全 文 ：22 Special Wild Economic Animal and Plant Ｒesearch 特 产 研 究
文章编号: 1001 －4721 ( 2015) 03 －0022 －05
收稿日期: 2015 － 04 － 01
基金项目:吉林省科技厅项目( 20140204031NY)
作者简介:王秋霞( 1981 － ) ，女，山东省济宁市人，博士，助理研究员，从事药用植物研究。
※通讯作者:张亚玉，E － mail: zyy1966999@ sina． com．
龙胆属 6 种药用植物的 ITS2 序列分析
王秋霞，孙海，魏云洁，张舒娜，杨振，张亚玉※
( 中国农业科学院特产研究所，长春 130112)
摘要:本试验采用 ITS2 序列进行龙胆属 6 种药用植物的亲缘关系分析。通过测定粗糙龙胆( Gentiana scabra) 、三花龙胆( G．
triflora) 和条叶龙胆( G． manshurica) 的 ITS2 序列，同时从 GenBank下载包括滇龙胆( G． rigescens) 、秦艽( G． macrophylla) 和麻花
艽( G． straminea) 3 种药用植物在内的 27 个样本 ITS2 序列，采用 ClustalX、GeneDoc 和 MEGA 5. 0 软件比较分析龙胆属 6 种药
用植物的 ITS2 序列特征，进而用 MP、ML和 NJ法分别构建了龙胆属植物的分子进化树。结果显示，龙胆属 6 种药用植物( 包
括粗糙龙胆、三花龙胆、条叶龙胆、滇龙胆、秦艽和麻花艽) 的 ITS2 序列共有 187 个保守位点和 39 个变异位点，粗糙龙胆、三花
龙胆、条叶龙胆、滇龙胆的 ITS2 序列 GC含量较高，分别为 60. 2%、60. 6%、60. 6%和 60. 0% ;而秦艽和麻花艽的 GC含量较低，
分别为 58. 2%和 56. 3%。龙胆属 6 种药用植物中粗糙龙胆、三花龙胆和条叶龙胆 3 个物种间遗传距离较近，尤其是粗糙龙胆
和条叶龙胆之间仅为 0. 005;滇龙胆和麻花艽间的遗传距离最远( 0. 117) 。亲缘关系分析显示，龙胆草组物种( 粗糙龙胆、三花
龙胆和条叶龙胆) 和秦艽组物种( 秦艽、麻花艽) 表现出更近的亲缘关系;滇龙胆和其他 5 种药用植物( 粗糙龙胆、三花龙胆、条
叶龙胆、滇龙胆、秦艽和麻花艽) 间的亲缘关系则较远。ITS2 序列可以作为进行龙胆属 6 种药用植物亲缘关系分析的依据。
关键词:龙胆属; ITS2 序列;药用植物;亲缘关系分析
中图分类号: Q755 文献标识码: A
ITS2 Sequence Analysis of Six Medicinal Plants in Gentiana L．
WANG Qiu － xia，SUN Hai，WEI Yun － jie，ZHANG Shu － na，
YANG Zhen，ZHANG Ya － yu※
( Institute of Special Wild Economic Animals and Plants，Chinese Academy of
Agricultural Sciences，Changchun 130112，China)
Abstract: To provide evidence for the molecular identification and phylogeny relationship analysis of six medicinal plants in Gentiana
L．，three ITS2 sequence samples of three species in Gentiana L． were PCＲ amplified and sequenced，and 27 samples from the GenBank
were downloaded． Sequence features were compared and analyzed using ClustalX，GeneDoc and MEGA 5. 0 softwares，and phylogenetic analy-
ses were used to investigate their evolutionary relationships by neighbour － joining( NJ) ，maximum parsimony( MP) and maximum － likelihood
( ML) ． The results showed that there were 187 conserved sites and 39 variable sites in the ITS2 region of the six medicinal plants; The G +C
contents of ITS2 from G． scabra，G． triflora，G． manshurica，G． rigescens were higher( 60. 2%，60. 6%，60. 6%，and 60. 0%，respectively) com-
pared to those from G． macrophylla，and G． straminea( 58. 2% and 56. 3%，respectively) ; among the six medicinal plants，the genetic distances
of three species between G． scabra，G． triflora and G． manshurica were very small，especially between G． scabra and G． manshurica，which were
only 0. 005，while the largest genetic distances between G． rigescens and G． straminea were 0. 117;Medical plant species from section Pneumo-
nanthe( G． scabra，G． triflora，G． manshurica) were proved to be closely related to that of section Cruciata( G． macrophylla，G． straminea) ，and
there was a distant relationship between G． rigescens and each of the other five medicinal plants in Gentiana L． based on phylogenetic analysis．
The ITS2 sequence provides evidence for phylogeny relationship analysis of six medicinal plants in Gentiana L．
Key words: Gentiana; ITS2; medicinal plants; phylogeny relationship
第 3 期 王秋霞，等:龙胆属 6 种药用植物的 ITS2 序列分析 23
龙胆属是龙胆族中最大的一个属，全世界约有
360 种龙胆属植物，它们广泛分布于北半球温带地
区和热带高山地区，包括亚洲、欧洲、非洲北部以及
澳大利亚东部等地［1］。目前，龙胆属有中国西南山
岳地区及缅甸东北部、阿尔比斯山脉和比托牛斯山
脉两大公认的多样性中心［1，2］。
中国药典将龙胆属药用植物粗糙龙胆、三花龙
胆、条叶龙胆或滇龙胆的干燥根和根茎统称为龙胆，
其中前三种习称龙胆，后一种习称坚龙胆;秦艽和麻
花秦艽的干燥根统称秦艽。它们具有清热燥湿、泻
肝胆火等功效［3］。近几十年来，市场对龙胆属药用
植物的需求量大幅增加，但是过度采收和原产地生
态环境的破坏造成药用植物严重短缺［4，5］。龙胆属
药用植物的驯化栽培不仅可以满足中国传统药材的
市场需求，而且在减轻野生资源压力、保护药用植物
资源方面起到重要作用［6］。龙胆属药用植物的鉴
定和亲缘关系分析为其育种驯化提供理论基础。
核糖体 DNA 内转录间隔区 ITS2 ( Internal tran-
scribed spacer 2) 序列作为 DNA条形码在分子系统
进化和物种鉴定方面起到重要作用，它已被广泛应
用到药用植物的鉴定和分子系统演化研究中［7，8］。
目前，关于龙胆属其他植物系统进化方面的研究比
较多［1，9］，但是用 ITS2序列对龙胆属药用植物鉴定和
亲缘关系分析的研究很少。本研究通过测定 ITS2 序
列，采用龙胆属6种药用植物( 粗糙龙胆 Gentiana sca-
bra、条叶龙胆 G． triflora、三花龙胆 G． manshurica、秦艽
G． macrophylla、麻花艽 G． straminea、滇龙胆 G． riges-
cens) 及其 22个近缘种植物的 ITS2 序列构建系统进
化树，探讨龙胆属 6 种药用植物间的进化关系，为龙
胆属药用植物的亲缘关系分析提供依据。
1 材料和方法
1. 1 材料
粗糙龙胆、三花龙胆、条叶龙胆采自中国农业科
学院特产研究所药用植物资源圃( 表 1 ) ，由中国农
业科学院特产研究所魏云洁副研究员鉴定。从这 3
个物种中分离克隆得到其 ITS2 序列，与来自 Gen-
Bank数据库的 25 个龙胆属植物的 ITS2 序列一起，
进行系统进化分析( 表 2) 。
表 1 3 份供试材料
Table 1 The 3 Samples
编号
No．
GenBank登录号
Accession No． in GenBank
材料名称
Tax name
GenBank已有同种龙胆登录号
Accession No． of the same
Genetiana in GenBank
同源性( % )
Homology
组 别
Sect
1 KJ619511 粗糙龙胆 G． scabra AB564723 100
2 KJ619510 三花龙胆 G． triflora DQ398661 99
3 KJ619512 条叶龙胆 G． manshurica GQ864018 99
龙胆草组
Pneumonanthe
表 2 从 GenBank上获得的物种信息
Table 2 Species representative from different sections /genus in GenBank
编号
No．
物种名
Tax name
分组( 属)
Section( Genus)
登录号
Accession
number
材料采集地
Origin of materials
文章来源
Source
1 G． bavarica L． Calathianae Z48075 瑞士瓦莱州( Grand Chavalard，Valais，Switzerland) Yuan et al． ( 1996)［1］
2 春花龙胆 G． verna L． Calathianae Z48092 瑞士瓦莱州( Grand Chavalard，Valais，Switzerland) Yuan et al． ( 1996)［1］
3 刺芒龙胆 G． aristata Maxim． 小龙胆组 Chondrophyllae Z48116 中国甘肃玛曲县( Maqü，Gansu，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
4 G． boryi Boiss． 小龙胆组 Chondrophyllae Z48118 西班牙内华达山脉( Hoya del Moro，Sierra Nevada，Spain) Yuan et al． ( 1996)［1］
5 G． pyrenaica L． 小龙胆组 Chondrophyllae Z48087 保加利亚里拉山脉( Ｒila Mt．，Borovetz，Bulgaria) Yuan et al． ( 1996)［1］
6 G． alpina Vill． Ciminalis Z48073 瑞士瓦莱州( Grand Chavalard，Valais，Switzerland) Yuan et al． ( 1996)［1］
7 G． clusii Perr． et Song． Ciminalis Z48077 瑞士瓦莱州( Grand Chavalard，Valais，Switzerland) Yuan et al． ( 1996)［1］
8 秦艽 G． macrophylla Pall． 秦艽组 Cruciata Z48086 中国甘肃宕昌县( Dangchang，Gansu，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
9 麻花秦艽 G． straminea Maxim． 秦艽组 Cruciata Z48091 中国甘肃玛曲县( Maqü，Gansu，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
10 圆齿褶龙胆 G． crenulato － truncata T N． Ho 柱果组 Dolichocarpa Z48079 中国甘肃玛曲县( Maqü，Gansu，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
11 钻叶龙胆 G． haynaldii Kanitz 柱果组 Dolichocarpa Z48085 中国云南中甸( Zhongdian，Yunnan，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
12 高山龙胆 G． algida Pall． 高山龙胆组 Frigidae Z48117 美国落基山国家公园( Trail Ｒidge，Ｒocky Mt． Natl． Park，USA)Yuan et al． ( 1996)［1］
24 特 产 研 究 2015 年第 3 期
续表 2
编号
No．
物种名
Tax name
分组( 属)
Section( Genus)
登录号
Accession
number
材料采集地
Origin of materials
文章来源
Source
13 寒冷龙胆 G． frigida Haenke 高山龙胆组 Frigidae Z48084 保加利亚里拉山脉( Ｒila Mt．，Borovetz，Bulgaria) Yuan et al． ( 1996)［1］
14 黄龙胆 G． lutea L． 龙胆组 Gentiana Z48119 瑞士纳沙泰尔( La Tourne，Neuchatel，Switzerland) Yuan et al． ( 1996)［1］
15 G． punctata L． 龙胆组 Gentiana Z48088 保加利亚里拉山脉( Ｒila Mt．，Borovetz，Bulgaria) Yuan et al． ( 1996)［1］
16 平龙胆 G． depressa D． Don 匍茎组 Isomeria Z48081 中国西藏樟木县( Zhangmu，Tibet，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
17 乌奴龙胆 G． urnula H． Smith 匍茎组 Isomeria Z48090 中国西藏浪卡子县( Karu Pass，Langkazi，Tibet，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
18 微籽龙胆 G． delavayi Franch 微籽组 Microsperma Z48080 中国云南丽江( Lijiang，Yunnan，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
19 粗根龙胆 G． callistantha Diels et Gilg 多枝组 Monopodiae Z48078 中国甘肃碌曲( Luqü，Gansu，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
20 滇龙胆 G． rigescens Franch 多枝组 Monopodiae JF778857 中国云南( Yunnan，China) Yao et al． ( unpublished)
21 G． affinis Griseb． 龙胆草组 Pneumonanthe Z48074 美国科罗拉多州( Towhee Trail，Boulder，Colorado，USA) Yuan et al． ( 1996)［1］
22 G． asclepiadea L． 龙胆草组 Pneumonanthe Z48076 保加利亚( Izgorjaloto Gjune Ｒeserve，Bulgaria) Yuan et al． ( 1996)［1］
23 G． parryi Engelm． 龙胆草组 Pneumonanthe X85370 美国科罗拉多州南方公园( South Park，Colorado，USA) Yuan et al． ( 1996)［1］
24 高贵龙胆 G． gentilis Franch． 狭蕊组 Stenogyn Z48082 中国昆明西山( Western Hill，Kunming，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
25 红花龙胆 G． rhodantha Franch． ex Hemsl． 狭蕊组 Stenogyn Z48089 中国四川荥经县( Yingjing，Sichuan，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
26 大钟花 M． stylophorus( C． B． Clarke) H． Smith大钟花属 Megacodon Z48137 中国云南德钦县白马山( Mt． Baima，Deqin，Yunnan，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
27 大花扁蕾 Gs． Grandis( H． Smith) Ma 扁蕾属 Gentianopsis Z48140 中国云南丽江( Lijiang，Yunnan，China) Yuan et al． ( 1996)［1］
1. 2 DNA提取
选用新鲜幼嫩的叶片作为材料，采用改进的
CTAB法［10］提取总 DNA。
1. 3 ITS2 区序列扩增及测序
ITS2 区的扩增采用 White 等［11］描述的通用引
ITS3 ( 5 － GCATCGATGAAGAACGCAGC － 3) 和
ITS4( 5 － TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3) 。反应
体系和扩增反应程序参照 Yuan等［1］。将 PCＲ产物
经 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增质量。PCＲ 产物纯
化，连接 pGEM － T Easy 载体，转化 DH5α 大肠杆
菌，每份材料随机挑选 6 个白色克隆进行培养，提取
质粒后在 3730xl 型自动测序仪上进行 DNA 序列测
定。对测定结果进行手工校对。引物合成和序列测
定均由上海生物工程技术服务有限公司完成。
1. 4 序列分析和系统进化树的构建
运用 Clustal X ( version 1. 83，参数设为默认
值) ［12］和 GeneDoc［13］分析软件对 ITS2 序列进行排
序、比对和人工校正，再用 Mega5. 0 软件［14］统计所
测序列的平均碱基组成百分比、保守位点数和变异
位点等。
系统发育分析采用最大似然法 ( Maximum －
likelihood，ML) 、最大简约法( Maximum － parsimony，
MP) 和邻接法( Neighbor － joining，NJ) 构建分子进化
树，以大钟花属大钟花( Megacodon stylophorus) 和扁
蕾属大花扁蕾( Gentianopsis grandis) 2 个物种( 表 2)
作为外类群。
最大似然法分析使用 PAUP* 4. 0b10 软件［15］，
采用 MrModeltest 2. 3 软件［16］，根据 Akaike 准则［17］
估算出最适合 ITS2 序列的核苷酸替代模型( K80 +
G) ;构建最大似然树时进行 500 次重复抽样的自举
检验;设置进化模型类型为 2 ( nst = 2) ;位点间的速
率模型为 γ分布( Ｒates = gamma) 。
最大简约法和邻接法分析采用 Mega5. 0 软
件［14］，用 Bootstrap 值检验简约树中各分支的置信
度，自展数据集均为 1000 次。
2 结果与分析
2. 1 ITS2 序列的扩增和分析
龙胆草组物种 ( 粗糙龙胆，条叶龙胆和三花龙
胆) rDNA ITS2 区 PCＲ扩增出的条带均约 233bp，与
预期片段大小相符合。ITS2 序列经过校对后提交
GenBank，获得的登录号见表 1。经 Blast比对分析，
本试验所得的 3 个龙胆草组物种材料与 GenBank中
已有的同种龙胆的序列同源性均达 99%及以上( 表
1) ，比对结果与魏云洁老师鉴定结果一致。
对龙胆属 6 种药用植物的 ITS2 序列进行比对
分析，ITS2 序列共有 187 个保守位点和 39 个变异位
点，粗糙龙胆、三花龙胆、条叶龙胆、滇龙胆的 ITS2
序列的 GC 含量较高，分别为 60. 2%、60. 6%、
60. 6%和 60. 0% ;秦艽和麻花艽的 GC含量较低，分
别为 58. 2%和 56. 3%。ITS2 序列粗糙龙胆、三花龙
胆和条叶龙胆间遗传距离较近，尤其是粗糙龙胆和
条叶龙胆之间仅为 0. 005; 滇龙胆和麻花艽间的遗
第 3 期 王秋霞，等:龙胆属 6 种药用植物的 ITS2 序列分析 25
传距离最远( 0. 117) ( 表 3) 。
表 3 龙胆属 6 种药用植物的遗传距离
Table 3 Genetic distances among six medicinal plants in G entiana L．
粗糙龙胆
G． scabra
条叶龙胆
G． manshurica
三花龙胆
G． triflora
麻花艽
G． straminea
秦 艽
G． macrophylla
滇龙胆
G． rigescens
粗糙龙胆 G． scabra 0. 000
条叶龙胆 G． manshurica 0. 005 0. 000
三花龙胆 G． triflora 0. 024 0. 029 0. 000
麻花艽 G． straminea 0. 080 0. 085 0. 074 0. 000
秦艽 G． macrophylla 0. 049 0. 054 0. 054 0. 095 0. 000
滇龙胆 G． rigescens 0. 079 0. 085 0. 074 0. 117 0. 111 0. 000
2. 2 龙胆属药用植物系统进化分析
利用本研究测定的 3 个龙胆草组物种的 ITS2
序列( 表 1 ) ，并结合从 GenBank 中下载的序列 ( 表
2) ，以大钟花和大花扁蕾 2 个物种作为外类群，应
用邻接法、最大简约法和最大似然法构建了龙胆属
植物的 ITS2 序列分子进化树( 图 1) ，树上各分支上
的数字表示用 Bootstrap 统计分析后对该支的支持
百分比，其中 NJ和 MP树均是采用 1000 次重抽样，
ML树采用 500 次重抽样。
图 1 NJ分子进化树(左) ;ML分子进化树( 中) ;MP分子进化树(右) ;分支处值为 Bootstrap values
Fig. 1 NJ( left)，ML( Middle)，and MP( right) phylogenetic tree based on ITS2． The numbers represent the values of Bootstrap values
从图 1 中可以看出，3 种方法构建的分子进化
树具有基本相似的拓扑结构，节点支持率在 50 以
上，龙胆属 6 种药用植物可明显分为 2 大分支。龙
胆草组物种( 粗糙龙胆、三花龙胆和条叶龙胆) 与秦
艽、麻花艽聚为一个大的分支，其中粗糙龙胆和条叶
龙胆又进一步聚成一个小的分支; 而滇龙胆与高山
26 特 产 研 究 2015 年第 3 期
龙胆、匍茎组、微枝组、多枝组物种聚为一个大的分
支( 图 1) 。
3 讨论
龙胆属植物入中国药典的物种有龙胆草组物种
( 粗糙龙胆、三花龙胆和条叶龙胆) 、秦艽组物种( 秦
艽、麻花艽、粗茎秦艽 G． crassicaulis、小秦艽 G． dahu-
rica) 以及滇龙胆。目前，针对龙胆属药用植物的鉴
定和系统进化研究较少。ITS2 是物种鉴定和系统
进化分析的常用序列［7，8，18］，其中包括龙胆属物种的
进化分析［1］。Gielly 等［9］通过比较 cpDNA、nrDNA、
ITS1 和 ITS2 序列也证明，ITS2 更适合用于龙胆属
物种的系统进化分析。本试验选用龙胆属 6 种药用
植物，利用 DNA 条形码 ITS2 序列分析这 6 种药用
植物间的亲缘关系。
本试验 ML法、MP 法和 NJ 法构建的分子进化
树均显示龙胆属 6 种药用植物可明显分为 2 大分
支。龙胆草组物种 ( 粗糙龙胆、三花龙胆和条叶龙
胆) 和秦艽组物种( 秦艽、麻花艽) 聚为一支，其中龙
胆和条叶龙胆又进一步聚成一个小分支; 滇龙胆和
其他物种聚为另一支( 图 2) ，说明龙胆草组物种( 粗
糙龙胆、三花龙胆和条叶龙胆) 和秦艽、麻花艽亲缘
关系较近，而粗糙龙胆和条叶龙胆间的关系更近;滇
龙胆和其他 5 种龙胆属药用植物间的关系较远。这
与前人采用分子标记技术［19］和叶绿体序列分析方
法［20］所得结果一致。以上结果说明，龙胆属 6 种药
用植物的 ITS2 序列可以作为亲缘关系分析的依据。
参 考 文 献
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