huang的研究结果一
致，当引物在非最佳退火温度时，往往会出现条带缺失
或弥散[10]。此研究认为将 buffer(Mg2+)、dNTP、引物等
分装保存的情况下，在保证 buffer(Mg2+)、dNTP、引物
等充分混匀，调整好退火温度是保证 ISSR稳定性的关
键。
4 结论
梨属植物适宜的 ISSR反应体系为：20 μL体系中
含 1 × buffer(内含MgCl2 1.5 mmol/L)、模板 DNA 40~
60 ng、引物浓度为 0.2 μmol/L、dNTP 200 μmol/L、Taq
DNA聚合酶 1 U。其扩增程序为：94℃ 5 min、退火温
度(52℃左右)60 s、72℃延伸 120 s，然后连续 39个循环
为94℃ 60 s、退火温度(52℃左右)60 s、72℃延伸120 s，
完成最后一个循环后，在72℃继续延伸10 min，然后在
4℃保温。变换引物和材料时可在此基础上进行微调。
参考文献
[1] Zlekienlcz E, Kafalskl A, Labuda D. Genome fingerprinting by
Simple Sequence repeats (SSR)-anchored polymerase chaln
reaction amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.
[2] Wang Z, Weber J L, ZHONG G, et al. Survey of plant short tandem
repeats [J].Theor Appl Genet,1994,88:1-6.
[3] DOLYE J J, DOYLE J L. Isolation of plant DNA from fresh tissue
[M].Focus, 1990, 12:13-15.
[4] 王关林,方宏均.植物基因工程原理与技术[M].北京:科学出版社,
1998:370-372.
[5] 张潞生,李传友,贾建航,等.猕猴桃雌雄性别的AFLP鉴别中DNA
模板的制备[J].果树科学,1999,16(3):171-175.
[6] 彭建营,束怀瑞,彭士琪.一种适合枣和酸枣基因组DNA的提取方
法[J].河北农业大学学报,2000,23(4):46-48.
[7] 胡春根,郝玉,邓秀新,等.RAPD分析用的梨DNA提取方法[J].遗
传,1998,20(4):31-33.
[8] 姜占发.棉花黄萎病菌基因组 ISSR分子指纹分析[D].河北保定:河
北农业大学,2002.
[9] 江树业,陈启锋,方宣钧.水稻农垦 58与农垦 58S的RAPD和 ISSR
分析[J].农业生物技术学报,2000,1(1):63-66.
[10] J. C. Huang, M. Sun. Genetic diversity and relationships of
Sweetpotato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas as
revealed by intersimple sequence repeat (ISSR) and restriction
analysis of chloroplast DNA[J]. Theor Appl. Genet, 2000,100:
1050-1060.
·· 53