全 文 ：第 27卷 第 10期
2 0 1 0年 1 0月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity
Vol.27 　No.10
Oct.2010 p.767
收稿日期:2009-12-28
作者简介:吴书昱(1985-), 女(汉族), 吉林延吉人 , 硕士研究生 , E-mailwushuyu 1985@163.com;王淑君(1972-),
女(汉族),辽宁抚顺人 , 副教授 , 博士 , 主要从事药物新剂型和生物药剂学研究 , Tel.024-23986360, E-mailxiao-
hu6408 cn@sina.com。
文章编号:1006-2858(2010)10-0829-05
杨梅叶总黄酮对培养大鼠皮质神经元
缺糖缺氧损伤的影响
吴书昱1 , 王淑君 2 , 刘　俏1 , 张颖慧 2 , 鲁　爽3
(1.沈阳药科大学 中药学院 , 辽宁 沈阳 110016;2.沈阳药科大学 药学院 ,辽宁 沈阳 110016;
3.国家食品药品监督管理局 行政受理服务中心 ,北京 100810)
摘要:目的 探讨杨梅叶总黄酮对原代培养大鼠皮质神经元缺糖缺氧损伤的影响。方法 采用原代
培养的大鼠皮质神经元 , 随机分为正常组 、神经元缺糖缺氧(oxygen-glucosedeprivation, OGD)模型
组和杨梅叶总黄酮高 、中 、低质量浓度(100、10、1 mg·L-1)给药组 , MTT法观察神经元的存活率 ,比
色法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase, LDH)释放量 、过氧化氢(hydrogenperox-
ide, H2O2)含量 , 并检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)活性及丙二醛(malondi-
aldehyde, MDA)含量。结果 杨梅叶总黄酮可显著提高受损伤神经元的存活率和皮质神经元细胞
内 SOD活性 ,降低神经元细胞 LDH的释放 、细胞内 MDA含量和细胞培养液中 H2O2含量。结论
杨梅叶总黄酮对缺糖缺氧所致皮质神经元损伤具有明显的保护作用。
关键词:皮质神经元;缺糖缺氧;杨梅叶;总黄酮
中图分类号:R96　　　文献标志码:A
　　缺血性脑血管疾病是临床上的常见病 、多发
病 ,严重危害人类健康。在缺血性脑血管疾病的
治疗方面 ,积极寻找有效的脑神经保护药物具有
重要的意义 。原代培养神经元 (oxygen-glucose
deprivation, OGD)模型已被广泛用于研究离体水
平脑缺血损伤 ,这一模型能够模拟整体水平脑缺
血损伤 ,是离体水平评价药物神经保护作用的有
效手段 [ 1-4] 。目前许多的抗氧化剂在不同的脑损
伤模型中和不同的剂量下都表现出了神经保护作
用 ,并且很多抗氧化剂正在被研究作为可能的临
床治疗因素。有关文献报道 ,杨梅(Myricarubra
(Lour.)Sieb.etZucc.)叶含有多种黄酮类化合
物 [ 5] ,并具有良好的抗氧化作用 [ 5 -6] 。然而 ,对于
杨梅叶总黄酮的神经元细胞保护作用尚无报道。
本试验的目的是从细胞及分子水平上 ,通过体外
培养大鼠皮质神经元建立 OGD损伤模型 ,观察神
经元的存活率 ,检测细胞培养液中 LDH释放量 、
H2O2含量 、细胞内 SOD活性及 MDA含量 ,探讨
杨梅叶总黄酮对神经元缺糖缺氧的保护作用及其
作用机制。
1　仪器与材料
XSB-1A倒置生物显微镜(广西梧州市光学
仪器厂), UV-2000紫外分光光度计 (美国 Unico
公司), BioTekSynergyHT酶标仪(美国 BioTek公
司)。
IMEM高糖培养基 、胰蛋白酶(trypsin)干粉
(美国 Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物
工程材料有限公司), MTT、阿糖胞苷(美国 Sigma
公司),超氧化物歧化酶试剂盒 、丙二醛试剂盒 、
过氧化氢试剂盒 、乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成
生物工程研究所),其余试剂 (分析纯 ,山东禹王
化工公司)。
杨梅叶 ,购自浙江余姚 ,经沈阳药科大学中药
学院孙启时教授鉴定为杨梅科植物杨梅(Myrica
rubra(Lour.)Sieb.etZucc.)的叶 。
新生 24 h内 Wistar大鼠 ,雌雄兼用 ,由沈阳
药科大学实验动物中心提供 , 许可证号 SCXK-
(军)2007-004。
2　方法
DOI :10.14066/j.cnki .cn21-1349/r.2010.10.002
2.1　杨梅叶总黄酮的制备
称取干燥至质量恒定的杨梅叶粗粉适量 ,加
入 10倍生药量的体积分数为 70%乙醇溶液回流
提取 2次 ,每次 2 h,合并滤液 ,干燥后得粗提物浸
膏 。将粗提物浸膏加适量水混悬 ,加入与水同体
积的石油醚萃取 5次除叶绿素 ,再加入与水同体
积的乙酸乙酯萃取 4次 ,将乙酸乙酯层干燥后得
萃取物 ,加水混悬备用。称取D-101大孔树脂适
量 ,湿法装柱 。将萃取物混悬液加入色谱柱 ,用水
洗脱 4个柱体积 ,再用体积分数为 50%乙醇洗脱
5个柱体积 ,收集体积分数为 50%乙醇的洗脱液 ,
干燥后得杨梅叶总黄酮。
称取杨梅叶总黄酮适量加甲醇溶解 ,加入质
量分数为 5%三氯化铝溶液作为显色剂 ,在波长
420 nm处测定溶液吸光度 ,带入标准曲线计算其
总黄酮质量含量为 66%。
称取上述杨梅叶总黄酮适量 ,加入二甲基亚
砜溶解 , 配制成总黄酮质量浓度分别为 1、 10、
100 mg·L-1的供试溶液。
2.2　大鼠大脑皮质神经元的培养
出生 24 h内 Wistar大鼠 ,雌雄兼用 。无菌条
件下分离双侧大脑皮质 ,剥离脑膜 ,用质量分数为
0.125%的 胰 蛋 白 酶 37 ℃ 消 化 30 min,
1 000 r·min-1离心 5 min,弃上清液 ,用含质量分
数为 10%胎牛血清的 IMEM培养液终止消化。
轻轻吹打分散成细胞悬液 ,细胞悬液经 74 μm金
属细胞筛过滤 ,调整细胞密度为 1 ×106 mL-1 ,接
种于 96孔培养板 ,每孔 100 μL,置于 37 ℃、体积
分数为 5%的 CO2 、饱和湿度的培养箱内培养。
以后每隔 1 d换 1次新鲜的含质量分数为 10%胎
牛血清的 IMEM培养液 ,细胞培养至 3 d加入含
有质量分数为 1‰阿糖胞苷的 IMEM培养液 ,以
抑制非神经细胞生长 ,再隔 24 h后换含有质量分
数为 10%胎牛血清的 IMEM培养液。此后每隔
1 d换 1次新鲜的含质量分数为 10%胎牛血清的
IMEM培养液 ,培养至 8 ～ 10 d进行实验 [ 7] 。体外
培养的神经元 ,经神经元特异性烯醇化酶鉴定为
阳性。
2.3　OGD模型制备与分组
将培养的神经元随机分为正常组 、OGD模型
组和高 、中 、低 3个质量浓度给药组。正常组换成
含有葡萄糖的 Earle′s液 ,每孔 100 μL,置于体积
分数 5%CO2培养箱继续培养。将模型组与给药
组细胞用不含葡萄糖的 Earle′s液清洗 3遍 ,然后
换成不含葡萄糖的 Earle′s液 ,每孔 100 μL。并于
给各药组分别加入高 、中 、低 3个剂量的杨梅叶总
黄酮溶液 ,每孔 10 μL。将模型组与各给药组培
养板置于缺氧罐内 ,通入体积分数 95%N2 +5%
CO2混合气体 20 min,再置于体积分数为 5%CO2
培养箱中继续培养 4 h。之后将各组培养液更换
为含质量分数为 10%胎牛血清的 IMEM培养液 ,
置于 37 ℃、体积分数 5%CO2培养箱继续培养 ,
模拟再灌注 24 h,并在此过程中保持给药组药物
质量浓度不变[ 8] 。
2.4　观察指标
2.4.1　神经元存活率的测定
采用 MTT法测定。各组分别取 96孔培养板
的 6个孔 ,缺糖缺氧 4 h再灌注 24 h后每孔内加
入 MTT10 μL(终质量浓度为 5 g·L-1)。置于
37 ℃、体积分数 5%CO2培养箱继续培养 4 h,然
后吸去各孔内的液体 ,每孔内再加入二甲基亚砜
100 μL,轻轻震荡使结晶充分溶解后 ,用酶标仪在
492 nm处测定各孔的 OD值 ,以代表神经元的活
性 。神经元存活率以正常组 OD值的均数为
100%,按下式计算:存活率 =各孔 OD值 /正常组
OD值均数 ×100%。
2.4.2　LDH释放的测定
各组细胞经缺糖缺氧 4 h再灌注 24 h后 ,取
细胞上清液 20 μL,按照 LDH测定试剂盒说明 ,
用紫外分光光度计于波长 440 nm处测定大鼠皮
质神经元培养液中 LDH的释放量。
2.4.3　H2O2含量的测定
各组细胞经缺糖缺氧 4 h再灌注 24 h后 ,取
细胞上清液 20 μL,按照 H2O2测定试剂盒说明 ,
用紫外分光光度计于波长 405 nm处测定皮质神
经元内 H2O2的含量。
2.4.4　MDA含量的测定
各组细胞经缺糖缺氧 4 h再灌注 24 h后 ,吸
去培养液 ,以冷 D-Hank′s液洗涤细胞 2次 ,用细
胞刮板刮下细胞 ,冷生理盐水收集 。在冰浴中用
超声细胞破碎仪破碎细胞(20 kHz,震动 2 s,间歇
3 s),显微镜下观察无细胞后 ,取 200 μL细胞破
碎液 ,按照 MDA测定试剂盒说明 ,用紫外分光光
度计于波长 532 nm处测定大鼠皮质神经元内
MDA的含量。
2.4.5　SOD活性的测定
各组细胞经缺糖缺氧 4 h再灌注 24 h后 ,吸
去培养液 ,以冷 D-Hank′s液洗涤细胞 2次 ,用细
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胞刮板刮下细胞 ,冷生理盐水收集 。在冰浴中用
超声细胞破碎仪破碎细胞(20 kHz,震动 2 s,间歇
3 s),显微镜下观察无细胞后 ,取 200 μL细胞破
碎液 ,按照 SOD测定试剂盒说明 ,用紫外分光光
度计于波长 550 nm处测定大鼠皮质神经元内
SOD的含量。
2.5　统计分析
数据以 x±s表示 ,用 SPSS13.0进行统计学
处理。以单因素方差分析(one-wayANOVA)检验
差异显著性 。
3　结果
3.1　杨梅叶总黄酮对 OGD损伤大鼠皮质神经元
存活率的影响
　　结果表明 ,与正常组相比 OGD模型组经低糖
低氧再灌注损伤后 ,细胞的存活率显著下降 ,而与
OGD模型组相比 ,杨梅叶总黄酮各质量浓度给药
组则呈质量浓度依赖性的提高受损伤神经元的存
活率 ,结果见表 1。
Table1　Effectsoftotalflavonoidsfrom theleavesof
Myricarubraontheviabilityofoxygen-glucosedepriva-
tioninjuredcorticalneurons.Viabilityofthenormalneu-
ronsisdefinedas100%( x±s, n=8)
Group ρ/(mg·L-1) Viability/%
Normal 100±3.46
Injured 35.12±2.11a
Totalflavonoids 100 57.32±3.34b
10 52.71±3.29b
1 46.05±1.75b
　　a— P<0.01, comparedwithnormalcontrol;b— P<
0.01, comparedwithinjuredcontrol
3.2　杨梅叶总黄酮对 OGD损伤大鼠皮质神经元
培养液中 LDH释放的影响
　　结果表明 , OGD模型组神经元经低糖低氧再
灌注损伤后 ,培养液中 LDH释放量较正常组明显
增加 ,而与 OGD模型组相比 ,杨梅叶总黄酮各质
量浓度给药组均可降低损伤所致的神经元 LDH
释放 ,结果见表 2。
3.3　杨梅叶总黄酮对 OGD损伤大鼠皮质神经元
培养液中 H2O2含量的影响
　　结果表明 , OGD模型组神经元经低糖低氧再
灌注损伤后 ,培养液中 H2O2含量较正常组明显
增加 ,而与 OGD模型组相比 ,杨梅叶总黄酮各质
量浓度给药组均可降低神经元内细胞培养液中
H2O2含量 ,结果见表 3。
Table2　Effectsoftotalflavonoidsfrom theleavesof
MyricarubraonthelevelofLDH release(c)inoxygen-
glucosedeprivationinjuredcorticalneurons( x±s, n=8)
Group ρ/(mg·L-1) c/(U·L-1)
Normal 1 262.15±80.13
Injured 2 790.87±77.91a
Totalflavonoids 100 2 013.45±83.96b
10 2 177.17±111.05b
1 2 379.86±103.09b
　　a— P<0.01, comparedwithnormalcontrol;b— P<
0.01, comparedwithinjuredcontrol
Table3　Effectsoftotalflavonoidsfrom theleavesof
MyricarubraonH2O2 levelinoxygen-glucosedeprivation
injuredcorticalneurons( x±s, n=8)
Group ρ/(mg·L-1) c(H2O2)/(mmol·L-1)
Normal 71.06±3.87
Injured 109.70±7.17a
Totalflavonoids 100 89.14±6.93b
10 100.42±7.04b
1 103.15±4.18b
　　a— P<0.01, comparedwithnormalcontrol;b— P<
0.01, comparedwithinjuredcontrol
3.4　杨梅叶总黄酮对 OGD损伤大鼠皮质神经元
细胞内 MDA含量的影响
　　结果表明 , OGD模型组神经元经低糖低氧再
灌注损伤后 ,细胞内 MDA含量较正常组明显增
加 ,而与 OGD模型组相比 ,杨梅叶总黄酮各质量
浓度给药组均可降低损伤所致的神经元细胞内
MDA含量 ,结果见表 4。
Table4　Effectsoftotalflavonoidsfrom theleavesof
MyricarubraonMDAlevelpergram ofproteininoxy-
gen-glucosedeprivationinjuredcorticalneurons( x±s,
n=8)
Group ρ/(mg·L-1) MDA/(μmol·g-1)
Normal 3.24±0.32
Injured 10.27±0.16a
Totalflavonoids 100 6.12±0.55b
10 7.88±0.87b
1 9.19±0.99b
　　a— P<0.01, comparedwithnormalcontrol;b— P<
0.01, comparedwithinjuredcontrol
3.5　杨梅叶总黄酮对 OGD损伤大鼠皮质神经元
细胞内 SOD活性的影响
　　结果表明 , OGD模型组经低糖低氧再灌注损
831第 10期 吴书昱等:杨梅叶总黄酮对培养大鼠皮质神经元缺糖缺氧损伤的影响
伤后 ,神经元细胞内 SOD活性较正常组明显降
低 ,而与 OGD模型组相比 ,杨梅叶总黄酮各质量
浓度给药组均可提高神经元细胞内 SOD活性 ,结
果见表 5。
Table5　Effectsoftotalflavonoidsfrom theleavesof
MyricarubraonSODactivityinoxygen-glucosedepriva-
tioninjuredcorticalneurons( x±s, n=8)
Group ρ/(mg·L-1) SOD/(μU·g-1)
Normal 123.39±5.21
Injured 61.78±2.37a
Totalflavonoids 100 99.57±2.91b
10 87.62±3.08b
1 78.29±2.25b
　　a— P<0.01, comparedwithnormalcontrol;b— P<
0.01, comparedwithinjuredcontrol
4　讨论
a.MTT法是检测细胞存活率的常用方法。
因为存在于线粒体内膜上的琥珀酸脱氢酶作用于
底物进行脱氢 ,脱下的氢与 MTT相互作用 ,将氧
化型的 MTT还原成紫蓝色化合物-formazan,沉积
于细胞上 ,溶解于二甲基亚砜中 ,通过酶标仪测定
其 OD值来反映 SDH的活性和线粒体代谢的活
力 ,并间接反映细胞的存活情况 [ 9-10] 。LDH是无
氧酵解中的一个关键酶 ,广泛存在于各种组织细
胞中 ,正常情况下很少从胞浆中释放 。脑组织缺
血损伤时自由基的大量堆积 ,神经元细胞膜极易
受其攻击破坏 ,导致细胞膜通透性增高 , LDH漏
出增加 。因此 ,检测 LDH的漏出量可反映细胞损
伤的程度[ 11-13] 。本实验结果显示 , OGD损伤 4 h
后神经元的存活率较正常组显著下降 ,而杨梅叶
总黄酮各质量浓度给药组均能明显提高神经元存
活率 ,表现出对受损细胞的保护作用 。OGD损伤
4 h可使神经元细胞培养液中 LDH含量显著增
高 ,而杨梅叶总黄酮可呈质量浓度依赖性的抑制
损伤所引起的 LDH漏出 ,表明神经元细胞膜损伤
程度降低 ,与 MTT法检测结果基本一致 。以上两
个指标从不同的方面证明了杨梅叶总黄酮能够保
护缺糖缺氧神经元细胞膜的完整性 ,提高神经细
胞的存活率 。为了进一步确定杨梅叶总黄酮的保
护机制 ,作者从抗氧化方面进行了相关指标的检
测 。
b.MDA及 SOD是反映过氧化损伤的指标。
由于 MDA是细胞内脂质过氧化反应的最终产
物 ,化学性质稳定 ,且其含量能够体现组织细胞中
氧自由基的含量 [ 14] ,因此常用来反映脂质过氧化
损伤的程度 。 SOD是主要存在于细胞浆和线粒
体内的一种金属蛋白酶 ,通过一系列化学反应缓
冲及清除自由基而显示出抗氧化损伤的作用 ,是
机体内抗氧化系统的重要组成部分 [ 15] ,其活性高
低亦可间接反映组织细胞中自由基的含量和脂质
过氧化损伤的程度。 H2O2是体内的一种自由基 ,
其含量的高低也会直接反映体内过氧化水平的高
低 。本实验结果显示 ,经 OGD损伤的大鼠皮质神
经元细胞内的 SOD活性显著降低而 MDA、H2O2
的水平明显升高 ,说明脑组织缺血后氧自由基脂
质过氧化反应增强 ,消除了过多的抗氧化酶 ,氧
化 -抗氧化平衡被打破。而杨梅叶总黄酮各剂量
组可呈质量浓度依赖性的提高 OGD损伤神经元
细胞内 SOD活性 ,降低 MDA、H2O2水平 ,提示药
物具有较强的抗氧化损伤作用 。
5　结论
杨梅叶总黄酮对缺糖缺氧再灌注损伤皮质神
经元有明显的保护作用 ,是通过提高细胞抗氧化
能力 ,降低自由基产生 ,减少氧自由基对膜脂质破
坏等来实现的。缺糖缺氧损伤是多环节多因素参
与的复杂病理过程 ,故杨梅叶总黄酮对培养大鼠
皮质神经元保护作用的机制还有待深入研究。
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EfectsoftotalflavonoidsfromtheleavesofMyrica
rubraonculturedratcorticalneuronsduringcom-
binedoxygenandglucosedeprivation
WUShu-yu1 , WANGShu-jun2 , LIUQiao1 , ZHANGYing-hui2 , LUShuang3
(1.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016,
China;2.SchoolofPharmacy, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China;3.TheChief
ContractServicesCenterStateFoodandDrugAdministration, Beijing100810, China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheefectsoftotalflavonoidsfromtheleavesofMyricarubraonthe
primaryculturedratcorticalneuronsduringcombinedoxygenandglucosedeprivation.MethodsPrimary
culturedratcorticalneuronswererandomlydividedintothenormalcontrolgroup, themodelgroupandtotal
flavonoidsfromtheleavesofMyricarubraonlow-dose, medium-doseandhigh-dose(100 mg·L-1 ,
10 mg·L-1 , 1 mg·L-1)group.ThecorticalneuronsviabilitywasdeterminedbyMTTassay.LDHleakage,
concentrationofhydrogenperoxide(H2O2), theintracelularlevelsofsuperoxidedismutase(SOD)andma-
londialdelyde(MDA)productionwereassessedbychromatometry.ResultsTotalflavonoidstreatmentsignifi-
cantlyreducedLDHleakage, H2O2 , MDAproductionandincreasedthecelviabilityandSODlevelsincor-
ticalneuronssubjectedtooxygen-glucosedeprivation.ConclusionsTheresultsindicatethattotalflavonoids
fromtheleavesofMyricarubrastronglyprotectprimaryculturedneuronsagainstoxygen-glucosedepriva-
tion-inducedoxidativestress.
Keywords:corticalneurons;oxygen-glucosedeprivation;Myricarubraleave;totalflavonoid
833第 10期 吴书昱等:杨梅叶总黄酮对培养大鼠皮质神经元缺糖缺氧损伤的影响