全 文 ：果 树 学 报 2010，27（6）: 1014～1018
Journal of Fruit Science
SRAP在西藏木瓜属种质资源研究中的应用
夏永秀 1，曾秀丽 2，3，廖明安 1*，潘光堂 3，龚君华 2，次仁卓嘎 2
（1四川农业大学园艺学院，四川雅安 625014； 2西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所，拉萨 850030；
3四川农业大学玉米研究所， 四川雅安 625014）
摘 要: 利用正交设计，首次对西藏木瓜属植物 SRAP-PCR 反应体系中的引物浓度、Taq 酶、dNTPs、模板 DNA、Mg2+
在 4 个水平上进行优化，建立了木瓜属植物 SRAP-PCR 反应的最佳体系: 25 μL 反应体系中，含 10×buffer 2.5 μL，引
物浓度 0.4 μmol·L-1，Taq 酶 1.0 U，dNTPs 浓度 0.3 mmol·L-1， 模板 DNA 70 ng，Mg2+浓度 2.0 mmol·L-1。 用引物组合
M1E7 和 M3E18 检验上述优化体系，结果显示该体系具有较高稳定性。 在此基础上，用筛选的 28 对 SRAP 引物组合
对 21 份西藏野生木瓜资源总 DNA 进行 SRAP-PCR 扩增，共检测出 420 个位点，其中多态性位点数 363 个，多态性
位点百分率为 86.67%。 为此，SRAP 分子标记可用于木瓜属植物遗传多样性的研究。
关键词: 木瓜； SRAP； 反应体系； 正交设计； 优化
中图分类号：S661．6 文献标识码：A 文章编号：1009－9980(2010)06－1014－05
Application of SRAP in germplasm research of Chaenomeles in Tibet
XIA Yong-xiu1， ZENG Xiu-li2，3， LIAO Ming-an1*， PAN Guang-tang3， GONG Jun-hua2， CIREN Zhuo-
ga2
(1College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Ya’an， Sichuan 625014 China； 2Institute of Vegetable， Tibet Academy of Agri-
culture and Animal Husbandry Sciences， Lasa， Tibet 850030 China； 3Maize Research Institute， Sichuan Agricultural University， Ya’an，
Sichuan 625014 China)
Abstract: Orthogonal design experiments on concentration of primers， Taq DNA polymerase， dNTPs， DNA template and
Mg2+ were performed at 4 different levels to establish the optimal SRAP-PCR amplification system for Chaenomels plants. The
25 μL system containing 2.5 μL 10×buffer， 0.4 μmol·L -1 each primer， 1.0 U of Taq DNA polymerase， 0.3 mmol·L -1
dNTPs， 70 ng DNA template and 2.0 mmol·L-1 Mg2+ was the optimal. The primer combination of M1E7 and M3E18 were used
to test the stabilization of the optimized reaction system， indicating that the optimized reaction system was very stable. Addi-
tionally， total DNA from 21 samples of Chaenomeles in Tibet was detected by the optimal system using selected 28 pairs of
primer combinations， leading to 420 got sites， among which 363 (86.67%) sites were polymorphic. Therefore， the optimal
SRAP-PCR amplification system could be used in genetic diversity assay of Chaenomeles.
Key words: Chaenomeles Lindl.； SRAP； Reaction system； Orthogonal design； Optimization
相关序列扩增多态性 （Sequence-related ampli-
fied polymorphism，SRAP）是一种新型的基于 PCR 扩
增的标记系统，由美国加州大学蔬菜系 Li 等[1]发明，
采用长 17 ~18 bp 的上下游引物对开放阅读框
（ORFs）进行扩增，因不同物种的内含子、启动子与
间隔长度不等而产生多态性。 该技术简便、快速、扩
增稳定，是评价遗传多样性、品种鉴定和系统发生的
有效工具[2]，已运用于枇杷[3]、樱桃[4]、荔枝 [5]等果树遗
传多样性研究。
蔷薇科木瓜属（Chaenomeles Lindl.）共 5个种，分
别是光皮木瓜 （C. sinensis koehne.）、 皱皮木瓜（C.
speciosa Nakai.）、毛叶木瓜（C. cathayensis Scheid.）、
西藏木瓜 （C. thibetica Yu）和日本木瓜 [C. japonica
（Thunb.）Lindl. ex.spach]。 分子标记能够快速准确地
对大量品种进行分类和鉴定， 有着传统植物学形态
方法不可比拟的优越性， 通过分子标记对木瓜种质
资源进行遗传多样性和种源遗传变异及特有基因的
研究， 建立完整的木瓜种质资源基因库对深入开展
育种工作意义重大， 而目前对木瓜属分子标记方面
的研究鲜有报道。我们利用正交设计，建立并优化西
收稿日期： 2010－05－05 接受日期: 2010－08－15
基金项目： 西藏自治区农牧科学院博士启动基金；四川农业大学博士后基金
作者简介： 夏永秀，女，在读硕士生，研究方向：果树生态生理。 Tel: 13778761303，E-mail: qjdhtynite@163.com
觹 通讯作者。 Author for correspondence． Tel: 13980175828，E-mail: lman@sicau.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2010.06.010
表 1 PCR 反应的 L16（45）正交试验设计
Table 1 L16（45）orthogonal design for PCR reaction
表 2 SRAP 标记的正向引物（Me）、反向引物（Em）序列
Table 2 Sequences of SRAP forward （Me） and reverse （Em） primers
编号
Code
正向引物序列 (5-3)
Forward sequence (5-3)
编号
Code
反向引物序列 (5-3)
Reverse sequence (5-3)
Me1
Me2
Me3
Me4
Me5
Me6
Me7
Me8
Me9
Me10
Me11
Me12
Me13
Me14
Me15
Me16
Me17
TGAGTCCAAACCGGATA
TGAGTCCAAACCGGAGC
TGAGTCCAAACCGGAAT
TGAGTCCAAACCGGACC
TGAGTCCAAACCGGAAG
TGAGTCCAAACCGGACA
TGAGTCCAAACCGGACG
TGAGTCCAAACCGGACT
TGAGTCCAAACCGGAGG
TGAGTCCAAACCGGAAA
TGAGTCCAAACCGGAAC
TGAGTCCAAACCGGAGA
TGAGTCCAAACCGGTAG
TGAGTCCAAACCGGTTG
TGAGTCCAAACCGGTGT
TGAGTCCAAACCGGTCA
TGAGTCCAAACCGGGTA
Em1
Em2
Em3
Em4
Em5
Em6
Em7
Em8
Em9
Em10
Em11
Em12
Em13
Em14
Em15
Em16
Em17
Em18
Em19
Em20
GACTGCGTACGAATTAAC
GACTGCGTACGAATTAAT
GACTGCGTACGAATTACG
GACTGCGTACGAATTAGC
GACTGCGTACGAATTATG
GACTGCGTACGAATTATT
GACTGCGTACGAATTCAA
GACTGCGTACGAATTCAC
GACTGCGTACGAATTCAG
GACTGCGTACGAATTCAT
GACTGCGTACGAATTCCA
GACTGCGTACGAATTCTC
GACTGCGTACGAATTCTT
GACTGCGTACGAATTGAC
GACTGCGTACGAATTGCA
GACTGCGTACGAATTGCT
GACTGCGTACGAATTGTC
GACTGCGTACGAATTTAG
GACTGCGTACGAATTTGA
GACTGCGTACGAATTTGC
藏野生木瓜属植物 SRAP-PCR 反应体系，并对引物
进行筛选，在此基础上对 21份西藏野生木瓜资源进
行分析， 旨在探索 SRAP 标记在木瓜属种质资源研
究上应用的可行性， 为今后木瓜属植物 SRAP 研究
提供体系和引物参考。
1 材料和方法
1.1 材料
供试木瓜分别来自西藏的拉萨、林芝、米林、察
隅等地，分属于西藏木瓜、光皮木瓜、皱皮木瓜，野生
类型。 2009 年 5—7 月采摘幼叶，硅胶干燥，密封保
存。 用于试验的 Mg2+、dNTPs、Taq 酶 、100 bp DNA
ladder 均购自天根生化科技公司；SRAP 上下游引物
由上海英俊公司合成。
1.2 方法
1.2.1 总 DNA 的提取与检测 木瓜幼叶总 DNA 的
提取参照陈向明 [6]的方法，核酸蛋白仪及 1.0%琼脂
糖凝胶电泳检测其浓度和纯度，稀释至 25 mg·L-1，
-20℃保存备用。
1.2.2 正交试验设计 以 2号木瓜总 DNA 为模板，
以 M6E3 为引物组合（表 2），选用 L16（45）正交设计
组合（表 1）进行 SRAP体系的优化。 体系总体积 25
μL，每处理均含 2.5 μL10×Buffer（Mg2+free），不足 25
μL用灭菌双蒸水补足。
1.2.3 PCR 扩增 每处理重复 2 次， 在 BIO-RAD
的 PTC 200 PCR 仪上进行扩增， 程序为: 94 ℃预变
性 5 min；94 ℃变性 1 min，35 ℃复性 1 min，72 ℃ 延
伸 1.5 min，5 个循环；94 ℃ 变性 1 min，50 ℃复性
1 min，72 ℃ 延伸 1.5 min，35 个循环；72 ℃ 延伸 8
min。 2％琼脂糖凝胶电泳检测产物，于 BIO-RAD 凝
胶成像系统上成像分析。
1.3 体系验证及引物多态性分析
编号
Code
引物浓度
Primer
/μmol·L-1
Taq 酶
Taq DNA
polymerase
/U
dNTPs
/mmol·L-1
DNA
DNA template
/ng
Mg2+
/mmol·L-1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
0.2
0.2
0.2
0.2
0.3
0.3
0.3
0.3
0.4
0.4
0.4
0.4
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
1.0
1.5
2.0
2.5
1.0
1.5
2.0
2.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0.1
0.2
0.3
0.4
0.2
0.1
0.4
0.3
0.3
0.4
0.1
0.2
0.4
0.3
0.2
0.1
10
30
50
70
50
70
10
30
70
50
30
10
30
10
70
50
1.5
2.0
2.5
3.0
3.0
2.5
2.0
1.5
2.0
1.5
3.0
2.5
2.5
3.0
1.5
2.0
直观分析与方差分析相结合对试验结果进行分
析，确立木瓜 SRAP-PCR 反应的最优体系。 根据 Li
等 [1]提出的原则设计引物，序列见表 2，用已优化体
系筛选引物， 并对 21 份西藏野生木瓜资源进行
SRAP扩增，以分析引物的多态性。
6 期 夏永秀等: SRAP 在西藏木瓜属种质资源研究中的应用 1015
果 树 学 报 27 卷
图 1 正交设计 PCR 产物电泳结果（引物 M6E3）
Fig. 1 Electrophoresis of orthogonal design PCR products （primer M6E3）
表 3 正交设计方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal design
变异来源
Source
平方和
SS
自由度
DF
均方
MS
F 值
F
P
引物浓度
Primer
Taq
dNTPs
模板
Template
Mg2+
误差 Error
总计 Total
186.375
21.125
251.125
77.625
19.625
19.000
574.875
3
3
3
3
3
16
31
62.125
7.042
83.708
25.875
6.542
1.188
52.316**
5.930**
70.491**
21.789**
5.509**
0.000
0.006
0.000
0.000
0.009
注： ** 代表 0.01 水平差异显著
Note: ** means significant difference at 0.01 level
2 结果与分析
2.1 正交设计直观分析
按表 1 的处理进行 PCR 扩增，电泳检测结果见
图 1，16个处理均有条带产生，但不同引物浓度、Taq
酶量、dNTPs 浓度、 模板 DNA 量及 Mg2+浓度的扩增
效果相差甚远。 参照何正文等[7]的方法，按照条带数
量、清晰度、背景颜色依次对 16个处理评分，最佳产
物 16分，相反，则为 1分。 2次重复独立统计， 1~16
号处理得分依次为 : 3、3、8、10、5、7、12、10、16、6、2、
7、14、15、13、9；2、1、8、11、5、8、11、12、16、8、4、7、15、
13、10、11。 2次重复结果一致性较好， 9号处理条带
丰富、清晰、背景亮度适宜，得分最高，为 16 个处理
中最佳组合。
2.2 正交设计方差分析
用 DPS3.01 对结果进行方差分析（表 3）和多重
比较。 由 F值可知，dNTPs 对反应影响最大，各因素
水平的变化对 PCR 反应的影响从大到小依次为 :
dNTPs，引物浓度，模板 DNA，Taq酶，Mg2+。
由图 1 可知，引物浓度为 0.2 μmol·L-1（1~4 号
处理）时，PCR 产物信号弱，背景浅；而浓度过大（0.5
μmol·L-1，13~16 号处理）时，PCR 产物信号强，但背
景较弥散； 浓度在 0.3~0.4 μmol·L-1 （5~12 号处理）
时， 扩增条带相对清晰且数量较多 ，2 者差异不
显著，结合 9 号处理，选择 0.4 μmol·L-1为引物最适
浓度。
由多重比较可知，Taq 酶在 1.0、2.0、2.5 U 水平
上差异均不显著。催化典型的 PCR反应约需酶 2.5 U
（反应体积为 100 μL），浓度过高可引起非特异性扩
增，浓度过低则合成产物量减少[8]。 节约成本兼顾效
果，1.0 U为最佳水平。
dNTPs 浓度为 0.1 mmol·L-1 （1、6、11、16 号处
理）时，产物量少，条带不清晰；浓度为 0.4 mmol·L-1
（4、7、10、13 号处理）时，产物量较多，条带清晰，但
浓度过高，错误掺入率会增加，并与 Taq 酶竞争 Mg2+
从而影响试验结果， 故选择 0.3 mmol·L-1为最佳水
平。
由图 1 可知， 模板 DNA 量在 70 ng（4、6、9、15
号处理）时，扩增条带较多而清晰，效果最好，为最佳
水平。
由方差分析可知，相对其他 4 个因子，Mg2+各浓
度间变化对木瓜 SRAP-PCR反应的影响最小。 由图
1 可知 ，1.5 mmol·L-1 （1、8、10、15 号处理 ） 与 3.0
mmol·L-1 （4、5、11、14 号处理）时效果相对次之，同
时考虑效果与成本，最适水平为 2.0 mmol·L-1。
2.3 体系稳定性检验
用优化的反应体系， 选用引物组合 M1E7 和
M3E18 对 21 份西藏野生木瓜资源进行扩增， 以检
验体系的稳定性。由图 2知，引物组合 M1E7共扩增
出 98 条清晰条带，77 条多态性条带，多态性条带百
分率为 78.57%； 共检测 11 个位点，10 个多态性位
点，多态性位点百分率为 90.91%。 引物组合 M3E18
扩增出 103 条清晰条带，82 条多态性条带， 多态性
条带百分率为 79.61%； 共检测 18 个位点，17 个多
态性位点，多态性位点百分率为 94.44%。 由此说明
该反应体系稳定、重复性好、扩增条带清晰、多态性
条带丰富，适合木瓜 SRAP反应。
2.4 引物筛选及其多态性分析
1016
6 期 夏永秀等: SRAP 在西藏木瓜属种质资源研究中的应用
图 2 2 对引物组合对 21 份木瓜资源的群体检测 M1E7（A）和 M3E18（B）
Fig. 2 Electrophoresis of amplification products of 21 chaenomele populations by primer M1E7（A） and M3E18（B）
表 4 28 对引物组合对 21 份木瓜资源的 SRAP-PCR 扩增结果
Table 4 SRAP-PCR amplification results of 21 chaenomele resources by 28 primers
引物组合
Primer
扩增条带数
Total bands
多态性条带数
Polymorphic bands
多态性条带百分率
Rate of polymorphic bands/%
扩增位点
Sites
多态性位点
Polymorphic sites
多态性位点百分率
Rate of polymorphic sites/%
M1E7
M2E19
M5E15
M5E5
M6E3
M6E6
M6E7
M7E6
M9E15
M1E6
M1E11
M3E18
M11E2
M11E5
M12E15
M12E20
M12E5
M13E5
M14E2
M7E7
M14E10
M15E5
M15E6
M15E10
M16E4
M17E5
M17E6
M17E7
总和 Total
98
192
173
155
158
106
116
197
95
99
118
103
138
100
132
130
172
172
119
137
118
138
121
101
148
103
114
122
3 675
77
108
110
92
116
85
95
134
53
57
76
82
75
58
111
67
109
130
56
116
97
117
79
59
85
61
72
101
2 478
78.57
56.25
63.58
59.35
73.42
80.19
81.90
68.02
55.79
57.58
64.41
79.61
54.35
58.00
84.09
51.54
63.37
75.58
47.06
84.67
82.20
84.78
65.29
58.42
57.43
59.22
63.16
82.79
67.42
11
20
15
15
21
22
17
17
10
9
13
18
14
11
14
13
18
24
19
20
9
14
12
10
15
16
10
13
420
10
16
12
12
19
21
16
14
8
7
11
17
11
9
13
10
15
22
16
19
8
13
10
8
12
14
8
12
363
90.91
80.00
80.00
80.00
90.48
95.45
94.12
82.35
80.00
77.78
84.62
94.44
78.57
81.82
92.86
76.92
83.33
91.67
84.21
95.00
88.89
92.86
83.33
80.00
80.00
87.50
80.00
92.31
86.43
利用优化的扩增体系，采用初步筛选的 94 对引
物组合对 21份西藏野生木瓜资源进行扩增，筛选出
扩增条带清晰、多态性丰富的引物组合 28 对，其扩
增结果见表 4。28对引物组合共检测出 420个位点，
363 个多态性位点数 ， 多态性位点百分率为
86.43%，平均每对引物检测 15 个位点，13 个多态性
位点；28 对引物组合共扩增出 3 675 条条带，2 478
条多态性条带，多态性条带百分率 67.42%。
3 讨 论
本试验中 Mg2+浓度对反应的影响最小， 与很多
报道相反[4，9]。 一方面，因素间可能存在互作，而正交
分析未能很好地说明， 对 Mg2+浓度主效应的评价存
在一定影响；另外，可能是使用的药品和仪器产地不
同所致；再者，正交设计中对扩增效果的评价带有一
定主观性， 评价标准不一也是造成结果不一致的原
因之一。 正交设计相对于单因素和完全设计减少了
A B
1017
处理组合，节省了劳力和时间，分析方法也更科学完
善稳定；但有上述的不足，使得正交分析也存在一定
局限性。为此，可将正交分析与单因素试验结合以取
得更准确的结果。
SRAP 标记技术已运用于多种果树的遗传多样
性研究，是否适合于木瓜属的相关研究却未见报道。
本试验在体系优化的基础上，筛选出了 28 对多态性
丰富的引物，并对 21份西藏野生木瓜资源进行了检
测，28 对引物组合共检测出 420 个位点， 多态性位
点百分率为 86.43%， 平均每对引物组合检测 15 个
位点。可见 SRAP标记运用于木瓜属植物中，检测位
点多，多态性丰富，适合于木瓜属植物遗传多样性研
究。我国是木瓜属植物的分布和栽培中心，种质资源
丰富，云、藏、川等地野生资源较多，运用 SRAP-PCR
标记对其遗传多样性进行研究不失为一种有效的方
法。
目前， 木瓜属植物主要按照用途和植物形态分
为 3 大类（观赏、药用、食用）5 个种，但生产中，广泛
采用杂交技术以及存在大量的变异类型， 再加上用
地名进行命名（如沂州木瓜、曹州木瓜、宣木瓜等），
传统分类方法可能无法区分大量的种类和品种，用
分子生物学技术如指纹图谱来鉴定木瓜的分类不失
为一种有效的手段。从试验结果可知，不同样品扩增
谱带差异较大，18号样品在 110 bp左右处有特异性
扩增谱带， 具体原因我们正在结合形态学及来源进
行探讨。 这表明 SRAP-PCR标记可用于木瓜植物的
品种鉴定、亲缘关系及指纹图谱构建研究。
4 结 论
综上所述，SRAP-PCR 标记能够用于木瓜属植
物遗传多样性的研究，优化的体系，即 25 μL 反应体
系中含 10×buffer 2.5 μL、 引物 0.4 μmol·L-1、Taq 酶
1.0 U、dNTPs 0.3 mmol·L-1、模板 DNA 70 ng、Mg2+ 2.0
mmol·L-1， 与筛选的多态性引物组合可为今后木瓜
属植物的 SRAP-PCR研究提供参考。
致谢:西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所李青、
斯年参与了部分样品的取样。
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果 树 学 报 27 卷1018