全 文 :野牡丹科(Melastomaceae)植物全世界约 240 个
属, 共 3 000余种[1]。 野牡丹属(Melastoma)属于野牡
丹科, 大约有 100 个种, 分布中心处于东南亚一
带, 中国有 9个种和 1个变种, 主要分布带处于长
江以南各个省区 [2]。 野牡丹属植物花色有白色系、
粉色系、 紫色系, 其花期长、 花量大, 株型从地
被、 灌木到小乔木均有分布, 园林运用上可做到周
年有花(花期: 地菍、 印度白花野牡丹四季开花,
展毛野牡丹 3~4 月, 紫毛、 多花、 细叶野牡丹、
毛菍 5~6 月份, 野牡丹、 毛菍 7~8 月), 具备良好
的观赏性状; 此外, 该属植物的药用价值近来也有
深入研究[3-4], 发展前景广泛。 目前, 绝大多数的野
牡丹属植物仍未被人工开发利用 , 已在野牡丹
属种质资源的收集及评价[5-9]、 栽培技术 [10]、 脱毒育
苗[11-13]、 传粉特性[14-15]以及种子发育[16]等方面进行了
研究。
目前, 针对野牡丹属的分类研究主要集中于宏
观形态学[16]、 细胞遗传学 [17]、 孢粉学 [18]、 细胞学 [19]、
表型多样性 [20-21]等方面, 利用分子标记对野牡丹种
质资源的遗传性进行研究还比较少。 郑涛等 [22]利用
ISSR 分子标记对福建省 33 份野牡丹属种质资源的
遗传多样性进行研究, 聚类分析表明, 34 份材料
热带作物学报 2016, 37(9): 1725-1731
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2016-01-10 修回日期 2016-06-15
基金项目 福建省自然科学基金面上项目(No. 2014J01116); 福建省公益类科研院所专项(No. 2014R1028-1)。
作者简介 陈振东(1966年—), 男, 高级农艺师; 研究方向: 园艺作物种质资源收集与利用。 E-mail: czd89@21cn.com。
%
利用 RAPD、 ISSR分子标记分析
野牡丹属亲缘关系
陈振东 1, 郑 涛 1, 林秀香 1, 林艺华 1, 郑少缘 2, 苏金强 1
1 福建省热带作物科学研究所, 福建漳州 363001
2 福建省莆田市湄洲湾北岸经济开发区住房和城乡建设局园林处, 福建莆田 351152
摘 要 采用 ISSR 和 RAPD分子标记技术对 9 个种 44 份野牡丹属种质资源进行了亲缘关系分析。 结果表明:
11 条 ISSR 引物共扩增出 91 条谱带, 其中多态性条带 90 条, 多态性条带的比率为 98.9%; 16 条 RAPD 引物共
扩增出 113 条谱带, 其中 101 条多态性条带, 多态性比率为 89.38%。 2 种分子标记相比较, ISSR 分子标记检测
出的多态性比率更高。 44 份野牡丹属种质明显聚为 2 组, 种质资源遗传相似系数在 0.61~0.88, 平均相似系数
0.75。 基于不同引物的条带组合构建了供试的 44 份野牡丹属种质资源的 ISSR 和 RAPD 指纹图谱, 采用这 2 种
指纹图谱可对供试的所有野牡丹属种质资源进行鉴定。
关键词 野牡丹属; 种质; 分子标记; 亲缘关系; 指纹图谱
中图分类号 S682.39 文献标识码 A
Analysis of the Interspecific Relationship of Melastoma
Germplasm Detected by ISSR and RAPD
CHEN Zhendong1, ZHENG Tao1, LIN Xiuxiang1, LIN Yihua1,
ZHENG Shaoyuan2, SU Jinqiang1
1 Fujian Institute of Tropical Crops, Zhangzhou, Fujian 363001, China
2 Housing, Urban and Rural Construction Bureau, The North Bank Economic Development Zone
of Meizhou Bay, Putian, Fujian 351152, China
Abstract ISSR and RAPD markers were used to assess the germplasm genetic diversity among 44 accesions (9
species) of Melastoma in this research. The results revealed that a total of 91 DNA bands were amplified by 11
ISSR primers, and 90 polymorphic bands, counting for 98.9%; a total of 113 DNA bands were amplified by 16
RAPD primers, and 101 polymorphic bands, counting for 89.38%. The polymorphism rate of ISSR was high. These
44 germplasm resources could be divided into two groups. Genetic similarity analysis showed that of the 44
Melastoma germplasm ranged from 0.61 to 0.88, with an average of 0.75. According to amplification bands by
different primers, the ISSR and RAPD fingerprint of 44 accesions of Melastoma was combined and constructed, and
all of accesions tested could be identified with this two kinds of fingerprints.
Key words Melastoma; Germplasm; Molecular marker; Interspecific relationship; Fingerprint
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.09.012
第 37 卷热 带 作 物 学 报
表1 野牡丹属44份供试种质资源
Table 1 44 individuals of Melastoma
种名 样品编号 采集地 种名 样品编号 采集地
野牡丹 Melastoma candidum
1 广西桂林
展毛野牡丹 Melastoma normale
6 福建永定
2 福建漳州 8 广西桂林
11 海南昌江 33 云南普洱
34 福建长泰 38 广东广州
35 海南儋州 39 福建武平
37 云南版纳
地菍 Melastomadodecan drum
15 福建龙岩
多花野牡丹 Melastoma affine
5 广东广州 16 福建永定
10 海南昌江 17 福建平和
14 福建华安 22 福建平和
18 福建永春 23 福建清流
19 福建武平 24 福建冠豸山
20 福建武平 25 福建武平
27 福建福州 26 福建武平
28 福建福州
细叶野牡丹 Melastoma intermedium
9 福建漳州
29 福建福州 21 福建武平
30 海南儋州 40 福建武平
31 海南儋州 41 厦门野山谷
32 云南版纳
毛菍 Melastoma sanguineum
3 海南五指山
36 福建华安 7 广东广州
42 云南普洱
紫毛野牡丹 Melastoma penicillatum
12 海南昌岭
43 云南普洱 13 海南昌岭
印度野牡丹(白花)
Melastomamalabathricum var. alba
4 广东广州 大野牡丹 Melastoma imbricatum 44 福建漳州
可划分为 3个类群 5个亚类, 主坐标散点分析可分
为 4 个类群, 这与根据形态学划分的结果基本一
致。 野牡丹属因为分布范围广、 自然杂交类型丰
富, 一些野生种质的分类尚未十分明确, 给人工杂
交亲本选择带来了不少困扰。 因此, 本研究在前期
研究的基础上扩大了取样范围, 以中国的 44 份野
牡丹属种质为研究对象 , 利用 ISSR 和 RAPD 分子
标记技术, 再次从分子水平上探讨野牡丹属内的亲
缘关系, 为有效利用分子标记评价野牡丹属种质资
源遗传多样性及遗传基础提供理论依据, 同时, 利
用筛选出的通用引物构建 44 份野牡丹属野生种质
资源的 RAPD、 ISSR 指纹图谱, 为野牡丹属野生
种质资源快速鉴定及后期人工选育种亲本选择提供
理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究供试材料为野牡丹属野生种质资源共 9
个种 44份材料, 来源于福建、 广东、 广西、 海南、 云
南 5个省份。 采集新鲜叶片冻于液氮, 保存在-80℃。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用前期试验确定的改良CTAB
法提取野牡丹基因组DNA, 通过1%琼脂糖凝胶
电泳检测, 并用分光光度法定量后 , -20 ℃保存
备用。
1.2.2 PCR扩增 ISSR-PCR反应体系的建立 :
DNA模板(30 ng/μL)0.7 μL, 10×buffer 2 μL, dNTPs
(10 mmol/L)0.6 μL, 引物(10 μmol/L)0.8 μL, Taq 酶
(5 U/μL)0.1 μL, ddH2O定容 20 μL。 反应程序: 反
应程序: 94℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min; 53℃
退火 40 s; 72℃延伸 2 min。
PAPD -PCR 反应体系的 建立 : DNA 模板
(20 ng/uL)1.5 μL, 10×Taq Green Buffer(含 Mg2+)
2 μL, 引物(10 μmol/L)0.7 μL, dNTPs(10 mmol/L)
0.4 μL, Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.3 μL, ddH2O
定容 20 μL。 反应程序: 94 ℃预变性 5 min; 94 ℃
变性 1 min, 38 ℃退火 40 s, 72 ℃延伸 2 min, 45
个循环; 最后 72℃延伸 5 min, 4℃保存。
1.2.3 引物筛选 从 116 条 ISSR、 100 条 RAPD
随机引物中分别筛选出 11 条、 16 条多态性好、 条
1726- -
第 9 期
表2 ISSR随机引物序列
Table 2 Primer sequence of ISSR
引物编号 引物序列(5′-3′)
CW32447 ACACACACACACACACG
CW32451 ACACACACACACACACYA
CW32488 GGAGAGGAGAGGAGA
CW32506 TCTCTCTCTCTCTCTCC
UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC
UBC820 GTGTGTGTGTGTGTGTC
UBC821 GTGTGTGTGTGTGTGTT
UBC841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC
UBC842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG
UBC848 CACACACACACACACARG
UBC857 ACACACACACACACACYG
表3 RAPD随机引物序列
Table 3 Primer sequence of RAPD
编号 引物序列(5′-3′) 编号 引物序列(5′-3′)
S1 GTTTCGCTCC S43 GTCGCCGTCA
S6 TGCTCTGCCC S60 ACCCGGTCAC
S10 CTGCTGGGAC S68 TGGACCGGTG
S13 TTCCCCCGCT S69 CTCACCGTCC
S19 ACCCCCGAAG S72 TGTCATCCCC
S24 AATCGGGCTG S76 CACACTCCAG
S28 GTGACGTAGG S92 CAGCTCACGA
S36 AGCCAGCGAA S95 ACTGGGACTC
带清晰的引物供 PCR 反应(表 2、 表 3)。
1.3 数据处理
根据 2 种分子标记方法通过 PCR 反应扩增出
的条带图片, 对同一引物所扩增出迁移率相同的条
带计为 1个位点, 有条带的位置计为 “1”, 无条带
位置计为 “0”, 所得数据输入 Excel 2003 工作表
建成原始 “0/1” 数据矩阵, 利用 NTSYS 聚类分析
软件进行聚类分析。 针对所有供试品种, 对 11 条
ISSR 引物和 16 条 RAPD 引物扩增出的条带进行比
对, 选出鉴别能力较强的引物, 然后对由这些引物
经 PCR 反应跑出的电泳条带进行形象化处理, 同
一位点上记为 “1” 的电泳条带用黑色方块表示,
记为 “0” 的条带用白色方块表示, 据此构建出供
试的 44份野牡丹属种质资源的 DNA 指纹图谱。
2 结果与分析
2.1 ISSR分子标记结果与分析
本研究以前期试验筛选出的 11条 ISSR 随机引
物对供试的 44份野牡丹属种质资源进行 DNA 多态
性检测 [16], 总共扩增出 91 条清晰度好, 重复性高
的谱带, 其中多态性谱带有 90 条, 多态性条带比
例为 98.9%(表 2)。 扩增结果表明, 扩增位点最多
的引物为 UBC857 、 UBC811 和 CW32506, 位点数
均为 12 个。 其中引物 UBC857 对 44 份野牡丹属种
质 DNA 的扩增图谱见图 1。
2.2 RAPD标记结果与分析
16 条 RAPD 引物共扩增出 113 条谱带, 其中
101 条多态性条带, 多态性比率为 89.38%。 扩增
产物大小集中在 2 00~2 000 bp。 扩增位点最多的引
物是 S1、 S19、 S43, 位点数均为 9。 其中引物 S19
对 44份野牡丹属种质 DNA 的扩增图谱见图 2。
2.3 44份野牡丹属种质亲缘关系分析
综合 44 份野牡丹属种质 ISSR 和 RAPD 扩增
条带数做聚类分析, 聚类结果见图 3。 可将供试野
牡丹属种质资源分为 2 大类群。 3 号毛菍与其他各
地的地菍聚为Ⅰ类; 其他 36 份野牡丹属种质聚类
Ⅱ类。 Ⅱ类野牡丹属种质较多, 可细分为 3 组, 1
组为 1 号、 2 号、 4 号、 5 号、 6 号、 7 号、 8 号、
10 号、 9 号、 12 号、 11 号、 18 号、 13 号、 19 号、
21号、 20号、 33号; 2组为 30号、 31号、 32 号、
34 号、 35 号、 36 号 、 37 号、 38 号 、 39 号 、 40
号、 41 号、 43 号、 44 号、; 3 组为 14 号、 27 号、
28号、 29号福建多花野牡丹与 42号云南普洱的多
花野牡丹。 44 份野牡丹属种质资源遗传相似系数
在 0.61~0.88, 平均相似系数为 0.75, 表明 44 份野
牡丹属种质之间的亲缘关系较近。
2.4 44份野牡丹属种质指纹图谱的建立
由于 ISSR 引物的多态性, 同一引物扩增出的
44 份野牡丹属种质资源的条带有明显差异。 比对
结果表明: 利用引物 UBC811 可以鉴别出 38 份野
牡丹属种质资源, 利用引物 UBC851 可以鉴别出
42 份野牡丹属种质资源, 而采用引物 UBC811 和
UBC857 组合可以鉴别出供试的 44 份野牡丹种质
陈振东等: 利用RAPD、 ISSR分子标记分析野牡丹属亲缘关系 1727- -
第 37 卷热 带 作 物 学 报
M: 分子量标记; 1~44 : 不同材料的ISSR-PCR结果, 材料编号同表1。
M: DNA marker; 1-44 : See the No. in Table 1.
图1 UBC857引物对44份供试样品的ISSR图谱
Fig. 1 ISSR profi les of 44 samples by primer UBC857
bp
100
250
500
750
1 000
2 000
100
250
500
750
1 000
2 000
bp
M: 分子量标记; 1~44: 不同材料的RAPD -PCR结果, 材料编号同表1。
M: DNA marker; 1-44: See the No. in Table 1.
图2 S19引物对供试样品的RAPD图谱
Fig. 2 RAPD profi les of 44 samples by primer S19
bp
100
250
500
750
1 000
2 000
bp
100
250
500
750
1 000
2 000
bp
100
250
500
750
1 000
2 000
1728- -
第 9 期
图3 基于ISSR和RAPD扩增条带的44份野牡丹属种质聚类图
Fig. 3 Dendrogram of cluster of 44 Melastoma germplasm analysis by ISSR and RAPD bands
遗传距离
1
2
9
11
4
5
7
6
8
33
10
12
13
18
19
20
21
30
31
43
44
32
34
35
37
39
38
36
40
41
14
27
28
29
42
3
25
15
23
24
22
26
16
17
0.61 0.65 0.68 0.71 0.75 0.78 0.81 0.84 0.88
图4 基于引物UBC811和UBC857扩增结果的44份野牡丹属种质资源基因组DNA的ISSR指纹图谱
Fig. 4 ISSR fingerprint of genomic DNA of 44Melastoma germplasms based on amplification result by primers UBC811 and UBC857
U8
11
U8
57
陈振东等: 利用RAPD、 ISSR分子标记分析野牡丹属亲缘关系 1729- -
第 37 卷热 带 作 物 学 报
资源。
从筛选 16 条 ARAPD 引物中选择多态性好 、
鉴别效率高的核心引物 S19 和 S43, 建立 44 份野
牡丹属种质资源的指纹图谱(图 5)。 利用引物 S19
可以鉴别出 30 份野牡丹属种质资源 , 利用引物
S43 可以鉴别出 29 份野牡丹种质资源, 而采用引
物 S19 和 S43 组合可以鉴别出供试的 44 份野牡丹
属种质资源。 由图 5 可知, 利用 2 条 RAPD 核心
引物可建立 44 份野牡丹种质资源的指纹图谱, 每
个品种都有唯一的指纹图谱。
S1
9
S4
3
图5 基于引物S19和S43扩增结果的44份野牡丹属种质资源基因组DNA的RAPD指纹图谱
Fig. 5 RAPD fingerprint of genomic DNA of 44 Melastoma germplasms based on amplification result by primers S19 and S43
3 讨论与结论
3.1 分子标记用于野牡丹种质的遗传变异研究
采用 ISSR分子标记研究 44份野牡丹种质的遗
传变异情况, 10 条 ISSR 引物共扩增出 91 条带,
其中多态性条带 90 条, 多态性比率 98.9%; 采用
RAPD 分子标记对 44 份野牡丹种质的遗传变异进
行研究, 16 条 PAPD 引物共扩增出 113 条带, 其
中多态性条带 101条, 多态性比率 89.38%。 可见,
2 种分子标记均可检测出野牡丹种质资源间较为丰
富的遗传变异; 但比较起来, ISSR 分子标记检测
出的多态性比率比 RAPD 分子标记检测出的高。
采用 ISSR 分子标记研究野牡丹属种质间的遗传变
异, 其多态性位点的百分率为 98.9%, 高于新疆红
花(Canluumts tinctorius)[21]品种间的 93.77%、 菊花
(Dendranthema×grandi flora)[22]品种间的 92.5%和君
子兰 [23](Clivia)品种间的 81.95%; 采用 RAPD 标记
研究野牡丹种质的遗传变异, 其多态性位点的百分
率仅为 89.38%, 接近于亚麻(Linum usitatissimum)[24]
品种间的 90.49%, 高于石蒜(Lycoris Herb.)[25]品种
间的 70%, 低于红花(Canluumts tinctorius)[21]品种间
92.31%。 2 种分子标记遗传相似性分析结果表明,
野牡丹属种质间的遗传相似系数 0.61~0.88 之间,
表明 44份野牡丹属种质资源之间亲缘关系较近。
3.2 野牡丹属种质的遗传变异分析
与之前的研究结果[22]对比, 本研究扩大了取样
范围, 从外观形态上判断, 增加了《福建植物志》以
外的3个种(紫毛、 印度、 大野牡丹)进行比较分析,
得到较为全面的分析数据。 本研究 2种分子标记方
法都将地菍单独聚为一类, 这与先前的研究结果 [22]
相同, 表明地菍与其它种间的亲缘关系相对较远,
在自然杂交过程中的参与度较低; 4 号印度白花野
牡丹是印度野牡丹 (Melastoma malabathricum, 粉
色花)的变异种, 研究结果将其与 5 号广州多花野
牡丹聚在一起, 说明二者在亲缘关系上非常接近。
研究结果也发现, 通过形态学观测很难准确的将野
牡丹属中的几个种进行区分, 甚至发生错误分类,
1730- -
第 9 期
例如, 44 号大野牡丹叶片、 花瓣显著大于其他样
品, 形态特征与大野牡丹类似, 通过形态学分类很
容易将其归为大野牡丹类, 而标记结果则表明其应
为多花野牡丹类群; 32 号云南版纳的多花野牡丹
应为野牡丹类群; 37号云南版纳的野牡丹, 与 38、
39 亲缘关系最近, 兼有野牡丹、 展毛野牡丹的特
征, 因此将其归为展毛野牡丹更为准确。 另外, 野
牡丹属亲缘关系远近不但与种的类别有关也与地域
分布存在一定关系, 相同来源地的野牡丹属植物因
种间差异可能亲缘关系较远, 如 10 号与 12、 /13
号, 而不同来源地的植物因种间差异较小可能被聚
为一类, 如 30、 /31 号, 这也说明多花野牡丹种内
存在比较明显的基因分离现象, 遗传背景比较复
杂。 从本研究的样品分析来看, 地菍具有较强的遗
传稳定性, 其余野牡丹属种间、 不同来源地的同种
植物存在明显的基因交叉, 再次证明了前期研究得
到的野牡丹属植物 “遗传背景复杂、 自然杂交类型
丰富、 亲缘关系总体较近” 的结论。
本研究分别筛选出 2 条特异引物建了供试的
44 份野牡丹属种质资源的 ISSR 和 RAPD 指纹图
谱, 采用这 2种指纹图谱可对供试的所有野牡丹属
种质行鉴定, 为利用分子标记技术快速、 准确地鉴
定野牡丹属资源奠定基础。
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责任编辑: 赵军明
陈振东等: 利用RAPD、 ISSR分子标记分析野牡丹属亲缘关系 1731- -