全 文 ：上海农业科技 2 4 00一 2
利用 R AP D 推测宝山香抽与
其他柑橘属品种间的亲缘关系
明 凤 任志军 王敬文 梁 斌 郭 滨 沈大棱
(复旦大学生命科学学院遗传学研究所 ,遗传工程国家重点 实验室 ;
复旦大学生命科学学院生物 多样性科学研究所 , 生物多样性与生态工程教育部重点实验室 20 43 3)
ùwnGCTAu…一Wr脚旅57398溯S洲0124哪ù一CGATm512肠8518204必3S翎洲泌7双6
香袖 (香椽 ) ( a t、 a “ ar nt iu m L . ) (当地农民称谓 )是
上海市宝山区长兴岛和横沙岛上一种属柑橘类 (芸香科 , 柑
橘属 )的优良树种 ,适宜作行道果树 、 公园装饰树种 、城市小
区绿化或生态林优势种群。 其园艺性状优势 : ( 1) 树干挺拔 ,
四季翠绿 ,易与其他树种混种 ,形成森林生态系统 ; (2) 每年
五一节前后是盛花季节 ,满树白花 ,香气怡人 ,树叶散发的气
体具有净化空气的作用 ; ( 3) 成年树金色硕果 , 由于果酸 ,枝
条有刺 ,不易失窃 ,总挂果时间长达半年 (从国庆节可持续到
春节 ,满树金黄色果子 ) ,每个果实直径达 10 一 12 cnr ,沿道路
两旁形成一条美丽的风景线 ; (4 )果实虽有酸味 ,加工后仍可
食用 ,干果为中药材 ; ( 5 )树种抗病性强 ,无致命病虫害 。 故
该品种具有一定的绿化树种与商业开发的应用价值 。
为重视上海地方特色品种的应用 ,本研究以宝山两岛种
植的香袖品种为材料 ,同时收集上海与浙江两地种植的芸香
属品种与砧木进行 R AP D 分子鉴定 ,确定宝山香袖的特色和
纯正性 ,以区别于其他芸香属物种或品系。 为建立上海优良
地方种质资源宝山香抽锁定指标 ,为种质鉴定和保护上海种
质资像均具有重要的意义 。
1 材料和方法
1
.
1 材料 本研究所采用的 2 个品种 ,来自上海市宝山区
长兴岛和横沙岛与浙江省种植的芸昔属品种与砧木 (见表
l )
。 新鲜叶片保存在超低温 一 80 ℃冰箱中备用 。
表 1 分析品种的名称与取样地点
编号 品种名称 拉丁文或属性 采集地
1 香袖母树 一种酸祖 横沙岛
2 香袖子树 一种酸祖 横沙岛
3 香抽子树 一种酸橙 长兴岛
4 代代 青橙 ,属芸香科 金华
5 胡抽 at 、 梦 . 几己滋” U朋 金华
6 雄洛哥酸橙 tQ 、 ~ 川￡二 U n
. 黄岩
7 构头橙 为本地荆早枯和甜橙砧木 黄岩
8 权 月用 d 月“ t润砚白te L灿 黄岩
9 小红橙 为温州蜜柳甜橙与红枯l柠裸砧木 黄岩
10 权授 权与橙杂种 .为脐橙 /橙 /蜜柑与袖类砧木 黄岩
1 高橙 at 、 五一 黄岩12 巨州香抛 抽类砧木 玉环
13 本地早 C翔朋 耐妇山山 B b叮 ca 黄岩
14 文且抽 芸香科柑枯属 ,又称抽子 玉环
巧 横沙抽 (大) 份、 g 川冷己动 L让口 横沙岛
16 金佛手 香祖变种 Q ￡邝 州曰五必 U n 金华
17 凯旋柑 柑 at 二 侧应浏勿花 日朋“ 金华
18 宫内伊予柑 柑 Q t二 侧应沈山 J e 日~ 黄岩 (日本 )19 浙江天草 橙 G t r翻比 :
~
横沙岛
20 美国脐橙 脐橙 at 、
~
金华 (美国 )
21 满头红 桔 Q t r 泊比 心仓翻如翻 日朋叨 长兴岛
2 沮州奔枯 情 q 二 耐短。 ` 心 玫~ 横沙岛
心 10 im n ,取上清液 ,加人等体积的酚 :抓仿 :异戊醇 ( 25 : 24 :
l )
,
12 0 Or/而 n 离心 10 而 n ,取上清液 。 加人等体积的抓仿 :
异戊醇 ( 24 : 1 ) , 重复上述步骤 。 上清液 中加人等体积异丙
醇 , 混匀 , 室温放置 15 一 30 而n 。 12 00o lr 而n 离心 15m in ,弃
上清 ,加人 2 0 讨花 (含 RN as e) 。 在 65 ℃水浴中 ,消化 R N A
h1
。 再加人等体积 的酚 : 氯仿 : 异戊醇 ( 25 : 24 : 1 ) ,混匀 。
12 000 r/
1l l i n 离心 10nu
, 提 取上清液 , 加人 1 /10 V 的 3mo l
N 乙A c , 二倍体积 的无水 乙醇 , 混匀 , 一 20 ℃沉淀 30 而no
12 0 0 r/而 n 离心 10 而 n , 去上清 , 4℃ 预冷的 70 % 乙醉洗两
遍 ,干燥 。 最后用 T E 溶解沉淀 ,于 一 20 ℃冰箱中保存备用 。
1
.
3 试剂 P C R 反应所有试剂与随机引物均购自上海生工
生物有限公司 。 采用的 39 条随机引物名称与核昔酸序列
(见表 2 ) 。
衰 2 3 9个随机引物及其序列
序号 5 ’ 一 3 ’序列 序号 5 ’ 一 3 ’ 序列
1
.
4 方 法 以 2 2 个柑橘属不同品种的 D N A 为模板 ,反应
程序 94 ℃ 预变性 3而n 后 , 经如 下 45 次循环 : 92 ℃ 变性
1而 n , 3 8℃退火 1而 n , 72 ℃延伸 Zm in ;最后 72℃延伸 10而 n 。
代艾之反应产物经 1 . 5%琼脂糖凝胶 70 V 电压下电泳 h4 ,凝胶
成像仪观察并拍照 。
1
.
5 数据分析 据 N ie 等 ( 197 9) 的相似率计算公式进行分
析 , 以 P CR 产物电泳后在凝胶的某一多态位置上有 D N A 条
带为 “ 1” ,无 D N A 条带为 `℃” 。 采用 N ST Y S沐 ~ ion 2
.
0
1
.
2 D N A 的提取 用液 N 研磨叶片 ,加人 65 ℃水浴预热的
SD S 提取液 ,于 65 ℃水浴 h1 ,期间不时摇动 。 12 00() r/ ~ 离 收稿 日期 : 20 3 一 9一 2
上海农业科技 2 ( 0 )4 一 2
( Rh olf
,
19 8) 计算个体间相似性 ,根据 U F G M叭 以 Ja e ca dr 相 量 、 直径与气味指标及生理指标进行了测定。 品种间在果实
似性系数进行聚类分析 ,绘制出系统聚类图。 特征 ,如囊的形状 、囊的数目 、种子数或有无 、皮厚 、核的有无
2 结果与分析 等差别很大 ,这与其从属于芸昔科不同属或柑橘属中的不同
2
.
1 不 同品种果实形 态的差异比较 因取材时间缘故 ,对 种有关 ,除积外 , 其他所分析的栽培品种则分别从属于橙 、
所分析的 2 个品种 , 只有部分品种获得果实。 对果肉颜色 、 桔 、抽 、柑的不同种类 。 因而在性状 、 果味 、颜色 、 生理指标上
单果囊数 、油胞 、 皮厚度 、 单果种子数 、 肉质 、果肉重 、 果实质 具有明显的差异 (见表 3) 。
表 3 果实形态指标与生化指标的魂定
品种 鑫鑫。 , 蠢老麟 甲撬 肉` 刹黔露蓄厂撇 。,翻撬) 幕君朗 譬 悲 憋 气。 ` 面
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橙色 ,扁圆 ,表面粗桩 ,果底徽凹
扁圆 .搜红色 ,表圈粗位 .果底徽凹
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郁 离扁圆形 ·授黄色·表面光流果底徽魏黑蹂护色 , , 面粗” 有 ,数熟淤不 , ·表面光 , .有 , 色
搜黄色 .离圈 ,表面粗橄 ,个小 .果底平
扁圆 ,黄绿色 ,表面光滑 .果底平
黄色 . 果实扁画 .表面光漪 .果底徽凹
似佛手 ,表面光淆 ,黄色
韶嚼美叙寰韶铲皮较。 . 易
果实扁圆 . 橙色 ,表面光滑 .果底平
高画形 ,橙黄色 ,表面光滑 ,果底徽凸
红色 ,果实扁圆 ,表面光份 .果底徽凹
封干舒臀。翼升巡29750137052087.591,0.2483叨时黄欲白触橙敬1Oéù一.ō性渊麟鹊翻赞!裔ō。?ù恻髓臀ù
2
.
2 模板 DN A的提取 采用柑橘 D N A提取缓冲液 ,经两
次 D N A 纯化 ,可除去大量的糖分与蛋白质 ,保证 D N A 达到
P CR对模板的质量要求。 提取出的 2 个不同柑橘品种基因
组 D N A (见图 1 ) 。 M公k er 为 孟D叫片 / E由尺 I + iH dn 川 ,最大
片段碱基数为 23 kb 。
图 2 香抽与其他柑栩种的 RA P D 扩增产物电泳圈谱
A : 引物 59 4 的 R A PD 图谱旧:引物 印0 的功切D 图谱
圈 1 不同柑栩品种基因组州A 电泳圈谱 2 . 4 不 同品种间的遗传距离分析 据 N ie 等的相似系数公
2
.
3 随机引物筛选及扩增结 果 在选用的 39 个随机引物 式 ,计算出柑橘属不同品种间的遗传距离 (见表 4) 。 其中香
中 ,筛选出重复性好 , 条带清楚且多态性丰富的 30 个引物用 袖母树 (横沙岛 )与香抽子树 (横沙岛 )的距离最小为 0 . 0 175 。
于柑橘属不同品种 凡护D 分析。 部分引物扩增结果(见图 2) 。 而横沙袖 (大 )与积 (黄岩 )的遗传距离最大为 0 . 1327 。 据
裹 4 香抽与其他芸香科品种间的遗传距离分析
2 1 2
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上海农业科技 2 0 0 4一 2
常规粳稻型非 F l优势系列特种优质超级稻
品种选育是实施高效农业的有效途径
许盘甫 钱中华 唐甫林 董欣瑛 吴荷青
(江苏省无锡市滨湖区南泉镇中国南方水稻非 F, 优势研究中心 21 41 26 )
常规粳稻型非 1F 优势系列特种优质超级稻品种的选育
是确保农业增效 、农民增收 、 国家粮食安全的根本保障。
1 常规粳稻型非 F ; 优势系列特种优质超级稻品种的选育
系列特种优质超级稻品种选育 , 是建立在 “ 锡御糯 ”具有
半矮生性的遗传规律和釉粳衍生系性状的基础上 。 把 “ 锡御
糯” 同各优质粳稻品种杂交 、 复交 , 经系统选育 ,育成特种优
质香梗为主体的各种类型的特种优质稻米品种 。 这类品种
经理想株型 + 优势整合 ,成为非 F , 优势的超级稻品种 ,较常
规梗稻亩产增 10 吨左右 。
我们在敢为人先 、 敢冒风险 、 勇于创新的精神鼓舞下 , 在
水稻育种领域有所发现 ,不断完善 ,开创了以 “ 锡御糯 ” 为杂
交的核心亲本 , 同各类优质粳稻品种进行杂交 、 复交 、 回交的
技术路线 , 初步育成了系列特色的优质超级稻品种 , 从中取
得了五个发现 。
1
.
1 五个发现
1
.
1
.
1 发现 “锡御糯 ” 品种属粕粳衍生系类型 , 通过杂交 、复
交 ,利用粕梗基因 ,加大了内部重组的矛盾 , 这是创造优势的
基础 。
1
.
1
.
2 发现 “锡御糯 ” 为具有 “ 半矮生性 ” 遗传性状的品种 。
通过杂交 、复交 , 能创造理想株型 。
1
.
1
.
3 发现粳糯稻品种内杂交的遗传规律为不完全显性规
律 ,故在 瓦 代即可分离出粳株 、 粳糯分离株 、 糯株 , 加速了
粳 、糯品种选育的进程 。
1
.
1
.
4 发现黑白米品种间杂交的遗传规律为显性规律 。 是
否纯黑米株 ,须在 玩 代方可正确鉴别 。 加速了黑米品种选
育进程 。
上山母云仪止体.洛生、J呀l二
收稿日期 : 2 0 3 一 1 一 4
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d 相似性系数和 U P G M A 聚类分析 ,绘制出系统聚类图
(见图 3 ) 。
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为进一步提高上海农业生产水平 ,加快上海优良地方种
质资源创新进程 ,发展上海种源农业 , 以宝山两 岛种植的香
袖为主要材料 ,对上海与浙江两地其他主栽的芸香科农家品
种与砧木进行收集 ,共获得 2 个品种 (含两岛香袖母子树 ) 。
由于 17 号样品 “凯旋柑 ” (金华 )在多数引物扩增后都无条
带 ,因此不对该物种进行亲缘关系的研究 。 21 个 品种的
R气PD 分析结果 : 以相似系数 0 . 31 为标准 ,可将 21 个品种分
为 9 个相似类群。 与其他品种间遗传关系最远的积 ( )Z , 因
为它从属于不同的属 , 为 P〔)n c iusr 属 , 而其他全部属于柑橘
属的不同种 ;其二为金佛手 ( 6 tusr l刀叔艺ca ~ t es L
.
;) 具有
相似类群的三个较大类群 , 如浙江天草 、 美国脐橙 、满头红与
温州蜜桔 , 基本为桔类品种 ; 高橙 、 文旦袖与宫内伊予柑 , 基
本为袖类品种 ;横沙香袖 (母树与子树 ) 、小红橙 、 代代 、摩洛
哥酸橙 、本地早与胡袖 , 基本从属于橙类。 其他的从属于培
育柑桔品种的优良砧木 (代代 、 摩洛哥酸橙 、 构 头橙 、 小红
橙) ,说明这些砧木亲缘关系较近 ,体现出作为砧木的遗传特
异性的保守性 ;根据分析结果 ,横沙香袖与橙类品种有较相
近的遗传关系 , 可初步判断该品种也许从属于橙类品种 。 具
体从属于何种亚种 ,仍有待于形态与生化指标的综合判断 。
需要指出的是 , 宝山长兴岛上的香袖 (当地农民称谓 )与
横沙岛上的香袖品种的亲缘关系很远 , 解释理由如下 : ( 1) 对
于栽培被称为香袖的树种 , 两岛间没有互相移栽的记录 ,并
非从一地移植到另一地种植 。 因此两者间存在遗传本质上
明显的差异是情理之中 。 故当地农民的称谓仍需探究其合
理性与科学性 ; ( 2) 对于一些理化指标的分析 , 进一步证明我
们分析结果的正确性 , 通过对果实重要生理指标的测定 , 对
于总酸量香袖子树 (长兴岛)酸度明显低于香抽母树 (横沙 ) ,
分别为 54 . 74 与 35 , 2 4 (刁吨 ) 。 而维生素含量正好相反 , 前
者为 61 . 0 而后者为 41 . 0 7( n 1创10 9 ) 。 也许是长兴岛的香
袖子树已经与当地种植的其他芸香科品种进行遗传信息传
递 , 自身的遗传特异性发生变化。 根据上述分析结果 ,建议
上海市科委与市政府应该加强对宝山横沙岛香袖的遗传纯
正性的保护 ,才可达到或实现拥有上海特色的优良品种 。 今
后将对不同地理位置的横沙香袖进行取样 ,分析种类遗传多
样性 , 为就地保护与基因库的保护提供理论依据 。
一 1 7 一