全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 12期，第 2761-2766页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.12, 2761-2766
研究报告
Research Report
番薯属甘薯与牵牛 EST-SSR标记开发及通用性分析
兰孟焦 吴问胜 * 黄水金 潘皓
江西省农业科学院,作物研究所,南昌, 330200
*通讯作者, lanmj100@163.com
摘 要 通过对番薯(Ipomoea)属的 12 812条甘薯和 28 422条牵牛 EST唯一序列进行检索分析，在 319条甘
薯 EST序列中发现了共 328个 EST-SSRs，平均每 20.41 kb出现 1个甘薯 SSR；在 936条牵牛 EST序列中发
现 962个 EST-SSRs，平均每 17.87 kb出现 1个 SSR；在检索到的甘薯和牵牛 EST-SSRs中，二核苷酸重复类
型的 SSR最多，分别占各自检索总数的 44.51%和 40.64%。利用 SSR-ESTs分别设计了 36对甘薯 EST-SSR
引物和 92对牵牛 EST-SSR引物，其中有 28对甘薯引物在 8个甘薯品种中有扩增产物，13对引物扩增产物
具有多态性，多态性引物占所设计甘薯引物的 36.1%；42对牵牛 EST-SSR引物在甘薯基因组中可以扩增出
清晰的条带，其中 19对有表现较好的多态性，占设计的牵牛 EST-SSR引物的 20.7%。结果表明，牵牛
EST-SSR标记在甘薯上具有通用性，可用于甘薯基因组多样性分析。
关键词 甘薯,牵牛, EST-SSR,通用性
Development of Microsatellite Makers from EST for Sweet Potato
(Ipomoea batatas) and Morning Glory (Ipomoea nil) and Analysis of Their
Transferability
Lan Mengjiao Wu Wengsheng * Huang Shuijin Pan Hao
Crop Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Science, Nanchang, 330200
* Corresponding author, lanmj100@163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.002761
Abstract Analysis of 12812 unique sweet potato (Ipomoea batatas) ESTs (expressed sequence tags) and 28422
non-redundant morning glory (Ipomoea nil ) ESTs, 319 sweet potato ESTs containing 328 SSRs (simple sequence
repeats) and 936 morning glory ESTs containing 962 SSRs were identified. The average density of sweet potato
SSRs was one SSR per 20.41 kb of EST sequence screened , while that of morning glory SSRs was 17.87 kb.
Among all the identified SSRs, dinucleotide repeats were dominant motifs, accounting for 44.51% and 40.64%
repectively. 36 pairs of sweet potato EST-SSR primers and 92 pairs of morning glory EST-SSR primers were
designed to sequence flanking SSRs from the selected ESTs. It was found that 28 (77.8%) pairs of sweet potato
EST-SSR primers brought detectable amplification bands in 8 sweetpotato varieties, 13 (36.1%) pairs of primers
displayed ploymorphisms. There were 42 (45.7%) pairs ofmorning gloryEST-SSR primerswhich could amplify clear
bands on the genomic DNA of sweetpotato, the ploymorphism primers were 19 (20.7%).These results suggested that
some of morning glory EST-SSR markers could be transferable across sweet potato and be used for genetic
diversity analysis in sweet potato.
Keywords Sweet potato (Ipomoea batatas), Morning glory (Ipomoea nil), EST-SSR, Transferability
基金项目：本研究由江西省农业科学院创新基金(2012CQN005)和现代农业产业技术体系建设专项(CARS-11-C-08)共同资助
通过表达序列标签(expressed sequence tag, EST)
建立 EST-SSR标记是一种相对便捷、高效的 SSR分
子标记的开发途径(Eujayl et al., 2002)。EST源于 DNA
编码区，其序列保守性程度较高，因而基于 EST序列
建立的 EST-SSR标记在相关种属间可能通用。Gupta
等(2003);宿俊吉等(2007); Mullan 等(2005); 程雪妮
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
等(2014)用普通小麦 EST-SSR分别对山羊草、冰草、
偃麦草、无芒雀麦不同种属植物间的通用性进行了
研究。忻雅等(2006)利用 15对白菜 EST-SSR引物对
10个油菜品种、11个玉米品种、11个高粱品种、11个
水稻品种和 10个茶树品种进行了扩增，结果表明
93.3%的 EST-SSR 引物可以在近缘种油菜得到扩
增，80%以上的 EST-SSR在远缘种玉米、高粱、水稻
和茶树中得到扩增。胥猛和李火根(2008)报道，鹅掌
楸 EST- SSR在中国马褂木和白玉兰中的具有较高通
用性，可应用于林木遗传图谱构建、重要性状基因 /
QTL定位与挖掘、比较基因组学等研究。另外，高羊
茅与水稻、小麦(Saha et al., 2004)，大豆与花生(He et al.,
2006)，棉花与向日葵(陈树林等, 2006)，黄瓜与甜瓜
(孔秋生, 2006)，木薯与麻疯树、橡胶树(文明富等,
2011)等种属间的 EST-SSR通用性均有报道，但未见
番薯属种间 EST-SSR标记通用性的研究文献。
本研究利用 NCBI数据库已登录的番薯属甘薯
和牵牛 EST序列进行 EST-SSR引物开发，并选用江
西省农业科学院收集的 8个甘薯品种为材料，对甘
薯 EST-SSR和牵牛 EST-SSR进行甘薯基因组的扩
增分析，对牵牛 EST-SSR分子标记在甘薯材料中的
通用性进行分析，发掘可用于甘薯基因组遗传分析
的分子标记。
1 结果与分析
1.1甘薯与牵牛EST-SSRs分析
本研究对甘薯 EST序列 2-6核苷酸重复基序类
型的 SSR位点进行检索分析，共检索到 328个 SSR
位点，分布于 319条 EST上，其中 310条 EST含有 1个
SSR，9条含有 1个以上 SSR。分析结果表明 2.49%的
EST含有 SSR，平均每 20.41 kb出现 1个 SSR。在检
索的 SSR中，二核苷酸重复类型 SSR最多，占检索
总数的 44.51%，其次为三核苷酸重复类型(20.73%)，
其余四、五、六核苷酸重复类型所占的比例依次为
10.37%、14.94%和 9.45% (表 1)。所有检索到的甘薯
EST-SSRs中，共观察到 69种不同的重复基序，其中
AG/CT、AT/AT、AAG/CTT、AAT/ATT和 AAAGCC/
CTTTGG为优势重复基序，5 种重复基序出现的总
频率为 59.76% (表 2)，剩余的 64种重复基序出现频
率较低，均不超过 3.00%。
对牵牛 EST序列进行检索，在 936条牵牛唯一
EST序列上发现了 962个 SSRs，平均每 17.87 kb出
现 1个 SSR，出现频率为 3.38%。在牵牛 EST-SSRs
中，二、三、四、五、六核苷酸重复类型的 SSR分别占
检索总数的 40.64%、28.59%、8.84%、11.75%和 10.19%
(表 2）。在检索的牵牛 SSR中，共观测到 128个重复基
序类型，其中优势重复基序(出现频率>3%)依次为 AG/
CT (345个,占 35.86%)、AAG/CTT (152个,占 15.80%)
和AT/AT (39个，占 4.05%) (表 3)。
1.2 EST-SSR引物筛选分析
1.2.1甘薯 EST-SSR引物多态性分析
选用 36对甘薯 EST-SSR引物对 8个甘薯材料
的 DNA进行扩增、筛选，结果显示有 28对引物可以
扩增出清晰条带(图 1)，占甘薯 EST-SSR引物的 77.8%，
表 1 SSR-ESTs序列中不同重复核苷酸数的数量及百分比
Table 1 Number and frequency of repeat types in SSR-ESTs
重复类型
Type of repeat
二核苷酸
Dinucleotide
三核苷酸
Trinucleotide
四核苷酸
Tetranucleotide
五核苷酸
Pentanucleotide
六核苷酸
Hexanucleotide
甘薯
Sweet potato
牵牛
Morning glory
SSR数目
Number of SSRs
146
68
34
49
31
占全部 SSR比例(%)
Proportion in all SSRs (%)
44.51
20.73
10.37
14.94
9.45
SSR数目
Number of SSRs
391
275
85
113
98
占全部 SSR比例(%)
Proportion in all SSRs (%)
40.64
28.59
8.84
11.75
10.19
2762
SSR数目
Number of SSRs
345
152
39
SSR数目
Number of SSRs
96
45
24
21
10
表 3试验材料
Table 3 Experimental materials in this research
名称
Name
徐薯 22
Xushu 22
商薯 19
Shangshu 19
赣薯 1号
Ganshu No.1
泉薯 9号
Quanshu No.9
宁紫薯 1号
Ningzishu No.1
福菜薯 18号
Fucaishu No.18
G2-1
G24-1
类型
Typle
淀粉型
Stcrch-use
淀粉型
Stcrch-use
食用紫薯
Edible purple-fleshed type
兼用型
Dual-purpose type
食用紫薯
Edible purple-fleshed type
叶菜型
Vegetable-use
食用型
Edible-type
高胡萝卜素型
High β-carotene content type
来源
Sources
江苏徐州甘薯研究中心
Jiangsu Xuzhou sweetpotato research center
商丘市农林科学研究所
Shangqiu institute of agriculture and forestry science
江西省农业科学院作物研究所
Crop research institute, Jiangxi academy of agricultural science
福建省泉州市农业科学研究所
Quanzhou institute of agricultural science
江苏省农业科学院粮食与作物研究所
Institute of food crops, Jiangsu academy of agricultural science
福建省农业科学院作物研究所
Crop research institute , Fujian academy of agricultural science
江西省农业科学院作物研究所
Crop research i nstitute , Jiangxi academy of agricultural science
江西省农业科学院作物研究所
Crop research institute , Jiangxi academy of agricultural Science
其中 13对引物在 8个甘薯基因组中的扩增产物具
有多态性，占其引物总数的 36.1%。
1.2.2牵牛 EST-SSR引物在甘薯上的通用性
为检测牵牛 EST-SSR 引物在甘薯基因组中的
通用性，将设计的 92对牵牛 EST-SSR引物对 8个
甘薯材料的基因组进行扩增，结果显示 42对引物在
甘薯上可以扩增出清晰的条带(图 1)，占所设计的牵
牛 EST-SSR引物的 45.7%，其中 19对有表现较好的
多态性，占设计的牵牛 EST-SSR引物的 20.7%。表明
牵牛 EST-SSR 可用于甘薯基因组的多样性分析。
分析这 19对具有多态性的牵牛 EST-SSR引物对应
的 SSR位点，结果显示，有 15个二核苷酸重复基序
类型的 SSRs，4个三核苷酸重复基序类型，未发现
五、六核苷酸重复类型。
2讨论
2.1 EST-SSRs的分布特征
EST-SSRs的出现频率与物种基因组大小、EST
图 1甘薯 EST-SSR (左)和牵牛 EST-SSR (右)引物在甘薯上的
扩增
Figure 1 The amplification products of sweet potato EST-SSR
(left) and morning glory EST-SSR (right) primers
表 2 SSR-ESTs序列中优势重复基序类型的数量及频率
Table 2 Number and frequency of superior SSR motif in SSR-ESTs
甘薯
Sweet potato
牵牛
Morning glory
优势重复单元
Superior SSR motif
AG/CT
AT/AT
AAG/CTT
AAT/ATT
AAAGCC/CTTTGG
频率(%)
Frequency (%)
29.27
13.72
7.32
6.40
3.05
优势重复单元
Superior SSR motif
AG/CT
AAG/CTT
AT/AT
频率(%)
Frequency (%)
35.86
15.80
4.05
番薯属甘薯与牵牛 EST-SSR标记开发及通用性分析
Microsatellite Makers from EST for Sweet Potato and Morning Glory and Their Transferability 2763
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
序列来源、EST序列数量以及是否预处理密切相关。
即使是同一物种、同一来源、同一数量的 EST序列，
研究者采用不同的分析方法、SSR 搜索标准 (SSR
重复类型、长度等），得到的结果也不尽一致。研究表
明(Weber, 1990; Temnykh et al., 2000)，当 SSR 引物
的长度大于 20 bp时，所获得的 SSR引物在不同品
种或物种间扩增时可显示较高的多态性；当长度低
于 20 bp时,则引物多态性潜能降低。本研究对番薯
属中甘薯和牵牛 EST序列数据库进行 SSR搜索，要
求候选 SSRs长度不低于 20 bp，共在 319条甘薯 EST
序列中发现了共 328个 EST-SSRs，平均每 20.41 kb
出现 1个甘薯 SSR；在 936条牵牛 EST序列中发现
962 个 EST-SSRs，筛选的牵牛 EST 序列平均每
17.87 kb出现 1个 SSR。
在检索到的甘薯和牵牛 EST-SSRs中，二核苷酸
重复类型最多，其次为三核苷酸重复类型，其他类型
较少，这一结果与文献报道的烟草(赵世浩, 2007)、木
薯(彭丁文等, 2008)、小麦(海涛等, 2010)、蓖麻(Pranavi
et al., 2011)等一致。
Holton等(2002)对禾本科作物的研究发现，在二
核苷酸重复 EST-SSRs中，AG/CT 基序出现频率最
高，本研究中甘薯和牵牛的二核苷酸基序分布与此
类似，AG/CT的出现频率分别为 29.27%和 35.86%。
三核苷酸中出现频率最高的重复基序为 AAG/CCT，
与前人报道的鹅掌楸(李火根, 2008)结果类似。
2.2 EST-SSR引物的多态性和通用性
近年来，利用植物 EST序列开发 EST-SSR引
物，并在近缘或远缘物种中进行通用性分析已成为
一种较为常见的引物开发手段。Holton等(2002)报道
大麦 EST-SSR 对小麦通用性 55%，Malay 和 Rouf
(2005)的研究结果显示高羊茅 EST-SSR标记对其他
草类通用性为 57%。本研究中，77.8%的甘薯 EST-SSR
引物在甘薯上可扩增，36.1%的引物扩增出的产物具
有多态性；而设计的 92对牵牛 EST-SSR引物中，42
对引物可在甘薯基因组中扩增出清晰条带，引物通
用率为 45.7%，20.7%的引物能扩增出多态性。研究
结果表明，牵牛 EST-SSR标记在甘薯上也具有较好
的通用性，这对甘薯与牵牛及其他物种间的比较基
因组研究具有重要意义。
3材料与方法
3.1植物材料与模板 DNA提取
试验材料为江西省农业科学院作物研究所栽种
的 8个甘薯品种或品系，材料具体见表 3。模板 DNA
提取选自各材料新鲜嫩叶片，采用改良的 CTAB法
(Stewart and Via, 1993)。
3.2 SSR-ESTs序列搜索
从序列数据库 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbest/
下载甘薯和牵牛的 ESTs，共获得了 23 406条甘薯
EST序列和 62 282条牵牛 EST序列。将序列下载后
利用 CAP3软件拼接组装得到 12 812条甘薯 EST序
列和 28 422条牵牛 EST序列(包括 singletons和 con-
tigs)，然后利用 misa软件对 12 812条甘薯 EST和
28 422条牵牛 EST序列进行 SSR位点搜索，识别
标准为二、三、四、五、六核苷酸类型基序的最小重
复次数为 10、7、5、4和 4次。在甘薯上搜索到含有
SSR位点的 EST唯一序列 319条共 328个 EST-SSRs；
在牵牛上搜索 962个 EST-SSRs，分布在 936条 EST
序列中。
3.3 EST-SSR引物设计与合成
将所搜索到的含有 SSR 位点的 ESTs 进行分
析，选取了 42 条甘薯 SSR-ESTs 和 116 条牵牛
SSR-ESTs共 174个 EST-SSRs进行引物设计，设计
引物软件为 Primmer5.0。设计主要参数：引物长度在
18~24 bp之间，最适长度 20 bp；Tm值 50~62℃，最适
温度为 55℃，且上、下游引物之间的 Tm值相差应不
大于 3℃；扩增产物的长度在 100~300 bp之间；得分
90以上，避免出现引物二级结构。最终成功设计了
36 对甘薯 EST-SSR 引物和 92 对牵牛 EST-SSR 引
物，由上海申工生物技术公司合成。
3.4 通用性检测及多态性评价
PCR反应体系为 10μL，其中含有 10×PCRBuffer
1.0 μL、dNTPs 0.3 μL (0.3 mmol/L)、SSR引物 0.5 μL
(0.5μmol/L)、TaqDNA聚合酶 0.1μL(5U/μL-1)、DNA模
板 30 ng。PCR反应程序参照孙清明等(2011)方法。
PCR扩增产物在 8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳下进行
分离，银染显影，胶片在观片灯下读带，扫描。
作者贡献
兰孟焦是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，完成数据分析，论文初稿的写作；黄水金、潘皓参
与实验设计和试验结果分析；吴问胜指导实验设计、
数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意
最终的文本。
2764
致谢
本研究由江西省农业科学院创新基金(2012CQN-
005)和现代农业产业技术体系建设专项(CARS-11-
C-08)共同资助。
参考文献
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