全 文 ：果 树 学 报 2012，29（6）: 1004～1009
Journal of Fruit Science
利用 IRAP技术揭示部分柿属种间遗传关系
杜晓云 1，2，宿福园 2，3，张青林 2，王彦波 1，曾 明 1，罗正荣 2*
（1江西省农业科学院园艺研究所，南昌 330200； 2华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，
武汉 430070； 3武汉市林业果树科学研究所，武汉 430075）
摘 要： 【目的】为了明晰柿属植物种间亲缘关系和探究逆转座子与该属植物倍性进化的相关性，【方法】以 16 种 24
份柿属植物为试材，利用 IRAP（Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism）技术和 UPGMA 聚类分析。 【结果】采自
我国南热带的供试基因型独自成组，与其采集地域相吻合，反映了它们较古老的分类学地位；采自我国北亚热带和
温带的基因型独立于南亚热带基因型组，含丰富的染色体倍性，且相互间混聚在一起，无明显地域趋同性，反映了该
区域基因型间广泛的基因交流和适应性进化； 从 UPGMA 聚类图反映的不同区域柿属基因型间的相对位置来看，逆
转座子活性与其倍性进化及生态适应性间存在明显的相关性。 【结论】采自我国南亚热带的柿属植物可能更加古老；
逆转座子在柿属种间倍性进化过程中可能发挥了一定的作用。
关键词： 柿属植物； 遗传关系； IRAP； 逆转座子
中图分类号：S665．2 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2012)06－1004－06
Genetic relationships of some Diospyros spp. based on IRAP analysis
DU Xiao-yun1，2， SU Fu-yuan2，3， ZHANG Qing-lin2， WANG Yan-bo1， ZENG Ming1， LUO Zheng-rong2*
（1Institute of Horticultural Sciences， Jiangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanchang， Jiangxi 330200 China； 2Key Laboratory of Hor-
ticultural Plant Biology Affiliated to Ministry of Education， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070 China； 3Wuhan
Forestry & Fruits Research Institute，Wuhan， Hubei 430070 China）
Abstract: 【Objective】The objective of the present study is not only to elucidate inter-species genetic re-
lationships but also to explore the relations between retrotransposon activity and ploidy evolution in the
genus of Diospyros. 【Method】16 species including 24 genotypes were examined using both IRAP (Inter-
Retrotransposon Amplified Polymorphism) and UPGMA cluster method. 【Result】The genotypes collected
from south subtropical regions of China were grouped independently， in consistent with their collected ge-
ographical position， which reflected their ancient taxonomy status; Those collected from both north sub-
tropical and temperate regions of China were gathered together but apart from those from south subtropical
regions. The second above mentioned group contained abundant ploidy and crossing clustered from differ-
ent region， no obvious trends of geography， which displayed widely genetic exchanges and adaptive evo-
lution among them; In view of the result of cluster in the dendrogram， in which the relative positions a-
mong all of the genotypes tested collected from different geographical distribution and climate factor were
exhibited， there existed great relative correlations between activity of retrotransposons and ploidy as well
as adaptive evolution in the genus of Diospyros. 【Conclusion】The genotypes collected form south subtropi-
cal regions of China might be more ancient species. Retrotransposon might play an important role in ploidy
evolution of this genus.
Key words: Diospyros spp.； Genetic relationship； IRAP； Retrotransposon
收稿日期： 2012－07－26 接受日期: 2012－09－18
基金项目 ： 高等学校博士学科点专项科研基金项目 （20110146110018）； 国家自然科学基金 （31000896）； 江西省自然科学基金
（20114BAB214005）
作者简介： 杜晓云，女，博士。 Tel: 0791-85704288，E-mail：duxiaoyunduzi@126.com
觹 通讯作者 Author for correspondence． Tel: 027-87282677，E-mail: luozhr@mail.hzau.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.06.014
表 1 试验所用基因型
Table 1 The genotypes used in this study
编号
Code
基因型
Genotype
学名
Scientific name
倍性
Polidy level
采集地
Collection location
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
松本早生
Matsumoto wase
上西早生
Uenishi wase
富有
Fuyuu
阳丰
Youhou
次郎
Jirou
平核无
Hiratanenashi
罗田甜柿
Luotiantianshi
90-1-10
磨盘柿
Mopanshi
浙江柿 2
Chekiang persimmon2
浙江柿 1
Chekiang persimmon1
美洲柿 1
Common persimmon1
乌柿
Wushi
岭南柿
Lingnanshi
苗山柿
Miaoshanshi
君迁子
Date plum
油柿
Oily persimmon
Diospyros kaki Thunb.
D. kaki Thunb.
D. kaki Thunb.
D. kaki Thunb.
D. kaki Thunb.
D. kaki Thunb.
D. kaki Thunb.
D. kaki Thunb.
D. kaki Thunb.
D. glaucifolia Metc.
D. glaucifolia Metc.
D. virginiana L.
D. cathayensis Steward.
D. tutcheri Dunn.
D. miaoshanica S. Lee.
D. lotus L.
D. oleifera Cheng.
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=9x=135
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=4x=60
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=2x=30
华中农业大学柿圃
Huazhong Agricultural University Persimmon Repository
华中农业大学柿圃
Huazhong Agricultural University Persimmon Repository
华中农业大学柿圃
Huazhong Agricultural University Persimmon Repository
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Huazhong Agricultural University Persimmon Repository
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国家果树种质柿圃
National Fruits Germplasm Repository for Persimmon
华中农业大学柿圃
Huazhong Agricultural University Persimmon Repository
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国家果树种质柿圃
National Fruits Germplasm Repository for Persimmon
中国科学院武汉植物园
Wuhan Botanical Garden， The Chinese Academy of Sci-
ences
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ences
华中农业大学柿圃
Huazhong Agricultural University Persimmon Repository
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柿属（Diospyros L.；2n=2x，4x，6x，9x=30，60，90，
135）植物约 400~500 种 [1]，主要分布于热带、亚热带
地区。 温带分布的柿 （D. kaki Thunb.；2n=6x，9x=
90，135）是该属作为果树栽培的代表种，经济价值最
高，但其起源与进化途径尚不清楚。前人已对柿与柿
属近缘种间的亲缘关系进行过研究 [2-4]，但取材范围
狭窄（以国外分布的种为主），且主要以保守的单拷
贝基因序列为主，信息量有限。
逆转座子是高等植物基因组的重要组成部分，
以复制－转座的方式影响植物基因组的倍性、多样性
及遗传适应性。Kalendar 等[5]开发的逆转座子间扩增
多态性(inter-retrotransposon amplified polymorphism，
IRAP）技术， 揭示基因组中逆转座子之间序列的多
态性，比 SSR、AFLP等分子标记操作简单；较基因测
序成本低廉； 与 RAPD、ISSR 等常规分子标记相比，
试验重复性好、检测位点数多且多态性丰富；与其他
逆转座子分子标记如 RBIP、SSAP 和 REMAP 比较，
操作步骤简化、灵敏度更高，近年在植物种质资源研
究上应用广泛[6-10]。 Guo 等[11]和 Du等[12-13]基于自主开
发的柿特异逆转座子引物开发出柿属 IRAP 分子标
记，成功用于该属植物的部分基因型亲缘关系分析，
但所用试材侧重种下基因型。
逆转座子在植物基因组进化中发挥重要作用，
IRAP是检测逆转座子基因组转座行为的有效手段。
我们拟利用 IRAP 技术对分布于我国不同地理区域
的不同染色体倍性的柿属植物进行研究， 期望从逆
转座子角度揭示柿属植物种间亲缘关系及其可能的
起源进化途径。
1 材料和方法
1.1 材料
试验以 16个种 24份柿属基因型为试材， 试材
信息详见表 1。
1.2 方法
杜晓云等: 利用 IRAP 技术揭示部分柿属种间遗传关系6 期 1005
果 树 学 报 29 卷
编号
Code
基因型
Genotype
学名
Scientific name
倍性
Polidy level
采集地
Collection location
18
19
20
21
22
23
24
金枣柿
Jinzaoshi
老鸦柿
Diamond leaf persimmon
版纳柿 1
Bannashi 1
版纳柿 2
Bannashi 2
法国柿
Faguoshi
黑皮柿
Heipishi
野毛柿
Yemaoshi
D. sp.
D. rhombifolia Hemsl.
D. xishuangbannaensis C. Y. Wu et H. Chu.
D. xishuangbannaensis C. Y. Wu et H. Chu.
D. argentea Griff.
D. nigrocarter C. Y. Wu ex Wu et Li.
D. kaki Thunb. var. sylvestris Makino.
2n=2x=30
2n=4x=60
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=2x=30
华中农业大学柿圃
Huazhong Agricultural University Persimmon Repository
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中国科学院西双版纳热带植物园
Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， The Chinese
Academy of Sciences
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Academy of Sciences
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1.2.1 基因组 DNA 提取 叶片总 DNA 提取采用
CTAB 法[14]。
1.2.2 IRAP-PCR 分析 IRAP-PCR 分析参考杜晓
云等[15]；逆转座子引物基于罗田甜柿（Diospyros kaki
Thunb. ‘Luotian-tianshi’）Ty1-copia 类逆转座子的
RNaseH-LTR 序列自主开发 [12]； PCR 扩增产物于
2.0％ 琼脂糖（西班牙 Biowest）凝胶电泳检测；SYN-
GENE凝胶成像系统观察和记录谱带。 逆转座子引
物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 ，
PCR 反应涉及的分子生物学试剂均为北京三博远
志生物技术有限公司产品。
1.2.3 数据统计及分析 扩增产物按同一位点条带
有或无分别赋值，有带记为“1”，无带则记为“0”。 采
用 NTSYS-pc version2.1 软件计算 Jaccard 相似指数
并构建 UPGMA 聚类树。
2 结果与分析
2.1 扩增产物多态性分析
21个 IRAP引物在供试 24 份柿属种质种间、种
下均得到很好扩增 ， 扩增总带数 542 条 ，98.9％
（536）具有多态性，扩增片段大小在 100～2 000 bp，
单个引物扩增可产生 14 （rtdk20-r3、rtdk13-r5）～40
（rtdk14-f1、rtdk12-f2）条清晰可辨的条带，平均 26
条。 其中，100％多态性的引物有 17 个，占所用引物
总数的 80.95％。 图 1 所示为其中 4 个引物对 24 份
试材的 IRAP扩增图谱。
以 542 个 IRAP 标记组成原始矩阵 ， 利用
NTSYS-pc2.10e 计算得到的 24 份种质遗传相似系
数在 0.546～0.923。 其中，‘富有’和‘松本早生’的相
似系数最大（0.923），法国柿和‘阳丰’的相似系数最
小（0.546）。
2.2 聚类分析
采用 UPGMA 法进行聚类分析， 将聚类结果进
一步转化为协表征矩阵， 对协表征矩阵和相似系数
矩阵的相关性进行 Mantel检验。结果表明，2种矩阵
极显著相关，相关系数为 0.950，表明聚类结果很好
的体现了种质间的遗传关系。
若以相似系数 0.61为阈值，24份柿种质可分为
3 组（图 2）：Cluster1 包括‘松本早生’、‘上西早生’、
‘富有’、‘阳丰’、‘次郎’、‘平核无’、‘罗田甜柿’、
‘90-1-10’、‘磨盘柿’、‘油柿’、‘浙江柿 1’、‘浙江柿
2’和‘君迁子’。 以相似系数 0.77 为阈值，该组进一
步细分为 2 个亚组：9 个柿基因型在聚类图上聚为
第 1 个亚组，除‘平核无’为 9 倍体外，均为 6 倍体。
其中，‘松本早生’是‘富有’的芽变，2 者相似系数为
0.92，表明 2 者亲缘关系最近。 ‘阳丰’是‘富有’和
‘次郎’的杂交后代，聚类时首先与其父本‘次郎’聚
在一起。‘上西早生’是‘松本早生’的芽变，且与前述
试材亲缘关系较近， 在聚类图上位于同一个分支。
‘平核无’同前述 5 个基因型均属日本种质，它们之
间亲缘关系较近，但因其倍性较为特殊（为 9 倍体），
聚在日本甜柿组的最外围。 ‘90-1-10’是原产我国
湖北大别山区的不完全甜柿变异单株， 与 ‘罗田甜
柿’聚为一组。 Cluster 1 的第 2个亚组由‘油柿’、‘浙
江柿 2’、‘浙江柿 1’、‘君迁子’组成，均为 2倍体。其
中，‘油柿’与柿的亲缘关系更近。 ‘浙江柿 1’和‘浙
江柿 2’在聚类图上最先聚为一类，再与‘君迁子’相
聚，可能表明浙江柿和‘君迁子’间具有较近的亲缘
续表 1 Table 1 continued
1006
6 期
图 2 24 份基因型 IRAP 分析的 UPGMA 聚类分析
Fig. 2 Dendrogram of 24 genotypes from the UPGMA cluster analysis based on IRAP analysis
图 1 4 个引物对 24 份试材的 IRAP 扩增
A. rtdk10-p4； B. rtdk13-r6； C. rtdk16-r10； D. rtdk16-f8；M. DL2000 marker。 1~24 对应品种名见表 1。
Fig. 1 IRAP profiles of four different retrotransposon primers on 24 accessions
A. rtdk10-p4; B. rtdk13-r6; C. rtdk16-r10; D. rtdk16-f8. M. DL2000 marker. Lanes 1 to 24 correspond to the accessions listed in Table 1.
杜晓云等: 利用 IRAP 技术揭示部分柿属种间遗传关系
bp
2 000
1 000
750
500
250
100
2 000
1 000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021222324M 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021222324
Cluster 1
Cluster 2
Cluster 3
Coefficient
0.60 0.67 0.74 0.80 0.87 0.94
L1 L2
松本早生 Matsumoto wase
富有 Fuyuu
阳丰 Youhou
次郎 Jirou
上西早生 Uenishi wase
平核无 Hiratanenashi
磨盘柿 Mopanshi
罗田甜柿 Luotiantianshi
90-1-10
油柿 Oily persimmon
浙江柿 1 Chekiang persimmon1
浙江柿 2 Chekiang persimmon2
君迁子 Date plum
美洲柿 1 Common persimmon1
乌柿 Wushi
岭南柿 Lingnanshi
苗山柿 Miaoshanshi
老鸦柿 Diamond leaf persimmon
金枣柿 Jinzaoshi
版纳柿 1 Bannashi 1
版纳柿 2 Bannashi 2
法国柿 Faguoshi
黑皮柿 Heipishi
野毛柿 Yemaoshi
1007
果 树 学 报 29 卷
关系。 Cluster2包括：‘美洲柿 1’、‘乌柿’、‘岭南柿’、
‘苗山柿’、‘金枣柿’和‘老鸦柿’。其中，美洲柿和‘老
鸦柿’为 4倍体，其余 3份种质均为 2倍体。 该组聚
类分析中美洲柿与其他 4份种质表现较远的亲缘关
系，‘乌柿’、‘岭南柿’和‘苗山柿’3 者间亲缘关系相
对近些。 Cluster3 由版纳柿 1、版纳柿 2、法国柿、黑
皮柿、野毛柿相聚形成，它们均为 2 倍体，且均采自
中国西南地区的原始森林。
3 讨 论
3.1 IRAP用于柿属植物遗传关系分析结果的可靠
性
研究中‘君迁子’（通常作为柿的砧木）与‘油柿’
（通常由于提取柿单宁）与柿的亲缘关系较近；浙江
柿 2、‘浙江柿 1’和‘君迁子’聚在一起，并且与柿的
亲缘关系较近，与 Guo等[16]的研究结果一致；
Nakamura 等 [17]、Yonemori 等 [3]的研究表明‘老鸦
柿’与柿的亲缘关系最远，本研究中‘老鸦柿’聚在了
第 2 组的次外围，支持他们的结论；‘乌柿’和‘老鸦
柿’均可用作柿树的砧木，‘老鸦柿’标本过去常被误
定为‘乌柿’，2 者除果柄长度、果的宿存萼裂片形状
及叶形存在差异外， 其他植物学特征十分相似；‘苗
山柿’近似‘岭南柿’，2 者均系小乔木，叶革质，椭圆
形，先端渐尖、基部钝或近圆形，叶柄略纤细，果为球
形，初时密被粗伏毛，后变无毛。本研究中，上述 2类
试材都各自成组， 表明聚类结果所反映的种质间的
遗传关系与植物学特征基本吻合；此外，部分已知亲
缘关系的试材，如芽变、日本柿及中国柿种质各自单
独聚类， 与其实际亲缘关系相符， 表明本研究基于
IRAP 技术获得的柿属植物种间和柿种下遗传关系
的可靠性。
3.2 IRAP揭示的柿属植物种间遗传关系
Yonemori 等 [3-4]分别应用 cpDNA PCR-RFLP 和
ITS 及 matK 基因测序分析柿属植物种间亲缘关系，
表明供试的亚热带和温带柿属材料聚类结果与地理
分布无明显趋同性。 本研究除云南（南亚热带）采集
的 5 份柿属种质外，其他 13 个种（北亚热带和温带
采集） 都表现相对较近的亲缘关系而相互混聚在一
起，分支与地理分布相关性小，同 Yonemori 等[3]结果
类似，说明柿属植物的起源可能较早，在先于现有种
的地理分布之前柿种间几个主要的分类群已经形
成。 而处于南亚热带地区的云南被认为是柿属植物
的起源地之一， 本研究在该地区采集的几份柿种独
自成组，反映了他们更为古老的分类学地位。
在南亚热带采集的基因型中， 除野毛柿外的其
他 4个种在形态学上明显与柿存在差异， 它们在聚
类图上呈现的聚类结果也验证了这一点， 初步可以
认为其与柿的亲缘关系较远。 但野毛柿的聚类结果
与实际不太相符： 该种质在外观形态上与柿相似程
度很高 [18]，国内的分类中甚至将其与柿种及柿的变
种野柿划归为一类，Yonemori 等 [18]也将其暂定为柿
种的候选祖先种之一。而我们的聚类图上，其与柿种
以及其他几个既定的与柿亲缘关系较近的近缘种的
关系却甚远， 推测其可能系栽培柿的中间祖先种或
更加古老的祖先种。
3.3 IRAP揭示的逆转座子与柿属植物倍性进化关
系
逆转座子具有逆境激活特性，环境、气候、加倍
化、杂交等因子可诱导转座事件发生[19-20]。 本研究中
采自南亚热带的试材均是 2倍体， 而供试温带柿属
植物存在 2 倍体、4 倍体，6 倍体和 9 倍体等广泛的
染色体倍性多样性。 逆转座子间扩增多态性分析结
果通过聚类图显示： 北亚热带地区的试材与采自南
亚热带云南西双版纳的试材染色体倍性变化同气候
带的逐步过渡呈现一定规律性， 即随气候带顺序从
中国南部的南亚热带―北亚热带―温带过渡， 分布
的柿属植物染色体倍性逐渐增加， 表明逆转座子通
过发生逆境激活转座可能参与了柿属植物的倍性进
化过程。 进一步的证据和相关机理研究还需通过从
逆转座子拷贝数、 基因组分布与柿属植物倍性间的
关系角度展开。
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