全 文 ：中国农学通报 2011,27(31):93-98
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
绣球属(Hydrangea)是绣球科中最大的一个属，全
世界大约 73个种，主要分布于东南亚和南北美洲，中
国有 47个种和 11个变种，约占世界资源的 63%[1]，中
国除海南、黑龙江、新疆、青海等省区外，全国各地均有
分布，主产秦岭以南，尤以西南部种类最多[2]，绣球属
植物具有适应性强、耐寒、耐荫、抗逆性强和病虫害少
等特点，是世界园林中非常重要的观赏植物，其中八仙
花在世界范围内广泛应用，但是目前八仙花的品种大
多是20世纪初期欧洲选育出的，因此绣球属植物的育
种及资源保存逐渐成为研究热点。
目前分子标记技术种类很多，Timothy等运用SSR
对绣球属资源进行遗传分析，结果表明不同种之间的
差异为 64.7%[3]；对 114个八仙花品种进行SSR标记发
现，四季开花、杂色和重瓣花的特性具有遗传相似性[4]；
通过SSR标记36个圆锥绣球品种，发现了早花特性和
来源于日本的新基因型 [5]。SRAP（Sequence-Related
Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性）是由
美国Li和Quiros博士 2001创建的一种基于PCR的新
型DNA分子标记技术，该标记技术是一种无需任何序
列信息即可直接PCR扩增的新型分子标记技术，具有
方便、快速、重复性好、再现性高等优点[6]，主要用于遗
传多样性分析[7-8]、目的性状标记[9]、基因定位及遗传图
谱构建[10]等研究领域，绣球属植物中，目前仅有SRAP
基金项目：湖南省科技厅重点项目“居室园艺产业化关键技术及体系研究”(2010NK2007)。
第一作者简介：陈海霞，女，1976年出生，湖南桑植人，讲师，博士，研究方向：观赏植物分子生物学。通信地址：410128湖南农业大学园艺园林学院，
Tel：0731-84618171，E-mail：chenhx1996@yahoo.cn。
通讯作者：彭尽晖，女，1968年出生，湖南湘阴人，副教授，博士，研究方向：观赏植物分子生物学。通信地址：410128湖南农业大学园艺园林学院，
Tel：0731-84618171，E-mail：happy_chen2004@126.com。
收稿日期：2011-06-01，修回日期：2011-07-25。
绣球属植物SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选
陈海霞，彭尽晖
（湖南农业大学园艺园林学院，长沙 410128）
摘 要：为了确定绣球属植物SRAP-PCR最适宜的反应体系，以19种绣球属植物为材料，利用单因素分
析法对影响SRAP-PCR反应体系的5个因素（DNA模板量，Mg2+浓度，dNTPs浓度，Taq聚合酶量和引物浓
度）在11个水平上进行优化试验。结果表明，最佳的25 μL反应体系为：10×PCR Buffer 2.5 μL，DNA模
板量 30 ng，Mg2+浓度 1.6 mmol/L、dNTPs浓度 0.6 mmol/L，Taq聚合酶量 3.5 U，引物浓度为 0.2 μmol/L。
单因素分析法获得的最佳反应体系适合绣球属植物SRAP的遗传多样性研究。
关键词：绣球属；SRAP；单因素分析；体系优化
中图分类号：S682.1+9 文献标志码：A 论文编号：2011-1623
Optimization of SRAP-PCR System and Primers Screening in Hydrangea
Chen Haixia, Peng Jinhui
(College of Horticulture and Landscape, HNAU, Changsha 410128)
Abstract: In order to make clear the optimizing SRAP-PCR reaction system of Hydrangea, 19 Hydrangea
plants were used as material, the single factor experiment was designed in 11 levels of 5 factors (concentration
of primer, Mg2 + , DNA template and dNTPs, and Taq DNA polymerase contents) respectively. The results
showed that the reaction system obtained as followed: 2.5 μL 10×PCR Buffer, 30 ng DNA , 1.6 mmol/L MgCl2,
0.6 mmol/L dNTPs, 3.5 U Taq DNA polymerase, and in a total volume of 25 μL. This optimizing reaction
system is suit for the SRAP genetic variation research of Hydrangea.
Key words: Hydrangea; SRAP; single factor experiment; system optimization
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分子技术在八仙花上的应用报道[11]。在利用SRAP技
术进行种质资源的遗传多样性分析时，PCR反应体系
受到多种因素的影响，主要包括DNA模板量、Mg2+浓
度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶量，而且不同物
种对反应的要求也有差异。笔者利用单因素实验设计
对绣球属植物SRAP-PCR反应体系进行优化，以及对
SRAP引物组合进行多态性筛选，以期获得绣球属植
物最佳SRAP反应体系和多态性丰富的SRAP引物组
合，为今后绣球属植物资源的SRAP分子标记、遗传多
样性评价和分子辅助育种等方面的研究提供技术支
持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 本试验共采集了 19种绣球属植物资
源，其中 11个野生种分别采自湖南桑植、南岳、大围
山，并于2007年移栽至湖南农业大学花卉基地进行正
常的栽培管理，8个为八仙花栽培品种分别来自河北
林科院和湖南农业大学花卉基地（见表1）。
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
中文名
伞形绣球
蜡莲绣球
阔叶腊莲绣球
长柄绣球
大枝绣球
圆锥绣球
紫背绣球
柔毛绣球
光柄绣球
白背绣球
柳叶绣球
花叶八仙花
八仙花品种A
八仙花品种B
八仙花品种C
八仙花品种D
八仙花品种E
八仙花品种F
八仙花品种G
拉丁名
H. chinensis
H. strigosa
H. strigosa var.
H. longipes
H. rosthornii
H. paniculata
H. strigosa var.
H. villosa.
H. glabripes
H. hypoglauca.
H. senophylla
H. macrophylla‘Maculata’
H. macrophylla‘Leuchtfer’
H. macrophylla‘Snowball’
H. macrophylla‘Adria’
H. macrophylla‘Lavbla’
H. macrophylla‘Coerulea’
H. macrophylla‘Kuhner’
H. macrophylla
来源
湖南大围山
湖南南岳
湖南大围山
湖南桑植
湖南桑植
湖南南岳
湖南桑植
湖南桑植
湖南桑植
湖南桑植
湖南桑植
浙江杭州
河北林科院
河北林科院
河北林科院
河北林科院
湖南农大花圃
湖南农大花圃
湖南农大花圃
生长状况
野生种
野生种
野生种
野生种
野生种
野生种
野生种
野生种
野生种
野生种
野生种
栽培品种
栽培品种
栽培品种
栽培品种
栽培品种
栽培品种
栽培品种
栽培品种
表1 植物材料表
1.1.2 试剂 用于 SRAP-PCR的 Taq聚合酶、MgCl2、
dNTPs和Buffer均购自鼎国生物（北京）有限公司，用
于凝胶检测的标准分子质量(Marker)100 bp plus DNA
Ladder也购自鼎国（北京）有限公司。
1.1.3 引物 引物由英俊生物技术有限公司合成，分别
由 10个上游引物(Me1~Me10)和 11(Em1~Em11)个下
游引物组成110对引物组合（见表2）。
1.2 方法
1.2.1 总DNA的提取 参照CTAB改良法 [12]提取绣球
属植物总DNA。用紫外分光光度计检验基因组DNA
溶液的浓度和纯度，并结合1%琼脂糖凝胶电泳检测其
完整性，最终将DNA稀释为50 ng/μL，在-20℃保存。
1.2.2 SRAP反应体系的建立与优化 单因素设计：本
试验对绣球属扩增体系的5个影响因素进行单因素试验
设计（如表 3），设置 11个不同的浓度梯度，以引物对
Me2Em3进行体系筛选。基础扩增体系参照李艳香等[11]
的25 μL体系，按照表3顺序进行单因素多水平逐级优
化各反应参数，并选择最优参数进行下一个参数的优
化。
SRAP-PCR扩增程序：94℃预变性 4 min，94℃变
性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，共5个循环，
后 30个循环仅将退火温度改为 55.5℃，最后 72℃延伸
5 min。
PCR产物检测：取 16 μL SRAP扩增产物，在含有
·· 94
陈海霞等：绣球属植物SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选
EB的 2%琼脂糖凝胶电泳 90 min，电压 120 V，利用
SYNGENE凝胶成像系统对结果进行直观的分析和评
价。
2 结果与分析
2.1 总DNA的质量检测
2.1.1 紫外分光光度计检测 采用CTAB改良法得到的
DNA呈白色透明状，溶于水，紫外分光光度计检测结
果显示所有样品OD值均在1.46~1.95之间，表明DNA
质量较好，样品纯度符合要求。
2.1.2 DNA琼脂糖凝胶电泳检测 11个绣球属野生种
和8个八仙花栽培种的DNA琼脂糖电泳图表明，基因
组DNA质量均一，分子量在 5 kb左右，所有样品条带
清晰，均无明显的拖尾现象，说明提取的DNA样品比
较完整。
2.2 模板量对SRAP-PCR的影响
DNA模板是PCR扩增的关键，适宜的浓度不仅能
获得合适的PCR扩增产物而且能节省DNA模板。从
图 1可见，模板量为 10~100 ng都有清晰的扩增条带，
且无明显差别，综合考虑节约模板用量、条带的清晰度
和稳定性，选用DNA模板量为30 ng较为适宜。
2.3 Mg2+浓度对SRAP-PCR的影响
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，
它是Taq聚合酶活性的激活剂，如Mg2+浓度过低，合成
效率降低，扩增产物少，条带不清晰；当浓度过高时，产
生非特异性条带的几率增大。由图 2可见，Mg2+浓度
为 0.4 mmol/L时，低浓度的Mg2+降低了Taq聚合酶的
活性，没有扩增出条带；当浓度在1.6~3.2 mmol/L范围
内时扩增产物量一致；随着Mg2+浓度的进一步增加，
上游引物编号
Me1
Me2
Me3
Me4
Me5
Me6
Me7
Me8
Me9
Me10
上游引物序列(5′-3′)
TGA GTC CAA ACC GGA TA
TGA GTC CAA ACC GGA GC
TGA GTC CAA ACC GGA AT
TGA GTC CAA ACC GGA CA
TGA GTC CAA ACC GGA CC
TGA GTC CAA ACC GGT AG
TGA GTC CAA ACC GGT GT
TGA GTC CAA ACC GGT TG
TGA GTC CAA ACC GGT CA
TGA GTC CAA ACC GGT GC
下游引物编号
Em1
Em2
Em3
Em4
Em5
Em6
Em7
Em8
Em9
Em10
Em11
下游引物序列(5′-3′)
GAC TGC GTA CGA ATT AAT
GAC TGC GTA CGA ATT TGC
GAC TGC GTA CGA ATT GAC
GAC TGC GTA CGA ATT TGA
GAC TGC GTA CGA ATT AAC
GAC TGC GTA CGA ATT GCA
GAC TGC GTA CGA ATT ATG
GAC TGC GTA CGA ATT CAA
GAC TGC GTA CGA ATT CAG
GAC TGC GTA CGA ATT CTG
GAC TGC GTA CGA ATT ACG
表2 SRAP引物序列
水平
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
因素
DNA模板/(ng/25 μL)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Mg2+/(mmol/L)
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
2.8
3.2
3.6
4.0
4.4
dNTPs/(mmol/L)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
Taq DNA聚合酶/U
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
引物
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
表3 球属植物SRAP-PCR反应的影响因素水平
·· 95
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一一一一一一一一
一一一一一一一一
一一一一一一一一
M: Marker；编号1~11: 0、10、20、30、40、50、
60、70、80、90、100 ng/25 μL
图1 不同模板量条件下SRAP-PCR扩增结果
5000bp 1000bp 100bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
一一一一一一一一
一一一一一一一一
一一一一一一一一
M: Marker；编号1~11: 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、
2.8、3.2、3.6、4.0、4.4 mmol/L
图2 不同Mg2＋浓度条件下SRAP-PCR扩增结果
100 bp
1000 bp
500 bp3000 bp
1000 bp
100 bp
非特异性条带也增多，因此最佳的Mg2 +浓度为 1.6~
3.2 mmol/L之间，从经济角度考虑，以 1.6 mmol/L为
宜。
2.4 dNTPs浓度对SRAP-PCR的影响
dNTPs的质量和浓度与 PCR扩增效率有密切关
系，dNTPs量过低会影响合成的效率，导致扩增产物减
少；当dNTPs浓度增高时，产物增多，条带清晰，但浓度
过高，会出现条带缺失的现象。由不同浓度dNTPs扩
增的效果（见图3）可看出，dNTPs浓度小于0.2 mmol/L
时，扩增出来的条带较浅，随着dNTPs浓度的增加，条
带的数量和亮度均增大，当浓度大于1.0 mmol/L时，条
带变少，甚至缺失。因此，基于条带稳定和清晰的原
则，dNTPs浓度以0.6 mmol/L为宜。
2.5 Taq聚合酶浓度对SRAP-PCR的影响
合适的Taq聚合酶浓度对PCR的影响很大，浓度
过低则合成产物量少，浓度过高导致条带弥散，非特异
性条带增多。由不同 Taq聚合酶浓度扩增结果显示
（见图4），在0.5~2.0 U时，扩增条带少且较弱；随着Taq
聚合酶浓度的增加，逐渐出现清晰明亮的条带，当浓度
为 3.5~4.5 U时，扩增条带的数量和亮度稳定；当浓度
大于 4.5 U时，由于Taq聚合酶浓度较大，非特异性扩
增条带增多。因此，Taq聚合酶的合适浓度选为3.5 U。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
一一一一一一一一
一一一一一一一一
一一一一一一一一
M: Marker；编号1~11:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、
0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mmol/L
图3 不同dNTPs浓度条件下SRAP-PCR扩增结果
5000 bp
1000 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
一一一一一
一一一一一
一一一一一
M: Marker；编号1~11: 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、
3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 U
图4 不同Taq聚合酶浓度条件下SRAP-PCR扩增结果
3000 bp
1000 bp
100 bp
2.6 引物浓度对SRAP-PCR的影响
引物是SRAP-PCR特异性扩增反应的关键，引物
浓度过低，与模板DNA结合的效率较低，扩增产物减
少；引物浓度过高，易引起错配或形成引物二聚体，
产生非特异性条带。由不同引物浓度扩增的结果见
图 5，在 0.1~0.5 μmol/L范围之间，条带比较清晰；当
浓度大于 0.5 μmol/L时，由于引物浓度过大，出现非
特异性扩增现象。因此引物浓度为 0.2 μmol/L较为
适宜。
2.7 SRAP-PCR引物的筛选
选用大枝绣球、腊莲绣球、八仙花栽培种‘Lavbla’
和‘Kuhner’共4个样品的DNA为模板，利用优化后的
体系对110对引物进行初选、复选，优化体系最终体积
为 25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，DNA模板量 30 ng，
·· 96
陈海霞等：绣球属植物SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选
一一一一一一一一
一一一一一一一一
M: Marker；编号1~11:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、
0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 μmol/L
图5 不同引物浓度条件下SRAP-PCR扩增结果
正向引物
Me1
Me2
Me3
Me4
Me5
Me6
Me7
Me8
Me9
Me10
反向引物
Em1
√
－
√
－
－
√
√
－
－
－
Em2
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
Em3
√
－
－
－
－
－
－
－
－
－
Em4
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
Em5
－
－
√
－
－
－
－
－
－
－
Em6
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
Em7
－
－
√
√
－
－
－
－
－
－
Em8
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
Em9
√
－
√
－
－
－
－
－
－
－
Em10
√
－
－
－
－
－
－
－
－
－
Em11
√
－
－
√
－
√
－
－
－
－
表4 筛选出的SRAP引物
注：“√”，选用的引物对；“－”，淘汰的引物对。
3 讨论
SRAP标记是基于 PCR技术的分子标记技术，
PCR反应体系是SRAP检测体系中的一个重要环节，
由于PCR反应的特异性强，如果反应体系不合适则会
出现假阴性和假阳性的想象，因此，优化SRAP-PCR反
应条件是获得可靠结果的关键。影响SRAP-PCR反应
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M Mg
2+浓度 1.6 mmol/L、dNTPs浓度 0.6 mmol/L，Taq聚
合酶量3.5 U，引物浓度0.2 μmol/L。通过筛选得到14
对可扩增出多态性丰富、条带清晰、重复性好的引物组
合（见表4）。
2.8 SRAP-PCR扩增体系的检验
将筛选出来的 14对引物对 19种绣球属植物进行
SRAP-PCR扩增（见图 6），都能得到稳定清晰的条带，
如图6所示，引物对Me1Em11的扩增出的条带明亮清
晰，多态性丰富，稳定性好，而且特异性强。因此，本研
究获得的优化体系重复性好，稳定性强，适用于绣球属
植物的SRAP分子标记研究。
材料编号同表1
图6 Me1Em11引物对扩增结果
5000 bp
1000 bp
100 bp
5000 bp
1000 bp
100 bp
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的因素有 DNA模板、Mg2 +、dNTPs、引物浓度、Taq
DNA聚合酶和扩增程序等，这些因素直接影响SRAP
扩增结果。目前，PCR反应体系优化的常用方法主要
有单因子试验和正交设计试验。在观赏植物中，采用
单因子试验对红檵木[13]、非洲菊[14]、石蒜[15]、桂花[16]、石
斛属植物[17]等观赏植物进行SRAP-PCR反应体系进行
优化，以上研究均探讨了dNTPs、模板量、Taq聚合酶、
引物和Mg2+浓度这5个因素对扩增效果的影响。虽然
物种不同，结果有差异，但是在这5个因素中，DNA模
板量和 dNTPs浓度对扩增结果影响不大，而Taq聚合
酶和Mg2 +浓度决定了扩增的效果，浓度过低则产物
少，条带不清晰，浓度过高则产生非特异性条带，本项
研究结果与前人的结论一致。
绣球属植物种类丰富，大部分植物的花序大而密
集，花期集中在夏季，是值得开发的夏季观花植物资
源。彭尽晖等[18]调查结果表明，湖南分布很多绣球属
野生资源，其中部分是地方特有种，绣球属植物的形
态特征变化也很大，多为落叶灌木，还有攀援藤本；从
花序看，既有伞房状聚伞花序，也有圆锥花序。但目
前园林中广泛应用的主要是八仙花，并且大多数来自
国外，开发利用绣球属丰富的野生种质资源，具有十分
重大的意义。目前，尚未见绣球属植物遗传多样性的
研究，因此，建立绣球属植物SRAP反应体系，进行遗
传多样性和亲缘关系分析，将为研究其起源、品种分
类、杂交亲本选配和资源的开发利用等提供技术支持。
4 结论
在本项研究中，SRAP-PCR反应体系的优劣是通
过直接观察条带的强弱和条数而确定的，各影响因素
均有一个有效扩增浓度范围，因此应在考虑成本和实
际需要的基础上选择合适的反应体系。研究结果发现
Taq聚合酶和Mg2+浓度是决定SRAP扩增效果的关键，
因此今后应将这 2个影响因素进行定量分析，进一步
优化SRAP反应体系。
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