全 文 ：· 1422· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (9): 1422−1429
甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元的保护作用
李 玮, 石晋丽, 李 琴, 段惠惠, 唐民科*
(北京中医药大学中药药理系, 北京 100102)
摘要: 观察甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元的保护作用。采用孕 14天小鼠胚胎皮层制备原代培 养神经
元; MTT 法确定甘松新酮对原代培养神经细胞的安全剂量, 并观察其对缺糖缺氧神经元的保护作用; 采用 Western
blotting法观察药物对缺糖缺氧损伤神经元以及正常培养神经元蛋白激酶 A (PKA) 和细胞外信号调节激酶 (ERK) 通路
关键蛋白表达的影响。结果显示, 甘松新酮 (50和 100 μmol·L−1) 能够增加缺糖缺氧损伤神经元的存活率 (P < 0.01, 与
OGD组比较); 同时, 能增加缺糖缺氧神经元 PKA、小分子 G蛋白 Ras的相关蛋白 1 (Rap1)、丝裂原激活的蛋白激酶的
激酶 1 (MEK1) 及磷酸化的 ERK1/2 (p-ERK1/2) 的表达, 且此作用呈剂量依赖趋势。对正常培养神经元研究结果显示,
甘松新酮 (50、100和 200 μmol·L−1) 也能增加其 PKA、Rap1、MEK1及 p-ERK1/2的表达 (P < 0.01)。以上结果表明, 甘
松新酮对缺糖缺氧损伤的原代培养神经元有明确保护作用, 该作用可能与药物激活 PKA和 ERK通路有关。
关键词: 甘松新酮; 原代培养神经元; 缺糖缺氧; PKA; ERK
中图分类号: R963 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2013) 09-1422-08
Nardosinone reduces neuronal injury induced by oxygen-glucose
deprivation in primary cortical cultures
LI Wei, SHI Jin-li, LI Qin, DUAN Hui-hui, TANG Min-ke*
(Department of TCM Pharmacology, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)
Abstract: The aim of the study is to investigate the effect of nardosinone (Nar) on neuronal injury induced
by oxygen-glucose deprivation (OGD) in primary cortical cultures isolated from embryos at gestational day 14.
MTT method was used to determine the dosage regimen of Nar in primary neuronal cultures and observe the
influence of Nar on the neurons suffering OGD; Western blotting analysis was used to detect expressions of
protein kinase A (PKA), Ras related protein 1 (Rap1), mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEK1) and
phospho-extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2) of OGD-injured or uninjured primary cultured
neurons after Nar treatment. Results showed that Nar (50 and 100 μmol·L−1) improved the cell viability during
OGD damage (P < 0.01) and increased the expression of PKA, Rap1, MEK1 and p-ERK1/2 in injured neurons.
Additionally, elevations of PKA, Rap1, MEK1 and p-ERK1/2 in uninjured neurons were caused by Nar (50, 100
and 200 μmol·L−1) with a dose-dependent tenclency as well (P < 0.01). In conclusion, Nar could protect against
the neuronal injury exposed to OGD, which may be relevant to the promotion of PKA and ERK signaling pathway.
Key words: nardosinone; primary neuronal cultures; oxygen-glucose deprivation; PKA; ERK
传统中药甘松具有理气止痛、开郁醒脾的功效。
收稿日期: 2013-03-28; 修回日期: 2013-05-15.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30772763); 教育部新世纪优
秀人才支持计划 (2010).
*通讯作者 Tel: 86-10-64287660, Fax: 86-10-64220867,
E-mail: tangminke@yahoo.com
现代药理研究表明, 甘松具有镇静[1]、抗抑郁[2]作用。
从甘松分离获取的单体成分甘松新酮 (nardosinone,
Nar), 不仅具有一定的抗抑郁活性[3], 而且能够协同
神经生长因子 (NGF) 促进 PC12D细胞的神经样分
化[4]。据此推测, 甘松新酮的活性可能与调节神经元
李 玮等: 甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元的保护作用 · 1423·
行为有关。本研究选取原代培养的缺糖缺氧损伤
(oxygen-glucose deprivation, OGD) 神经元作为研究
对象, 观察甘松新酮对 OGD神经元的影响, 以期为
甘松及甘松新酮的应用提供实验依据。
蛋白激酶 A (protein kinase A, PKA) 是一种依赖
于第二信使环腺苷酸 (cyclic adenosine monophosphate,
cAMP) 的蛋白激酶, 几乎所有 cAMP的作用都是通
过活化 PKA使其底物蛋白发生磷酸化而实现的, Ras
相关蛋白 1 (Ras related protein 1, Rap1) 则是 PKA激
活的重要目标之一, 起着调节下游丝裂原激活的蛋
白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 级
联通路的关键作用。作为 MAPK级联通路的家族成
员, 丝裂原激活的蛋白激酶的激酶 1 (MAPK kinase 1,
MEK)−细胞外信号调节激酶 1/2 (extracellular signal-
regulated kinase 1/2, ERK1/2) 是与细胞存活和生长
最为紧密的信号转导通路之一。本研究观察甘松新酮
对 OGD神经元 PKA-Rap1和 MEK1-ERK1/2信号通
路的影响, 以期对甘松新酮的作用机制进行探索。
材料与方法
实验动物 ICR小鼠, 年龄 8周, 体重 (20±2) g,
SPF级, 雌雄各半, 由北京维通利华实验动物技术有
限公司提供, 合格证号 SCXK (京) 2006-009。
药品和试剂 甘松新酮的相对分子质量为 250,
纯度为 98%, 由北京中医药大学中药学院中药生药
系石晋丽教授提供; 多聚赖氨酸 (相对分子质量为
150 000～300 000, Sigma公司, 美国); DMEM高糖培
养基 (Gibco公司, 美国); 胎牛血清和马血清 (Hyclone
公司, 美国); 胰蛋白酶 (Amresco公司, 美国); 乙二
胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na, 天津市化学试剂六厂);
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES, Merck-Calbiochem 公
司, 德国); 谷氨酰胺、台盼蓝、MTT、阿糖胞苷和
PD98059 (Sigma 公司, 美国); RIPA蛋白裂解液 (北
京普利莱基因技术有限公司, 中国); PKA抗体、Rap1
抗体、MEK1 抗体、p-ERK1/2 抗体 (Cell Signaling
公司, 美国); 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG、辣
根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG (北京中杉金桥生
物技术有限公司, 中国); BCA 蛋白浓度测定试剂盒
(上海碧云天生物技术有限公司, 中国); ECL化学发
光试剂盒 (Santa Cruz公司, 美国)。
溶液配制 DMEM 培养液 : 含 10% 马血清 ,
10% 胎牛血清 , 2 mmol·L− 1谷氨酰胺 , 3.7 g·L− 1
NaHCO3, 5 g·L−1 HEPES; 无糖 Earle’s液: 含 130
mmol NaCl, 5.4 mmol KCl, 1.8 mmol CaC12, 26
m m o l N a H C O 3 ,
0.8 mmol MgC12, 1.18 mmol NaH2PO4, 定容至 1 L;
含糖 Earle’s液: 含 33 mmol葡萄糖, 130 mmol NaCl,
5.4 mmol KCl, 1.8 mmol CaC12, 26 mmol NaHCO3,
0.8 mmol MgC12, 1.18 mmol NaH2PO4, 定容至 1 L。
以上溶液均需调 pH值至 7.2, 并过滤 (0.22 μm) 除
菌。
实验仪器 医用型洁净工作台 (DL-CJ-2ND,
北京东联哈尔仪器制造有限公司 , 中国); CO2培养
箱 (RC0300TVBB, GS Laboratory Equipment, 美国);
倒置显微镜 (DMIL HC, Lecia, 德国 ); 荧光显微
镜 (ECLIPSE 80i, Nikon, 日本); 酶标仪 (Multiskan
Mk3, Thermo, 芬兰 ); 稳压稳流电泳仪 (Powerpac
HQ)、垂直电泳槽 (MP3) 和半干转电转印仪 (Trans-
Blot SD) 均购自 Bio-Rad (美国)。
小鼠胚胎皮层原代培养神经细胞制备 参照
Song 等 [5]的方法并稍加改进, 在无菌环境下, 取孕
14天小鼠胚胎, 分离皮层, 将其剪成 1 mm3大小的组
织块, 用 0.1%胰蛋白酶−0.02% EDTA-2Na, 在 37 ℃
条件下消化 20 min, 每间隔 5 min轻摇 1次。DMEM
培养液终止消化后, 轻轻吹打数次, 稍待大块组织沉
淀后, 取上清细胞悬液, 血球计数板计数。调整细胞
数为 1×105/mL, 接种于预先用 0.025 mg·mL−1多聚赖
氨酸溶液包被的 96孔培养板或 6孔培养板中, 96孔
板每孔 200 μL, 6 孔板每孔 2 mL, 置培养箱中 , 5%
CO2、95%空气、饱和湿度及 37℃孵育 24 h。
小鼠胚胎皮层原代培养神经元制备 按“小鼠
胚胎皮层原代培养神经细胞制备”方法接种细胞 ,
接种当天记为第 1天, 于第 3天更换为含 0.5 μg·mL−1
阿糖胞苷的 DMEM 溶液, 24 h 后换 DMEM 培养基,
培养第 6天换 DMEM培养基, 培养至第 8天, 即可
获得原代培养神经元, 经鉴定神经元纯度大于 90%。
确定甘松新酮对原代培养神经细胞安全剂量 取原
代培养神经细胞, 随机分为 8组, 每组 6个复孔, 吸去原
培养液, 分别加入DMEM培养液或含甘松新酮不同浓度
的DMEM培养液, 每孔 200 μL。试剂空白组不接种细胞,
只加DMEM培养液; 正常对照组接种细胞, 加入DMEM
培养液; Nar 0.05、0.1、0.2、0.5、1和 2 mmol·L−1剂量组
加入相应浓度含药物的 DMEM培养液。于给药后 12、
24、48和 72 h分别取一块培养板, 用MTT法检测吸光
度 (A) 值, 并用以下公式计算细胞存活率, 细胞存活率
=(A 药物−A 空白)/(A 正常对照−A 空白)×100%, 以存活率大于 90%
作为药物安全标准。
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甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元存活
率的影响 取原代培养神经元, 随机分为 4组, 分别
是正常对照组、缺糖缺氧损伤 (OGD) 组、Nar 50及
100 μmol·L−1剂量组, 每组 10个复孔。正常对照组和
OGD 组换成 DMEM 培养液, 各给药组换成含相应
浓度的甘松新酮的 DMEM培养液。给药后培养 12 h,
吸去各组上清液 , 正常对照组换为含糖 Earle’s 液 ;
OGD组和 Nar 50及 100 μmol·L−1剂量组换为不含糖
的 Earle’s液。OGD组及甘松新酮各剂量组参照方法[6],
将其置于缺氧盒中, 通入含5% CO2和95% N2的混合
气体, 反复操作 3次, 平衡 15 min后, 将缺氧盒密封,
置于培养箱中。缺氧刺激 30 min后正常培养, 2和 4 h
后分别取出对应的培养板, 用 MTT法检测。
甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元
PKA、Rap1、MEK1和 p-ERK1/2的影响 取原代
培养神经元, 随机分为 4组, 即正常对照组、OGD组、
Nar 50及 100 μmol·L−1剂量组。正常对照组和 OGD
组换成 DMEM培养液, 各给药组换成含有相应浓度
甘松新酮的 DMEM培养液。培养 12 h后, 吸去各组
上清液, 正常对照组换为含糖Earle’s液, 其他各组换
为不含糖的 Earle’s液。缺氧刺激 30 min, 分别于刺
激 2和 4 h后, 取对应的培养板, 用 Western blotting
法检测蛋白表达。
甘松新酮对原代培养神经元 PKA、Rap1、MEK1
和p-ERK1/2的影响 取原代培养神经元, 随机分为 4
组, 即正常对照组、Nar 50、100 和 200 μmol·L−1剂
量组。正常对照组换成 DMEM培养液, 各给药组换
成含有相应浓度甘松新酮的 DMEM培养液。培养 24
和 48 h后, 分别取对应培养板, 用Western blotting法
检测蛋白表达。
MTT 检测 取待测细胞, 每孔加入 5 mg·mL−1
MTT溶液 20 μL, 继续孵育 4 h后, 小心吸去上清液,
每孔加入 DMSO 200 μL, 振荡摇匀, 使结晶充分溶
解。用酶标仪测吸光度值, 反映细胞存活情况, 检测
波长为 540 nm。
Western blotting 检测 取待测细胞, 吸去上清
液, 用冰冷的生理盐水清洗 3次, 每次 5 min, 每孔加
入RIPA裂解液 100 μL, 吹打数次待细胞充分裂解后,
收集细胞裂解液, 10 000×g离心 20 min, 收集上清液,
用 BCA试剂进行蛋白质定量。上样量 50 µg, 用 10%
SDS-PAGE常规电泳, PVDF膜转载蛋白质, ECL化学
发光法显色。采用 Image-Pro Plus软件对目标条带进
行灰度分析, 将各组条带灰度与β-actin 灰度进行比
较, 得到相对光密度值。
数据分析 以上实验均重复 3 次, 结果用 x ± s
表示。数据用 SAS 8.2进行统计学处理, 各组数据进
行正态性检验及方差齐性检验, 并用单因素方差分
析 (one-way ANOVA) 进行组间比较。
结果
1 甘松新酮对原代培养神经细胞的安全剂量
给药前对细胞进行镜检观察, 大部分细胞形态正常,
并有较短的突起伸出。给药后 12 h, Nar 0.05、0.1和 0.2
mmol·L−1剂量组的细胞生长良好, 突起有所增长; Nar
0.5、1和 2 mmol·L−1剂量组的少量细胞形态完整, 大部
分细胞呈球形。给药后 24 h, Nar 0.05、0.1和 0.2 mmol·L−1
剂量组的细胞生长旺盛 , 突起发育良好 ; Nar 0.5
mmol·L−1 剂量组见少量形态完整细胞 ; Nar 1 和 2
mmol·L−1剂量组的细胞大部分呈碎片, 少量球形 (图
1)。给药后 72 h, Nar 0.05、0.1和 0.2 mmol·L−1剂量组的
细胞生长良好, 细胞之间的突起相互交汇; Nar 0.5和 1
mmol·L−1剂量组见少量生长良好的细胞; Nar 2 mmol·L−1
剂量组仅可见零星的碎片, 无正常细胞。MTT结果 (图
2) 显示, Nar (0.05和 0.1 mmol·L−1)干预细胞后, 各时间
点的存活率均高于 90%; Nar (0.2 mmol·L−1)干预细胞 24
h后, 细胞存活率为 (88.14 ± 11.06) %, 但对细胞形态无
损伤, 提示可作为体外原代培养神经元的安全剂量。
2 甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元存活率
的影响
结果显示 (表 1), 缺糖 2和 4 h后, 与正常对照组
比较, OGD组的 A值均显著降低 (P<0.01), 细胞存活
率分别降低 50%和 34%, 提示缺糖缺氧导致明显的
神经元损伤; Nar 0.05和 0.1 mmol·L−1剂量组在损伤
后 2和 4 h, 其A值均显著高于OGD损伤组 (P<0.01),
0.05 mmol·L−1剂量组的细胞存活率分别增加 24%及
34%, 0.1 mmol·L−1剂量组的细胞存活率分别增加 44%
及 46%, 表明甘松新酮对缺糖缺氧引起的神经元损
Table 1 Effect of Nar on the cell viability under oxygen-
glucose deprivation (OGD) condition detected with MTT assay.
n = 10, x ± s. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs OGD
group without Nar treatment
Group C/mmol·L−1
Absorbance
OGD 2 h OGD 4 h
Control − 0.74 ± 0.21 0.53 ± 0.08
OGD − 0.37 ± 0.09** 0.35 ± 0.04**
Nar 0.05 0.46 ± 0.06**## 0.47 ± 0.10##
Nar 0.1 0.49 ± 0.09**## 0.51 ± 0.08##
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Figure 1 Effect of nardosinone (Nar) on the morphology of primary neuronal cells after 24 h incubation. bar: 100 μm
Figure 2 Effect of Nar on the viability of primary neuronal
cells detected with MTT assay
伤具有保护作用。
3 甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元 PKA、
Rap1、MEK1和 p-ERK1/2的影响
结果显示, 缺糖缺氧刺激 2和 4 h后, OGD组神
经元 PKA表达均显著降低 (P<0.01, 与正常组神经
元比较) , Nar 0.05和 0.1 mmol·L−1剂量组在这两个时
间点均能抑制 OGD引起的 PKA下降; 其中, Nar 0.1
mmol·L−1剂量组的神经元PKA表达量分别高出OGD
组 1.3倍和 2.3倍 (P<0.01)。PKA通路下游关键蛋白
Rap1测定结果显示, 缺糖缺氧刺激 2和 4 h后, Rap1
表达也显著降低 (P < 0.01, 与正常组神经元比较);
而 Nar 0.05和 0.1 mmol·L−1剂量组的神经元 Rap1表
达量显著高于 OGD组 (P < 0.01) , 提示 Nar也可以
减弱缺糖缺氧对Rap1的影响, 但给药组Rap1表达量
仍低于正常组神经元 (图 3)。
MEK1测定结果显示, 缺糖缺氧刺激 2和 4 h后,
OGD组神经元 MEK1表达分别降低 76%和 97%, 与
正常组神经元比较差异显著 (P < 0.01); Nar 0.05 和
0.1 mmol·L−1剂量组的神经元MEK1表达显著高于对
应的OGD组神经元 (P<0.01), 提示缺糖缺氧引起的
MEK1降低可以被 Nar部分抑制。同时也观察到, 缺
糖缺氧刺激 2和 4 h后, OGD组神经元MEK1下游分
子磷酸化 ERK (即 p-ERK1/2) 表达也显著降低 (P<
0.01, 与正常组神经元比较), Nar 0.05和0.1 mmol·L−1
剂量组均可显著抑制缺糖缺氧引起的 p-ERK1/2表达
改变, 表现为使 p-ERK1/2表达量明显增加 (P<0.01,
与 OGD组比较), 见图 3。
4 甘松新酮对正常原代培养神经元 PKA、Rap1、
MEK1和 p-ERK1/2的影响
为揭示对正常细胞的影响, 观察 Nar 作用于原
代培养神经元 24 和 48 h 后 PKA 及 ERK 通路蛋白
表达的变化, 结果 (图 4) 显示, Nar (0.05、0.1和 0.2
mmol·L−1) 与细胞共同孵育 24和 48 h以后, 正常神
经元 PKA、Rap1、MEK1和 p-ERK1/2的表达均明显
增加 (P<0.01, 与正常对照组比较), 且呈一定的剂
量依赖趋势, 提示Nar对正常细胞的信号通路有明显
的调节作用。
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Figure 3 Effect of Nar on PKA and ERK1/2 signaling pathway in OGD insulted neurons detected with Western blotting. n = 3, x ± s.
**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs OGD group without Nar treatment
与 Nar培养 24和 48 h后, Nar各剂量组的 PKA
表达均显著增加 (P < 0.01, 与正常组神经元比较 ),
Nar 0.05 mmol·L−1剂量组的 PKA表达量是正常组的
1.8倍和 2.5倍, Nar 0.1 mmol·L−1剂量组的 PKA表达
量是正常组的 2.7倍和 3.9倍, Nar 0.2 mmol·L−1剂量
组的 PKA表达量是正常组的 5.6倍和 5.9倍, 呈剂量
李 玮等: 甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元的保护作用 · 1427·
依赖趋势 , 且两个时间点各剂量组之间差异不大;
Nar作用以后, PKA通路下游关键蛋白 Rap1 的表达
也显著升高 (P<0.01, 与正常组神经元比较), 并且
药物的作用在 48 h更加明显。
与Nar孵育 24和 48 h后, 对MEK1和 p-ERK1/2
表达量有类似的影响, 即 Nar 可使神经元 MEK1 和
p-ERK1/2表达显著增加 (P<0.01, 与正常组神经元
比较)。在两个时间点 Nar对 MEK1表达的促进作用
Figure 4 Effect of Nar on PKA and ERK1/2 signaling pathway in neurons detected with Western blotting. n = 3, x ± s. **P < 0.01
vs control group
· 1428· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (9): 1422−1429
类似 , 也有比较明显的剂量依赖趋势。但是对于
p-ERK1/2, Nar 0.05 mmol·L−1剂量组在 24 h 的表达
量高于 48 h, 此现象值得进一步探讨。
讨论
甘松是一味传统中药 , 在临床常被用于抑郁症
等疾病的治疗, 其作用机制尚不清楚。日本学者发现
甘松新酮能协同 NGF促进 PC12D细胞突起生长, 但
甘松新酮单独应用对 PC12D细胞神经分化作用并不
明显。本实验采用小鼠胚胎皮层原代培养神经元, 证
实甘松新酮对缺糖缺氧引起的神经元损伤有明确的
保护作用, 此作用可能与其激活神经元 PKA-Rap1和
MEK-ERK信号通路有关。本研究结果为甘松新酮的
临床应用提供了一定的实验依据。
PKA-Rap1和MEK-ERK信号通路被认为与神经
元存活密切相关。通常依赖 PKA激活的 Rap1 能够
激活 MAPK 级联通路中的 B-Raf (MAPK 激酶的激
酶), B-Raf 进而激活 MEK1/2 (MAPK 激酶), 最终激
活 ERK1/2 (MAPK)[7]。所以, 在 ERK诱发的一系列细
胞内活动过程中, 如细胞存活、增殖、分化, Rap1发
挥着激活 MAPK 级联通路的关键作用。研究发现,
不同因素, 如缺氧条件[8]、胞外钾离子浓度升高诱发
的去极化[9], 引发的神经元损伤, 常常伴随着 PKA、
Rap1或 MEK1、p-ERK1/2表达的减少。一些化合物
对损伤神经元的保护作用正是通过上调这些胞内信
号蛋白发挥的 , 如 Exendin-4 通过促进 PKA 表达 ,
降低缺糖缺氧引起的神经元死亡 [10]; 脑啡肽[11]、胃
促生长素[12]、瘦素[13]、金丝桃苷[14]、比格列酮[15]等,
对缺糖缺氧损伤原代皮层神经元的保护作用均与促
进 p-ERK表达有关。本实验发现, 甘松新酮 (0.05和
0.1 mmol·L−1) 能够保护缺糖缺氧引起的原代培养神
经元损伤, 并促进 PKA、Rap1、MEK1和 p-ERK1/2
的表达, 提示甘松新酮对损伤神经元的保护作用可
能与促进 PKA和 ERK信号密切相关。
除了影响细胞存活以外, PKA和 ERK信号对细
胞增殖也起着重要调节作用。诸多因素通过该信号调
节细胞增殖, 如 Neudesin[16]对胎鼠皮层神经干细胞
的促增殖作用与 PKA有关; NGF和胶原[17]可以通过
增加 ERK1/2 磷酸化, 促进胎鼠神经干细胞的增殖;
相反, PD98059或 Spred1[18]可以通过下调 p-ERK1/2
表达抑制神经干细胞增殖。本研究发现, 甘松新酮对
正常的原代培养神经元 PKA和ERK信号表达均有显
著促进作用。尽管本研究所采用的细胞是终末分化的
原代神经元, 但是药物的这种作用提示, 甘松新酮有
可能对神经干细胞增殖会有一定的影响, 这部分工
作有待进一步深入。
在今后的工作中, 希望能证实甘松新酮对神经
干细胞, 特别是成年动物脑内神经干细胞的作用, 为
甘松在临床被用于抑郁症的治疗提供更有力的研究
支持。
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