全 文 ：中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月·893·
灯盏花素对谷氨酸体外诱导大鼠皮质神经元损伤的保护作用
熊 哲1，张丽2，李彩莲3
(1．华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，湖北武汉430030；2．华中科技大学同济医学院
附属同济医院血液内科，湖北武汉430030I．河南省中医学院附属中医院药剂科，河南郑州450008)
摘要：目的探讨灯盏花紊对谷氨酸(Glu)体外诱导原代培养大鼠皮质神经元损伤的作用及机制。方法通过
MTT法观察灯盏花素对Glu诱导神经元损伤的细胞存活率的影响，并结合超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛
(MDA)生化测试及细胞钙影像方法探讨相关作用机制。结果灯盏花素呈质量浓度依赖性提高Glu诱导神经元
损伤细胞的存活率，并拈抗由Glu诱导的[Ca”]；升高、MDA生成，提高SOD活性。结论灯盏花素对Glu体外诱
导大鼠皮质神经细胞损伤具有保护作用，可能与减轻胞内Ca”超载、提高神经细胞抗氧化能力有关。
关键词：灯盏花素；谷氨酸；皮质神经元f[Ca”]．
中围分类号：R285．5 文献标识码：A 文章缩号：0253—2670(2008)06—0893一03
灯盏花又名灯盏细辛，是云南特产中药菊科植
物短葶飞蓬ErigeronbreviscapUS(Vant．)Hand．
一Mazz．的干燥全草，灯盏花素是从灯盏花中精炼提
取出来的有效成分，其注射液已在缺血性脑血管疾
病的治疗中取得显著疗效[1]。除了基于其明确的脑
血管扩张机制之外，灯盏花素是否同时存在对脑神
经元的保护作用，相关文献较为少见。谷氨酸
(glutamate，Glu)的过度释放是脑缺血等多种病理
情况下神经元兴奋毒损伤的关键环节，因而，本实验
建立Glu体外诱导大鼠皮质神经元损伤模型，从细
胞水平观察灯盏花素对Glu致原代培养大鼠皮质
神经元兴奋性毒性的影响并对其机制进行初步
研究。
1材料与方法
1．1材料：灯盏花素注射液(云南昆明龙津药业有
限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)
试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；谷氨酸
(L—Glu)、MTT、二甲亚砜(DMSO)、荧光染料
Fura一2／AM、多聚赖氨酸、EDTA均购于Sigma公
司；DMEM／12完全培养基购于Gibeo公司；胎牛
血清购于Hyclone公司；C02培养箱(Shellab2306，
美国)；ELX800型酶标仪(Bio—TekInstruments
INC，Cole—parmar，美国)，CCD成像系统和
Tillvision软件(TillPhotonics，德国)；其他试剂均
为分析纯。
1．2方法
1．2．1细胞培养：取新生3d内的Wistar大鼠(华
中科技大学同济医学院实验动物中心，合格证号：湖
北省医动字19—021)，在超净工作台内，4℃的PBS
平衡液(mmol／L：NaCl136．89，KCl2．68，
Na2HP049．75，KH2P041．15，pH7．2)中，／jx,D分
离出大脑皮质。用眼科剪将皮质剪碎，转移入含有
0．125％胰蛋白酶的PBS液中，37℃水浴消化28
min。消化完毕，加人等体积DMEM／12完全培养基
(含有10％胎牛血清、100U／mL青霉素、100pg／
mL链霉素)，吹打终止消化。加入DMEM／12完全
培养基，吹打呈混悬液接种于多聚赖氨酸预处理的
35mm塑料培养皿、96孔板、24孔板中，置于5％
C0：、37℃的培养箱。第2天加入阿糖胞苷，抑制胶
质细胞的增殖。第3天用DMEM／F12完全培养基
换液，培养至第7天，加药处理。
1．2．2细胞存活率测定：采用MTT法测定细胞存
活率。第8天，用DMEM／F12完全培养基(含有
5％胎牛血清、100U／mL青霉素、100／-g／mL链霉
素)培养24h，加入Glu(50---800t．tmol／L)，培养
30min。灯盏花素组，在加入半数抑制细胞存活率浓
度(IC。。)的Glu前，预处理加入不同质量浓度灯盏
花素(6．25～100t-tg／L)，同样含5％胎牛血清的
DMEM／F12完全培养基培养24h，再加入IC。。剂
量的Glu，培养30min。然后均加入0．5mg／mL
MTT，培养4h，再加入DMS0，振摇10min。在
490nm处，采用ELX800型酶标仪进行吸光度测
定。将含有5％胎牛血清的DMEM／12完全培养基
为对照组，对照组的细胞存活率为100％。
收稿日期：2007—09—11
作者简介：熊哲(1979一)，男，湖南岳阳人．药师，硕士．从事神经药理研究．
Tel：(027)63599052E—mail：200003390173@sina．com．cn
万方数据
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1．2．3SOD、MDA测定：经IC。。的Glu处理后，去
除原培养液，用PBS洗2遍，24孔板每孔加入0．1
mol／LPBS和0．05mol／LEDTA(pH=8．O)1
mL，再加入50pL1％Triton--X100，将24孔培养
板振荡1min，使细胞溶解，加入100肛L25％
H3PO。以沉淀蛋白，100 0×g于4℃离心1h，取
上清液，按试剂盒说明书测定SOD活性和MDA
水平。蛋白定量用Folin法测定。
1．2．4[Ca2十]i测定：依据Lee等[23的研究，采用10
mmol／LGlu诱导ECa2+]i变化。将接种皮质神经元
的玻片置于含有1弘mol／LFura一2／AM的细胞外液
(mmol／L：NaCl145、KCl5．0、MgCl21．0、CaCl2、葡
萄糖10，HEPES10，pH7．2)中，37℃下避光水
浴25min。Fura一2一Ca2+复合物和Fura一2分别在
340和380nm激发，经CCD成像系统和Tiilvision
软件采集和分析，即得到Ratio=FⅢ／W。卸的荧光比
值。此Ratio值间接反映皮质神经元[-Ca2+]i。
1．2．5统计分析：各组数据以z士s表示，采用SAS
8．1统计软件进行方差分析的Dunnett—t检验。
2 结果
2．1灯盏花素提高Glu诱导皮质神经元损伤的细
胞存活率：图1表明，Glu(50～800tlmol／L)浓度依
赖性地降低培养皮质神经元的存括率，与对照组比
较差异显著(行=24，P<0．05)，其IC。。约为400
tlmol／L，此时细胞存活率为(51．20±9．71)％。
6．25～50／-g／L灯盏花素预处理24h，灯盏花素呈
质量浓度依赖性提高400pmol／LGlu诱导损伤后
细胞的存活率，其中50pg／L灯盏花素作用最明
显，使细胞存活率由(52．72土7．93)％上升为
(69．54士7．98)％(，z=24，P毋＼
哥
磐
雉
翟
赢
GluC／(“mol·L’。)
与对照组比较：’P<0．05
。P<0．05UScontrolgroup
田1 Glu对皮质神经元细胞存活率的影响(；士s。一=24)
Fig．1EffectofGluoncellviabilityofcortical
neurons(；士s，露=24)
《
需
烬
世
翟
恳
列盈花素，，／(ug‘L。‘)
与Glu(400pmol·L-1)组比较l。P<0．05
。尸圈2灯盏花素对Glu诱导皮质神经元细胞损伤的
细胞存活率的影响G+s，一一24)
Fig．2Effectofbreviscapineoncellviabilityofcortical
neuronsI juredbyGiuG士s，n=24)
2． 灯盏花素对SOD活性和MDA水平的影响：
神经细胞经400pmol／LGlu损伤后，细胞内MDA
水平增高，SOD活性降低。经各质量浓度的灯盏花
素预处理24h，灯盏花素组较Glu组，MDA水平明
显降低，而SOD活性明显增高，均有显著性差异
(咒一24，P呈质量浓度依赖关系，见表1。
表1 灯盏花素对皮质神经元SOD活性和MDA水平的
影响(；士s，露=12)
Table1 EffectsofbreviscapineonlevelofMDA
andactivityofSODincorticalneurons
(；士s，厅=12)
与Glu组比较：‘P<0．05
。P<0．05口jGlugroup
2．3灯盏花素降低Glu诱导的[-Ca2+]。增高，如图3
所示，10mmol／LGlu明显增高[Ca抖]i，而给予50
pg／L灯盏花素预处理24h，Glu诱导[Ca2+]i增高
的幅度降低(11．10+0．06)oA，后经细胞外液冲洗，
Ratio曲线峰值均出现回落，表明Glu诱导[Ca2+]i
增高呈可逆性作用。灯盏花素组与Glu组比较，差
异显著(P3讨论
灯盏花素是自灯盏细辛中提取的灯盏花甲素、
乙素混合物，近年来发现该药对脑血管疾病，如脑血
栓形成、脑栓塞、脑溢血等有显著疗效，其作用机制
以扩张脑血管及抗血小板聚集从而改善脑部微循环
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加
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万方数据
中草秀 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月·895·
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田3 Giu诱导皮质神经元ECa2+]I升高
Fig．3IncreaseofEca2+]lincortical
neuronsi ducedbyGlu
Glu+灯盏花素(50ug·L‘1)
与Glu组比较：。P。P圈4灯盏花素抑制Glu诱导皮质神经元[-Ca2+]I的
升高(；士s，露一15)
Fig．4Inhibitionofbrevlscapineonincrease
of[Ca2+]IIncorticalneuronsi duced
byGlu(；士s，厅一15)
研究最为广泛[1．3]，然而，是否同时存在灯盏花素对
脑部神经元保护作用的参与，迄今为止，研究报道尚
不多见。内源性Glu参与多种生理功能调控，是脑
内重要的兴奋性神经递质，但Glu过量释放则导致
神经元兴奋毒性的产生。研究者认为，神经元兴奋毒
性是在脑缺氧缺血、脑外伤、癫痫等病理情况下参与
发病的重要因素Ⅲ。因此，本研究建立了Glu体外
诱导大鼠皮质神经元损伤的实验模型，结果表明通
过灯盏花素保护性预处理后的神经细胞，细胞存活
率呈浓度依赖性增加，提示灯盏花素对Glu引起的
脑神经细胞损伤具有一定的保护作用。
突触后膜的Ⅳ一甲基一D一天冬氨酸(Ⅳ一methyl—
D—aspartate，NMDA)受体门控通道是Glu引起的
Ca2+内流的主要途径，病理性Glu过度释放会导致
NMDA受体门控通道开放，胞外大量Na+、Ca2+内
流，胞内K+外流，引起细胞内Ca2+超载，继而激活一
系列钙依赖性酶，促使大量的氧自由基的生成，导致
脂质过氧化反应，MDA生成增加，SoD活性降低，
加速细胞损伤[5]。目前越来越多的研究者提出中药
对神经元损伤的保护机制可能与降低胞内[Ca2+]i
有关，但未做相应的[Ca2+]i动态监测‘引。本研究采
用双波长荧光测定法对[Ca抖]i进行动态检测，结果
表明，10mmol／LGlu导致[-Ca2+]i明显增加，而预
先给予灯盏花素24h保护，可显著降低由Glu诱导
的[Ca2+]i增高。同时在SOD和MDA生化测试中，
由Glu诱导I-Ca2+]。增高所产生的MDA增高和
SOD活性降低也得到相应拮抗，提示灯盏花素对
Glu致神经元损伤的保护，可能与减轻胞内Ca2+超
载、抗过氧化损伤有关，但该机制是否通过抑制
NMDA受体而发挥作用以及是否存在其他的保护
机制，还有待进一步研究。
致谢：同济医学院基础部药理系各老师及顾军
同学给予的实验指导和帮助。
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万方数据
灯盏花素对谷氨酸体外诱导大鼠皮质神经元损伤的保护作用
作者： 熊哲， 张丽， 李彩莲
作者单位： 熊哲(华中科技大学同济医学院附属同济医院,药学部,湖北,武汉,430030)， 张丽(华中科技
大学同济医学院附属同济医院血液内科,湖北,武汉,430030)， 李彩莲(河南省中医学院附属
中医院,药剂科,河南,郑州,450008)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(6)
被引用次数： 1次

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引证文献(1条)
1.韩俊江 灯盏花素的器官保护功能研究进展[期刊论文]-天津药学 2011(5)


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