全 文 ：收稿日期:2014-12-19
基金项目:中医药行业专项(201407003)
作者简介:崔占虎(1988-)，男，硕士，研究方向:中药分子鉴定;Tel:13333779157，E-mail:cuizhanhu@ 163. com。
* 通讯作者:袁媛，E-mail:yyuan0732@ gmail. com。
基于快速 PCＲ方法的人参属药用植物鉴别研究
崔占虎1，袁 媛2* ，张景景3，王 旭3，丁生晨3，黄显章3，蒋 超2
(1. 南阳市第一人民医院，河南 南阳 473010;2. 道地药材国家重点实验室培育基地 /中国中医科学院，北
京 100700;3. 南阳理工学院，河南 南阳 473004)
摘要 目的:建立一种准确、快速、高效鉴别人参属药用植物的分子鉴别方法。方法:采集不同产地的人参、西
洋参及同属近缘种植物，所有样品进行总 DNA的提取并使用 matK片段进行扩增、测序，进行同源比对后根据其变
异位点设计西洋参特异性鉴别引物，人参以文献报道的特异鉴别引物为基础，分别采用两步法进行 PCＲ扩增，从而
对人参、西洋参及同属近缘种进行鉴别。结果:通过对影响 PCＲ反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时
间、循环次数等因素进行优化，并对不同型号 PCＲ仪进行考察，分别获得人参、西洋参快速 PCＲ反应程序。在 PCＲ
产物中加入 SYBＲ Green Ⅰ染料，正品显示出明亮绿色荧光，而近缘种不显示荧光。结论:快速 PCＲ 方法可以简单
快速鉴别人参、西洋参，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
关键词 快速 PCＲ;人参属;分子鉴定;荧光检测
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)08-1634-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 08. 017
Application of Ｒapid PCＲ Technology on Authentication of Species in Panax Genus
CUI Zhan-hu1，YUAN Yuan2，ZHANG Jing-jing3，WANG Xu3，DING Sheng-chen3，HUANG Xian-zhang3，JIANG Chao2
(1. The First Peoples Hospital of Nnayang City，Nanyang 473010，China;2. State Key Laboratory of Dao-di Herbs Breeding Base，Na-
tional Ｒesource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;3. Nanyang
Institute of Technology，Nanyang 473004，China)
Abstract Objective:To establish an accurate，rapid and efficient method for authentication of Panax species by using PCＲ ampli-
fication of specific alleles. Methods:The samples of Panax species were collected for extracting the total DNA. matK sequence from the
Panax species was amplified by PCＲ and sequenced directionally，and then aligned by using Clustal W. Specific primers were designed
and amplified by two-steps PCＲ amplification method. Ｒesults:By optimizing the denatured and annealing temperature and time，cycle
numbers，the rapid PCＲ methods for authentication of Panax species were established respectively. When SYBＲ Green Ⅰ was added in
the PCＲ product，strong green fluorescence was visualized under 365 nm UV lamp whereas adulterants were not. Conclusion:The rapid
PCＲ method can identify the Panax species rapidly. This study provides the technical support for authentication of Chinese medicinal
materials.
Key words Ｒapid PCＲ;Panax species;Molecular authentication;Fluorescence
五加科人参属植物人参 Panax ginseng C． A．
Mey．、西洋参 Panax quinquefoliun L．、三七 Panax
notoginseng (Burk．)F． H． Chen 等具有悠久的药用
历史和良好的医疗保健作用。近年来，对于人参属
药材的鉴定方法主要包括形态鉴定、理化鉴定、细胞
鉴定、DNA分子鉴定等，传统的鉴定手段由于易受
环境条件的影响或植物本身的限制，人为干扰因素
较多，无法直接体现种质的遗传特征，有时难以得到
准确的结果〔1〕。
DNA 分子标记技术是近二十年来兴起并不断
发展和完善的新检测技术。能够从分子水平上客观
地反映待测材料基因片段之间的差异，鉴别结果不
受环境因素、样品形态和材料来源的影响，一般通过
杂交或电泳等方式就能直观地体现出来，结果更为
准确可靠。DNA 分子标记在人参属植物鉴定中应
用较早且较多。如 Shaw 等〔2〕采用 ＲAPD 法明显地
区分开人参属的 3 种药材及 4 种伪品。此外，AP-
PCＲ法、直接测序法、PCＲ-SSCP 法、多重 PCＲ 法等
技术也被应用在人参属药材的鉴定中〔3-5〕。但这些
方法测试时间较长，且均需要电泳检测才可完成，较
为繁琐，不利于现场快速鉴别的推广〔6〕。PCＲ 作为
分子生物学中应用最广泛的技术之一，随着研究和
应用领域的不断增长，存在着巨大的改进空间。自
Mullis等〔7〕发明 PCＲ技术以来，一些学者不断调整
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PCＲ条件对 PCＲ技术进行改良，并提出了快速 PCＲ
概念〔8，9〕。快速、准确、高通量鉴别是现代中药分子
鉴别的核心需要，目前快速 PCＲ方法已成功用于金
银花等中药材的真伪鉴别〔10〕，本研究基于位点特异
性 PCＲ鉴别技术建立了人参和西洋参快速 PCＲ 鉴
别方法，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行
检测，可大大提高鉴别反应效率，为实现药材分子鉴
别的现场运用提供技术支撑。
1 材料与仪器
1. 1 药材 12 份人参样品、14 份西洋参样品、2 份
三七样品、2 份竹节参样品、2 份珠子参样品及 2 份
羽叶三七样品，分别采自吉林、河北、云南、湖北等
地。经中国中医科学院中药资源中心金艳助理研究
员鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源
中心，见表 1。
表 1 人参属植物药材来源信息表
编号 名称 物种 缩写 采集地 数量
1 人参 Panax ginseng C. A. Mey. Pg 吉林集安 6
2 人参 Panax ginseng C. A. Mey. Pg 吉林白山 6
3 西洋参 Panax quinquefoliun L. Pq 河北石家庄 5
4 西洋参 Panax quinquefoliun L. Pq 吉林长春 4
5 西洋参 Panax quinquefoliun L. Pq 北京怀柔 5
6 三七 Panax notoginseng (Burk. )F. H. Chen Pn 云南文山 2
7 竹节参 Panax japonicus C. A. Mey. Pj 湖北宣恩 2
8 珠子参 Panax japonicus C. A. Mey. var. major (Burk. )C. Y. Wu et K. M. Feng Pjm 湖北恩施 2
9 羽叶三七 Panax japonicus C. A. Mey. var. bipinnatifidus (Seem.)C. Y. Wu et K. M. Feng Pjb 云南昭通 2
1. 2 仪器 GeneAmp 9700 型 PCＲ扩增仪(Applied
Biosystem公司);TC-512 梯度 PCＲ 仪(TECHNE 公
司);VeritiTM 96 孔梯度 PCＲ扩增仪(Applied Biosys-
tems公司);5810 Ｒ 型高速冷冻离心机(Eppendorf
公司);VOＲTEX-2 GENIE 漩涡震荡仪(Scientific In-
dustries 公司);DYY-12 型电脑三恒多用电泳仪(北
京六一仪器厂);HE99X-15-1. 5 型电泳槽(Hoefer 公
司);SYNGENE凝胶成像系统(GENE 公司);ZF-7A
型手持式紫外灯(上海谷村电子光学仪器厂)。
1. 3 试剂 琼脂糖购自 Promega公司;溴化乙啶购
自 Fluka公司;r Taq DNA 聚合酶、SpeedStar HS Taq
DNA 聚合酶、Ex Taq DNA 聚合酶、DL 2000 DNA
Marker购自 TaKaＲa 公司;100 × SYBＲ Green Ⅰ购
自 Invitrogen公司;其他试剂均为国产分析纯。
2 方法
2. 1 基因组总 DNA的提取及 PCＲ扩增、测序 取
适量的样品(约 0. 03 g)，研磨成细粉后，采用改良
的 CTAB法提取获得总 DNA，于 － 20 ℃保存备用。
选择通用引物 matK 对人参、西洋参和同属近缘种
样品进行扩增，反应程序见表 2。反应体系总体积
为 20 μL，包括 10 × buffer 缓冲液 2 μL，dNTP 1. 6
μL，引物各 0. 5 μL，Ex Taq 0. 2 μL，DNA 0. 5 μL，灭
菌蒸馏水 14. 7 μL。PCＲ 反应条件见表 2。反应结
束后在 PCＲ体系中加入 5 μL 6 × Loading buffer，混
匀后于 EB染色的 1. 5%浓度琼脂糖凝胶电泳检测，
SYNGENE 凝胶成像系统观察、成像。选择阳性
PCＲ产物样品进行双向测序。
表 2 引物及反应条件
片段 引物名称 引物序列(5→3) PCＲ反应条件
matK 3F CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG
1Ｒ ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC
95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1
min 30 s，30 个循环;72 ℃ 7 min
ＲS ＲS-F1 ATAACAATACCGGGCTGATTC
ＲS-Ｒ1 GCCAGTTAAGGACAGGAG
94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，30 个循
环
XYS XYS-F1 GGAAAATGCGGGTTATGACAGA
XYS-Ｒ1 TTATGAGATTTGACTATCCCTTTGCTT
94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，30 个循
环
2. 2 基于叶绿体序列的西洋参鉴别引物设计 将
测序所得序列去除引物序列，使用 BioEdit分析软件
进行分析、校对处理，找出具有稳定差异的变异位
点，进而筛选出西洋参的特有变异位点，根据其变异
位点利用 Primer premier 5 软件设计 1 对位点特异
PCＲ引物，设计的特异引物 XYS-F1 /Ｒ1 扩增后片段
大小约为 250 bp。人参特异性鉴别引物基于已建立
的人参 PCＲ鉴定方法〔5〕，引物序列见表 2。
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2. 3 PCＲ 扩增条件的确定 取样品 DNA 用于确
定快速 PCＲ 反应条件。20 μL PCＲ 反应体系，2. 0
μL 10 × buffer缓冲液，1. 6 μL dNTP(2. 5 mmol /L)，
0. 5 μL 上游及下游引物(5 mmol /L) ，0. 5 μL 鉴别
引物 F2(5 mmol /L)，0. 2 μL SpeedStar HS Taq DNA
聚合酶，0. 5 μL 模板 DNA，14. 7 μL 无菌双蒸水。
PCＲ反应在 GeneAmp 9700 型 PCＲ 扩增仪上进行，
初始反应程序见表 2。反应结束后取 PCＲ反应产物
5 μL，加入 2 μL 6 × Loading buffer 混匀后于 EB 染
色的 1%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE 凝胶成像
系统观察、成像。
2. 4 条件优化 分别利用人参和西洋参特异性鉴
别引物对 ＲS-F1 /Ｒ1 和 XYS-F1 /Ｒ1 进行 PCＲ反应，
并考察:①退火温度:55、57、59、61、63、65、67 ℃;②
PCＲ循环数:35、33、31、29、27 个循环;③变性温度:
94、92、90、88 ℃;④变性和退火时间:25、20、15、10、
5 s;⑤不同 PCＲ 仪:9700 型 PCＲ 仪(ABI 公司)，
VeritiTM 96 孔梯度 PCＲ 扩增仪(Applied Biosystems
公司)，TC-512 型 PCＲ仪(TECHNE公司)。
2. 5 PCＲ 产物检测 在 PCＲ 扩增产物中加入 2
μL 100 × SYBＲ Green Ⅰ于 365 nm紫外波长下检测
荧光，出现绿色荧光则表明存在阳性扩增产物。
3 结果与分析
3. 1 鉴别引物设计及验证 选择通用引物 matK
对人参、西洋参和同属近缘种样品进行 PCＲ 扩增，
然后通过 Clastul W软件进行序列比对，根据其变异
区设计 1 对西洋参特异引物。利用位点特异性 PCＲ
方法对西洋参特异引物及已建立的人参鉴定方法中
的人参特异引物进行验证，PCＲ 结果发现，两对引
物使用 SpeedStar HS Taq DNA 聚合酶扩增后，均能
够使正品及同属近缘种同时扩增出条带，因此，考虑
更换 PCＲ反应中的 DNA聚合酶，改用 r Taq DNA聚
合酶和 Ex Taq DNA 聚合酶分别进行扩增，扩增循
环数改为 35 个循环，扩增结果表明，使用 r Taq DNA
聚合酶后，通过利用人参位点特异 PCＲ 引物对人
参、西洋参和同属近缘种进行扩增，人参可以扩增出
一条带，而同属近缘种则扩增不出条带。使用西洋
参位点特异 PCＲ 引物，西洋参可以扩增出一条带，
而同属近缘种则扩增不出条带。使用 Ex Taq DNA
聚合酶后，通过利用人参位点特异 PCＲ 引物对人
参、西洋参和同属近缘种进行扩增，人参可以扩增出
一条带，而同属近缘种则扩增不出条带。使用西洋
参位点特异 PCＲ 引物，西洋参可以扩增出一条带，
而同属近缘种则同样可以扩增出条带。最终确定，
使用扩增结果比较稳定的 r Taq DNA聚合酶进行快
速 PCＲ扩增，2 对特异引物分别可以用作人参、西洋
参和同属近缘种之间的鉴别引物。
3. 2 快速 PCＲ 反应条件的优化 由于 Yap 等〔8〕
研究表明，低温预变性(92 ℃ 1 min)即可实现全基
因组解链并能增加 PCＲ产物得率，且本课题组前期
证实 94 ℃预变性 1 min 即可实现 PCＲ 产物的有效
扩增，因此本文把 PCＲ 初始程序设计为 94 ℃预变
性 1 min，从 94 ℃变性开始，两步法，30 个循环，并
开展 PCＲ反应条件的优化。在此基础上进一步依
次对 PCＲ反应过程中退火温度、PCＲ 循环数、变性
温度、变性和退火时间 5 个因素进行优化，并分析了
不同的 PCＲ仪对改良后 PCＲ反应稳定性的影响。
凝胶电泳结果表明，对于人参特异引物，退火温
度分别为 55、57、59、61、63、65、67 ℃时，人参均能扩
出条带，但由于 65 ℃时人参电泳条带仍较亮，而 67
℃时条带变弱，因此本文选择了 65 ℃为最适退火温
度;退火最适时间为 15 s。大于 29 个循环时，人参
均出现明显条带，但 29 个循环时条带较弱，因此选
择 31 个循环为最适循环数。当变性温度高于 88 ℃
时，人参均能扩增出明显条带而同属近缘种均不能
扩增出条带，因此选择 88 ℃为最适变性温度。变性
时间在 10 s时正品有条带，5 s 时条带亮度明显减
弱，因此选择 10 s为最适变性时间。对于西洋参特
异引物，退火温度分别为 55、57、59、61、63、65、67 ℃
时，西洋参均能扩出条带，但由于 59 ℃时电泳条带
最亮，因此本文选择了 59 ℃为最适退火温度;退火
最适时间为 20 s。大于 29 个循环时，正品均出现明
显条带，但 27 个循环时条带较弱，因此选择 29 个循
环为最适循环数。当变性温度高于 88 ℃时，西洋参
均能扩增出明显条带而同属近缘种均不能扩增出条
带，88 ℃时扩增条带很弱，因此选择 90 ℃为最适变
性温度。变性时间在 15 s 条带明显减弱，因此选择
15 s为最适变性时间。反应条件优化见表 3。
综合以上优化结果可以得出，为了能够达到快
速检测的目的，本实验最终确定的人参快速 PCＲ 反
应反应参数为 88 ℃预变性 1 min 后;88 ℃ 10 s，65
℃ 15 s，31 个循环;西洋参快速 PCＲ 反应反应参数
为 90 ℃预变性 1 min 后;90 ℃ 15 s，59 ℃ 20 s，29
个循环。采用以上反应条件分别使用不同 PCＲ 仪
对人参、西洋参及同属近缘种样品进行快速 PCＲ 扩
增，结果表明:最终优化得到的人参、西洋参快速
PCＲ反应反应参数使用 GeneAmp 9700 型 PCＲ扩增
仪、VeritiTM 96 孔梯度 PCＲ 扩增仪、TC-512 梯度
PCＲ仪扩增，电泳检测后均可获得样品的特异性目
的条带，见图 1。
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表 3 人参属药用植物 PCＲ反应条件优化
因素 数值
ＲS-F1 /Ｒ1 XYS-F1 /Ｒ1
Pg Pq Pn Pj Pjm Pjb Pg Pq Pn Pj Pjm Pjb
循环数 35 + － － － － － － + － － － －
33 + － － － － － － + － － － －
31 + － － － － － － + － － － －
29 △ － － － － － － △ － － － －
27 － － － － － － － △ － － － －
变性温度 /℃ 94 + － － － － － － + － － － －
92 + － － － － － － + － － － －
90 + － － － － － － △ － － － －
88 △ － － － － － － － － － － －
退火温度 /℃ 55 △ － － － － － － △ － － － －
57 + － － － － － － △ － － － －
59 + － － － － － － + － － － －
61 + － － － － － － + － － － －
63 + － － － － － － + － － － －
65 + － － － － － － △ － － － －
67 △ － － － － － － △ － － － －
变性时间 / s 25 + － － － － － － + － － － －
20 + － － － － － － + － － － －
15 + － － － － － － △ － － － －
10 △ － － － － － － △ － － － －
5 △ － － － － － － △ － － － －
退火时间 / s 25 + － － － － － － + － － － －
20 + － － － － － － △ － － － －
15 △ － － － － － － △ － － － －
10 △ － － － － － － △ － － － －
5 △ － － － － － － △ － － － －
注:“ +”表示亮带;“△”表示暗带;“ －”表示无带
图 1 人参、西洋参快速 PCＲ产物凝胶电泳
结果以及荧光检测结果
A. 人参 B. 西洋参 M. DL 2000 M1. Marker A2 ～ 7.
人参(吉林集安) A8 ～ 12. 人参(吉林白山)
B2 ～ 5. 西洋参(河北石家庄) B6 ～ 8. 西洋参(吉林长春)
B9 ～ 12. 西洋参(北京怀柔)
3. 3 快速 PCＲ反应荧光检测 分别选择优化的人
参和西洋参快速 PCＲ 反应参数，对人参、西洋参及
同属近缘种样品进行快速 PCＲ扩增，在扩增产物中
加入 2 μL 100 × SYBＲ Green Ⅰ，于 365 nm紫外波
长下进行荧光检测。结果表明，正品显示出明亮绿
色荧光，而伪品不发出荧光，见图 2。
图 2 人参属药用植物快速 PCＲ荧光检测结果
1. 人参 2. 西洋参 3. 三七 4. 珠子参 5. 竹节参
6. 羽叶三七 7. 空白对照
4 讨论
本实验主要针对人参和西洋参 2 种药材，建立
快速 PCＲ鉴别方法，经 DNA 提取、PCＲ 扩增、荧光
检测 3 个步骤，可完成 2 种药材的快速鉴别，有利于
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实现中药材分子鉴别的现场运用。
快速 PCＲ方法具有易于检测且快速的特点，相
比一些需要测序的分子鉴定方法而言，该方法对于
人参和西洋参及同属近缘种药材之间的鉴别显示出
较大的优势。经典 PCＲ鉴定技术虽然拥有准确、专
属性强、重现性好等特点〔11〕，但由于其自身操作相
对复杂、单次反应耗时较长，难以用于中药材现场鉴
别。使用快速 PCＲ技术可在确保 PCＲ 反应灵敏度
和特异性的前提下，尽可能大的缩短 PCＲ过程中变
性、退火和延伸时间，并将传统的凝胶电泳检测结果
方法改为荧光染料快速染色的方法，可最终提高检
测时间和检测效率。因此，快速 PCＲ技术可以通过
对经典 PCＲ 反应进行条件优化，结合荧光检测技
术，操作简单、检测结果准确，在中药材的鉴定中具
有优势，也适用于药材快速检测试剂盒的开发，有助
于实现中药材现场准确、快速鉴定。
参 考 文 献
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