全 文 ：因较复杂 ,有待进一步研究。
参考文献:
[ 1] 　沈熙环.林木育种学[ M] .北京:中国林业出版社 , 1990 , 41～ 45.
[ 2] 　谢耀坚.桉树组织培养研究进展[ J] .世界林业研究.2000, 13(6):14～ 19.
[ 3] 　J.J.Le roux , J.van staden.谢莉萍译.桉树的微繁殖和组织培养[ J] .广西林业科学 ,1994 , 23(1):.
[ 4] 　王米力 ,石大兴等.尾叶桉胚状体植株诱导与增殖研究[ J] .四川林业科技.1996 ,(2):10～ 13.
[ 5] 　Bonga J M , Du rzan D J.阙国宁 ,郭初达等译.林木组织培养[M ] .北京:中国林业出版社 , 1988 , 129～ 156 , 288～ 298.
[ 6] 　S ilva.LL.da.et.Influence of the association between dif ferent macronutrient and vitamin formulat ions on the in vi tro propagation of Euca-
lyptus grand is form epicormic buds , Revista-Ceres , 1994 , 41:528～ 536.
第 24 卷　第 2 期 四 川 林 业 科 技　 Vo1.24 , 　No.2
2003 年 6 月 Journal of Sichuan Forestry Science and Technology　 June , 　2003
　
　
　
　
　　收稿日期:2002-04-26
　　基金项目:为国家林业局行业重点项目“三尖杉属植物濒危原因及繁育技术研究”部分内容。
　　作者简介:陈少瑜(1968-),女 ,副研究员 ,主要从事林木遗传和生理方面的研究。
三尖杉属植物的同工酶分析
陈少瑜 ,司马永康 ,方　波
(云南省林业科学院 ,云南昆明　650204)
摘　要:采用垂直板型不连续聚丙烯酰氨凝胶电泳和水平淀粉凝胶电泳技术对三尖杉属植物粗榧 、高山三尖
杉 、篦子三尖杉进行了同工酶实验。结果获得天冬氨酸转酶(AAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、葡萄糖 6-磷酸脱
氢酶(G6PD)、酯酶(EST)和苹果酸脱氢酶(MDH)等 5 种同工酶的酶谱。酶谱的相似性系数及聚类分析结果
表明 ,粗榧和高山三尖杉酶谱具有较高的相似性 , 达 81.5%, 而二者与篦子三尖杉的相似性系数较低 , 仅为
59.3%和 50.0%。
关键词:凝胶电泳技术;酶谱;三尖杉属植物;相似性系数;聚类分析
中图分类号:S718.43　　　文献标识码:A
文章编号:1003-5508(2003)02-0041-04
Analysis of the Isozyme of Cephalotaxus Plants
CHEN Shao-yu　SIMA Yong-kang　FANG Bo
(Yunnan Academy of Forest ry Science , Kunming , 650204 ,China)
Abstract:The experiments on isozymes of Cephalotaxus plants , C.sinensis , C .var.alpine and
C .ol iveri were done by gel electropho resis techniques.Five isozyme pat terns w ere obtained ,
namely Aspartate aminot ransferase(AAT), Glutamate-ammonia ligase(GDH), Glucose-6-phos-
phate dehydrogenase(G6PD),Esterase(EST)and Malate dehydrogenase(MDH).Analysis of com-
parability coef ficient and clustering of the pat terns showed that the comparability coef ficient of C .
sinensis and C .var.alpine was higher(81.5%), those of the tw o species w ith C .oliveri were
lower (only 59.3% and 50.0% respectively).
Key words:Gel elect rophoresis , Isozyme pat tern , Cephalotaxus plants ,Comparability coefficient ,
Clustering analy sis
三尖杉属(Cephalotaxus)植物有 9种 。我国产 7种 3 变种 ,分布于秦岭至山东鲁山以南各省区。
云南有 6种 2变种 ,主要分布于滇东南 、滇南 、滇西和滇西北地区[ 1] 。其中 ,云南有分布的贡山三尖杉
(C.lanceolata)、海南粗榧(C .manni i)和篦子三尖杉(C.oliveri)为我国二级珍稀濒危保护植物 。由于
三尖杉属植物材质优良 、植物体含多种具药用价值的植物碱但自然资源却很有限而受到人们的广泛关
注和研究。植物体内调节各不同代谢的酶类是由遗传决定的 ,同工酶就是控制这些酶的等位基因的变
异产物[ 2] 。自 70年代 ,同工酶便应用于植物的系统和进化研究中 ,用同工酶资料可以进行属中不同种
间遗传距离的计算和分支分析 ,获得类群间亲缘关系的分支图 ,从而对属下类群划分和种间系统发生关
系的评估提供重要的证据[ 3 ,4 ,5] 。为此 ,对三尖杉属粗榧(C .sinensis)、高山三尖杉(C .var.alpina)、篦
子三尖杉(C .oliveri)3个类群进行了天冬氨酸转氨酶(AAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、葡萄糖 6-磷酸脱
氢酶(G6PD)、酯酶(EST)和苹果酸脱氢酶(MDH)等 5种同工酶的分析和研究 ,以期为确定其系统进化
关系及进一步的遗传多样性和濒危原因的研究提供分子水平的资料 。
1　材料和方法
1.1　材料
以单株种子的胚乳为同工酶实验的材料 。种子分别采自 4个天然种群 。采集的地点和种群的个体
数分别为:粗榧(1个种群),采自楚雄紫溪山 , 32单株;高山尖三杉(2个种群),采自大理耳源县和昆明
禄劝县 ,分别有 35单株和 18单株;篦子三尖杉采自玉溪的新平县 ,36单株。
1.2　同工酶实验
(1)酶液制备　每单株取 6粒～ 8粒种子的胚乳(划取一小部分即可)分别置预冷的研钵中 ,每样加
入适量复杂磷酸提取缓冲液[ 6] ,冰浴中充分研磨后 ,用滤纸芯子吸取研磨液上样。
(2)电泳　采用两种电泳方法。一种是垂直板型不连续聚丙烯酰氨凝胶电泳(AAT ,GDH , EST),
浓缩胶和分离胶的浓度分别为 3%和 7.5%,电极缓冲液为 Tris-甘氨酸(pH=8.3),冰箱中电泳 ,浓缩胶
部分电流 1 mA/样 ,分离胶部分2 mA/样 。另一种是水平淀粉凝胶电泳(G6PD ,MDH),胶浓度为 12%,
电泳及凝胶缓冲液分别为 0.4 mol/L 柠檬酸三钠(pH=7.0)和 0.02 mol/L 盐酸组氨酸(pH =7.0),冰
箱中 50 mA稳流电泳 5小时左右 ,待溴酚蓝移至电泳槽顶端 ,停止电泳 ,切胶染色。
(3)显色　染色配方参照文献[ 6] ,酶带显示清晰后 ,记录结果 ,凝胶图象分析系统扫描 ,然后制成永
久性干胶片。
1.3　酶谱分析
(1)迁移率的计算　Rf=凝胶中各酶带的迁移距离/凝胶中指示剂的迁移距离 。
(2)酶谱的相似性系数和不相似性系数计算　相似性系数值 c=2w/(a +b),其中 a 为种 A酶谱
的酶带数 ,b 为种 B酶谱的酶带数 , w 为 A 、B两种的相同酶带数。不相似性系数值 d =1-c。
(3)聚类分析　采用未加权配群法(unw eighted pair-g roup method using arithmet ic average),进行繁
类分析 ,根据结果绘出树系图 。
2　结果与分析
2.1　3种三尖杉植物 5种同工酶的酶谱带及迁移率
对3种三尖杉植物的 5种同工酶酶谱进行分析 , 5个酶系统共出现 22 条酶带 ,其中 AAT 有 4条 ,
42　　 四　川　林　业　科　技 24 卷
GDH 出现 4条 ,G6PD出现 2条 ,EST 和 MDH 的酶谱较复杂 ,分别出现 6条酶带 。3个种只有在 G6PD
酶上显示了完全相同的 2条酶带 ,其它 4种酶既表现出相互间的共有酶带 ,又各自具有其特有酶带 。
由上述公式计算出各酶带的 Rf值 ,3种植物各酶带的分布及迁移率列于表 1。由表 1可见 ,篦子三
尖杉的AAT 出现 4条酶带 ,而另两个种则分别只有 2条 ,且与篦子三尖杉的第 3 ,4条酶带为共有酶带;
粗榧和高山三尖杉的 GDH皆有 3条带 ,其中第 2 、3条带为共有带 ,篦子三尖杉只有 1条与粗榧的第 1
条带的共有带;3个种的G6PD表现出 2条相同的共有酶带;3个种的 EST 都有 3条酶带 ,但只有 1条
共有带 ,粗榧和高山三尖杉间有 2条共有带;篦子三尖杉和高山三尖杉有 4条 MDH 酶带 ,粗榧只有 3
条酶带 ,3个种有 2条共有带 ,粗榧和高山三尖杉有 3条共有带 。
表 1 3 种三尖杉植物 5 种同工酶谱带及迁移率
酶系统 序号 树种 条带数
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 粗榧 - 0.27 0.36 - - -
AAT 2 高山三尖杉 - 0.28 0.37 - - -
3 篦子三尖杉 0.16 0.25 0.34 0.42 - -
1 粗榧 0.16 0.24 0.45 - - -
GDH 2 高山三尖杉 - 0.24 0.43 0.53 - -
3 篦子三尖杉 0.17 - - - - -
1 粗榧 0.23 0.41 - - - -
G6PD 2 高山三尖杉 0.24 0.41 - - - -
3 篦子三尖杉 0.21 0.42 - - - -
1 粗榧 - 0.55 0.62 - 0.75 -
EST 2 高山三尖杉 - - 0.65 - 0.78 0.84
3 篦子三尖杉 0.43 - 0.63 0.69 - -
1 粗榧 0.07 - 0.24 0.35 - -
MDH 2 高山三尖杉 0.06 - 0.27 0.35 - 0.62
3 篦子三尖杉 0.07 0.13 - 0.34 0.52 -
2.2　5种同工酶酶谱的相似值和不相似值
由上述公式计算出的 3种三尖杉植物酶谱的相似性系数和不相似性系数列于表 2。计算结果表
明 ,粗榧与高山三尖杉 5种同工酶酶谱的相似性较高 ,相似性系数的值为 81.5%,而篦子三尖杉和这两
种之间则存在较大差异 ,相似性系数值仅为 59.3%和 50.0%。采用未加权配群法对酶谱的不同相似性
系数进行聚类分析 ,进而绘出树系图(见图 1),由图可见 ,粗榧和高山三尖杉聚为一类 ,而篦子三尖杉则
划为另一类。同工酶谱的相似程度及其聚类分析的结果为三尖杉属这 3个种的分类地位和系统发育提
供了分子水平的参考和依据。
图 1　三尖杉属三个种的聚类图
　表 2　3 种三尖杉植物同工酶谱的相似值和不相似值
树种 粗榧 高山三尖杉 篦子三尖杉
粗榧 0 0.185 0.407
高山三尖杉 0.815 0 0.500
篦子三尖杉 0.593 0.500 0
＊左下部分为相似值 ,右上部分为不相似值
3　结论和讨论
有关将三尖杉属分为三尖杉组和篦子三尖杉组的建议已有许多形态学 、胚胎学以及分子生物学等
方面的研究资料和依据[ 7～ 10] 。本项研究通过对三尖杉属 3种植物 5种同工酶的酶谱及聚类分析 ,结果
表明粗榧与高山三尖杉酶谱相似性较高 ,可聚为一类 ,而篦子三尖杉的酶谱则与这两个种的酶谱差异较
大 ,归为另一类 ,赞同将篦子三尖杉在三尖杉属中另立为一组的观点 。
432 期 陈少瑜 , 等:三尖杉属植物的同工酶分析 　　
参考文献:
[ 1] 　中国科学院昆明植物研究所编著.云南植物志(第四卷)[ M] .北京:科学出版社 , 1986.
[ 2] 　S tuessy T F.T he systemat ic evolut ion of comparative data.Plant taxonomy.New York:Columbia University.1990.
[ 3] 　Brochmann , C., P.S.Soltis and D.E.S olt is.Recurrent formation and polyphyly of Nordic polyploids in Draba.Amer.J.Bot.1992 , 79(6):
673～ 688.
[ 4] 　Hauf ler , C.H.Enzym e variabilit y and modes of evolution in Bommer ia.Syst.Bot.1985a , 10:92～ 104.
[ 5] 　Solt is , P.S.and D.E.S olt is.Genetic variat ion w ithin and among populations of ferns.Amer.Fern J.1990 ,80(4):161～ 172.
[ 6] 　王仲仁.植物等位酶分析[ M] .北京:科学出版社 , 1996.
[ 7] 　胡玉熹.三尖杉属植物叶片结构的比较观察[ J] .植物分类学报.1984 , 22(4):289～ 296.
[ 8] 　傅立国.三尖杉属的研究[ J] .植物分类学报.1984 , 22(4):277～ 288.
[ 9] 　王　艇 ,苏应娟 ,等.部分裸子植物的五种同工酶分析[ J] .中山大学学报(自然科学版).1996 , 35(6):122～ 124.
[ 10] 　王　艇 ,苏应娟 ,等.三尖杉科植物 RAPD分析及其系统学意义[ J] .武汉植物学研究.1999 , 17(3):227～ 230.
第 24 卷　第 2 期 四 川 林 业 科 技　 Vo1.24 , 　No.2
2003 年 6 月 Journal of Sichuan Forestry Science and Technology　 June , 　2003
　
　
　
　
　　收稿日期:2002-02-19
　　作者简介:张祖荣(1966-),男 ,学士 ,现在渝西学院生物系从事教学工作。
银杏组培繁殖及黄酮糖苷的产生
张祖荣
(渝西学院生物系 ,重庆永川　402168)
摘　要:以银杏(Ginkgo biloba)腋芽为外植体进行组织培养 ,筛选出了适宜银杏芽萌发 、增殖和生根的培养基
配方和培养条件 ,其根　芽诱导率都在 89%以上 ,增殖倍数达 8.1。通过银杏愈伤组织的诱导 ,建立了悬浮细
胞培养系 ,在液体继代培养基中添加 5 mll-1蜂蜜可明显促进细胞分裂 、生长及黄酮糖苷的累积 ,提高细胞产
量 1 倍以上。经过 10 次液体继代培养 , 悬浮细胞中黄酮糖苷含量达到成熟叶片含量的 92.4%。
关键词:银杏;组培繁殖;悬浮细胞;黄酮糖苷
中图分类号:S723.132　　　文献标识码:B
文章编号:1003-5508(2003)02-0044-03
银杏(Ginkgo biloba)是我国特产的古老孑遗植物 ,不仅叶片富含黄酮类和银杏类酯等药用成分 ,而
且果实也极具营养保健功能 ,具有抗衰老 、提高免疫机能 、防治心脑血管疾病等作用[ 1] ,同时 ,银杏提取
物也是食品 、化工产品广为采用的天然添加剂。目前 ,银杏种植业是一项经济 、生态效益双高的产
业[ 2] 。特别是近几年通过品种选育 ,一些性状优良的银杏品种正大面积推广种植 ,单靠嫁接 、扦插繁殖
苗木的效率和质量已不适应当前新品种的变化格局。同时 ,在叶片深加工产业中 ,存在叶片生长周期
长 ,有效成分含量低 ,资源不足等问题。自 20世纪 90年代以来 ,在组织培养快速繁殖及产生次生产物
的研究方面取得了较大的进步 ,利用植物细胞大规模培养直接产生天然产物成为现代生物技术产业化
研究的热点 ,也是植物开发和保护的一种新形式。姜玲等(1998)对我国北方适栽银杏品种进行悬浮细
胞继代培养后 ,其黄酮糖苷已接近叶片中的含量[ 3] 。针对南方适栽品种特性 ,我们于 2000年 ～ 2001年
进行了银杏腋芽组培繁殖和悬浮细胞培养试验 ,同时探索了悬浮细胞培养与黄酮糖苷累积的关系 。