全 文 ：曰汉il千丁ù5实 生 物 学 一 1. 3 7 . N u . 3
l一 1, 、 2 0 04
S伙e r1XEea
第 3 7 卷 第 3 期
2 0 0 4 年 6 月 A (生a Bi
验
0
1
0拜
沙打旺与首藉属间体细胞杂交 ’ 卜
金 红 ’ 2 贾敬芬 ”
西北大学生物技术省级重点实验 室 , 西安 7 l() 0 6 9
都建国 ’
2 深习11市了{11湖植物 园 . 深 )J l{ 5 18 0 0 4 )
摘要 以豆科牧草沙打旺为一亲本 ,碘 乙酞胺 处理的 紫花首着发根农杆菌 A ; 菌株转化 系为另一 亲
本 , 通过 P E C 一高 p H , 高钙 法诱导原 生质体融合 _ 在不 加 外源激素的 D P D 培养基上有效地筛选 了杂
种 细胞 经培养首次得到沙打 旺 (+) 紫花首着的属 间体 细胞杂种 尽管双 亲原生质体均 已 丧失 分化
植株的 能力 ,但杂种细胞系 R I 仍得到苗的 分化 几 杂种 R : 细胞的 染色体数检查 、 冠瘤碱检侧 、 同工酶
和 R A P D 分析结果 , 都证实 了其杂种特性 ,
关键词 : 沙打旺 紫花首蓓 原生质体融合 体细胞杂交
豆科牧草 中含硫氨基酸 含量偏低 , 而动物的毛
发主要 由含硫 氨基酸 含量较 高的不溶性纤维蛋 白
。 一角蛋白组成 , 因此 , 提高植物 含硫氨基酸的含量 ,
对于改 良豆科牧草 的营养品质 , 进而提高动物毛发
的产量和品质有重要意义 卜 沙打旺是豆科蝶形花亚
科黄蔑属 多年生草本植物 , 因其耐旱 、耐膺 、抗风沙
而得名 沙打旺有很强的固土能 力 ,但结 实率低 川 -
与有牧草之工美誉 的紫花首藉 ( 豆科蝶形花 亚科首
信属 )相 比 ,其 固氮能 力相对较弱口 「 通过 原生质体
融 合 , 可能避 免有性不 亲合性 障碍 , 获得兼有两者
优 良性状的豆科牧草 。 本研究采用 PE G一高 p H ,高
C a 法诱导沙打旺 与发根农杆菌介导的紫花首希转
化 系之间的原生质体融合 , 以期得到体细胞杂种
有关 沙打旺 与首楷属 间体 细胞杂交的研究 至今 未
见报道 。
材料和方法
L l 材 料
用 本 室 筛 选 的 沙 于v` 旺 (A 、 t r a g a lu s a ( l s t] ` .g e , 1弓
aP l
.
)抗乙硫氨酸变异系 (A U 愈伤组织 )为 亲本 ,无
分化能 力 ,紫花首藉 (M e成 c 口召U S以 iva L . )发根农杆
菌 A 4 ;(4 邵ol) 、 te ir u m hr 兹oge ne 、 A 4 )菌株转化系 (M A 4 )
为另 一 亲本 , 它具有激素 自主性 , 在无激素培 养基
上能够生 长 ,也无分化植株的能力
L Z 原生质体诱导融合
1
.
2
.
1 原生质体的分离和收集
M A
4 原生质体的游离和收集 , 参照我们已报道
的方法 ” ’ A E I一 的原生质体游离和收集见 Luo an d J ia
的方法 “ ·
1 2 2 首希转化系 M A 4 原生质体的碘乙酞胺预处理
在 4℃ 、 黑 暗条 件下 , 分别用 1 0 、 .2 0 、 5 . 0 或
10
.
( )
: , i , 1、 0 1/ I 石典乙 酸 ! I安 ( I( 、 ( 1. , a (· e t : 、 ,、 11〔 Ie , I ( ) A ) 溶液
(配 于 C PW 13 丫吝液 5 中 , 并将 L「露醇浓度降低至 10% )
处理紫花首精 M 入4 原 ` {一质体 10 1 11: , 然后离心收集
原生质体 沮 j C o C I: 洗液 ( ( ) . 16 ,、飞、 ) l / I C a C I: · 2 H 2 ( ) +
。 . 1% M 卜5 1) H5 . 8 )离心 i先涤 2 次 , 并悬 浮 一 f 其 中备
用
1
.
2
.
3 原 ` } )贡体 i秀份融 台
将纯 化 的两 种亲 本原 生质体均 息浮 J (认1C 2
洗液 (成分同上 ) 中 , 密度均调格至 10 5八 1 左石一 然
后 以等量混 合 原 ’ l一质体混合液用吸管吸出 , 滴到
直径 6 〔 · r l l 的培 养朋_ 底部 , 呈分隔开的小液滴 静 置
约 2( )l 11 , l , 使原 ` L质体附贴于培养洲. 底部 在每相
邻两小液滴之问 小心滴加 P (E 子融合液 , 并使液滴
之 间连 i亚 P EC 融 合液 的组 成 为 : 35 % 聚乙 二 醇
( I
, E G
,
M W = 6 0 0 0 )
,
}l付加 l ( )m , 1 1. , l / I ( ; : , C I: · ZH ZO ,
0
.
7 , , 1 11 1。 I月二 K l一 12 1” () 、 , ( ) . 1 , l ,` ) I/ l 一11梨醇 , f ) H 5 . 8 。 在
融合液 中于室 温下静 异 10 m in 后 , 在液滴边沿缓
慢 Jzf J人 111 11高 r , L于高 钙洗液 , 10 , n i , 1 后 , 再力lr人 l ; , 11
高 p H 高钙洗液 如此操作 4 一 5 次 , 直至倒置显微
镜下观察时 , 原牛质体恢 复呈圆球形 、 高 p H 高钙
洗液 的全[}_ 成 为 0 . 2 n l o l / L C a (N ( ) : ): 配于 I〕H 10 . 5 的
本 义 2 0 () 3 年 日 月 3 1二l收到 2 00 4 年 l 月 2 () FI 接受
本 l _ 作 为国 `家自然科 学基金资助」负 ! } ( 闪《 , . 3 0( )7( )3 6 (j)
i山讯 f介二者
ō/一,、一金 红 贾敬芬 郝建 国
.0 0 5 m ol / 卜 N a O H 一 甘氨酸缓 冲液 中 。 室温放置 l h ,
缓慢吸出所有液体 , 培养皿 底部贴 附的原生质体
先用 C o CI : 洗液洗涤两次 ,再用选择培养基洗涤两
次 ,最后加人 Z m l 新鲜 的选择培养基培养 。 选择培
养 基 为附 加 0 . 3m ol / L 一甘露 醇 , 2% 蔗 糖 , 5 0 Om g / L
水解酪蛋 白的 D PD 培养基 ’ “ , p H 5 . 8 。 若吸出的上
层液体仍含有原生质体 , 可通过离心 收集 , 再放人
另外的培养皿中培养 。
试验 同时以下列组合作为对照 。 ( 1) 经过 oI A 处
理的首藉 M A 4 原生质体培养 ; ( 2) 未经 OI A 处理的
菌蓓 M A 4 原生质体单独培养 ; ( 3) 沙打旺 A rE 原生
质体单独培养 ; ( 4) 未经诱导融合的双亲原生质体
混合培养 ; ( 5) 融合处理后 的首藉 M A 4 原生质体培
养 ; ( 6) 融合处理后的沙打旺 A E f 原生质体培养 。 融
合物 与对照皆用上述 D P D 培养基进行液体浅层培
养
1
.
3 异源融合体的鉴别
用荧光染料罗丹 明 B ( R h o d a m i n e B ,配于选择
培养基中 , 浓度为 10 林g / m l) 标记沙打旺 A rE 原生质
体 ,用另 一 种荧光染料 B i s b e n z im id e H 3 3 2 5 8 (配于
选择培养基 中 , 浓度为 10林 g / m l) 标记首猎 M A 、 原
生质体 。 在紫外光的激发下 ,前者使细胞质呈红色 ,
后者使细胞核呈绿色 将两种标 记的原生质体进行
融合处理后 ,异核体将同时显示两种荧光 。 在 eL i c a
荧光倒置显微镜下观察并照相 。 异源融合率 (% )=
(同时发两种荧光的原生质体数 / 观察的原生质体总
数 )x 10 0%
L 4 融合杂种细胞的筛选和培养
1
.
4
.
1 融合杂种细胞筛选体系
用适宜浓度的 OI A 溶 液处理首 拾转 化系 M A 4
的原生质体后 , 其 细胞 质失活 , 再与沙打旺原生质
体通过 P E G 一高 p H 、 高钙法诱导融合 `: 杂种细胞 的
选择培养基为尤激素的 D P D 培养基 。 沙打旺原生
质体及其同源融 合产物不具有 激素自主型生长特
性 , 在无激素培养基上不能分裂 。 经 oI A 处理 的
首楷转化系 M A ; 原生质体 及其 同源融合产物 由于
细胞质失活 , 在无激素培养基上也不能生长 。 只有
异源融合产物 由于代谢和遗 传互补效应 , 有可能
存活 和持 续 分裂 。 通 过用 IO A 使细 胞质 失活 和
M A
; 的转化特征设计融合细胞筛选 体系 , 可淘汰
两种亲本的原 生质体及同源融合 产物 , 筛选 出杂
种细胞 。
1
.
4
.
2 杂种细胞的培养
融合处理 以后 的原生质体在无激素的 D l)[ ) 培
养基 上于 2 5 t 士 2℃条件下进行暗培养 _ 2 周后 , 向培
养 1 中加人 l m l 甘露醇减半的上述 D PD 培养基 以
后每隔 10 天 加 入 甘露醇浓度逐渐降低 的培养基 ,
直至肉眼可 见的小愈伤组织形成 将小愈伤组织连
同液体培 养基一起转 人无 激素的 M S 固体培养基
L
, 使小愈伤组织平铺于固体培养基表面 将在选
择培养基得到的愈伤组织扩增后 , 转人无激素的或
附加适 当浓度 6 B A 、 N A A 、 G A ; 和 ZT 组合 的 M S 培
养基 L诱导分化
L S 体细胞杂种愈伤组织的鉴定
1
.
5
.
1 染色体计数
取亲本与杂种愈伤组织 , 按朱激的力一法 ,7 }染色压
片进行染色体计数 _
1
.
.5 2 冠瘦碱分析
依 M O笔an 等的方法 {8进行纸 电泳 , 检查冠瘦碱
合 J戊酉每活性
! 5
.
3 同 一 L酶电泳分析
取 19 愈 伤组织 , 加样 品提取 液 ( O . O25 m (jl / L
fr i
、 一甘 氨酸缓 冲液 p H S . 3十4 0% 蔗糖 ) , 冰浴 条件
下充分研磨 , 然后 J几 15 0 0 0 r / n l i n 离心 10 , 1 1111 ,取 上
清液点样 过氧化物酶同工酶 , 细胞色素氧化酶 同
工酶 . 酉精酶同工酶 检测采用 何忠 效等的方法 ’ , {进
行
1
.
5
.
4 R A P D 分析
用愈伤组织提取模板 D N A D例A 提取按徐子
勤等的操作方法 ’ O ,进行 PC R 扩增反应条件 为先于
9 6飞:预变性 s n , i n 3 OS , 再在 9 4℃变性 11二 i n , 3 6℃退火
lZ n il
,
7 2℃延仲 3 , il ; 1 , 4 0 个循环后 , 在 7 2℃继续延伸
I Om i: 1 扩增 产物采用水平板琼脂糖凝胶 I OO v 恒压
电泳 3 5m i n 卜 凝胶浓度为 1 8% , 澳化乙锭染色 电泳
完毕 , 用法国 V I L B E R (L ) U R M A T 凝胶成像系统 观
察照相 。
2 结果与讨论
.2 1 碘 乙酞胺预处理对首蓓原 生质体存活和分 裂
的影响
试验分别用 1 . 0 Inl 心L 、 .2 0 nrlI ol F L 、 .5 0 .1、 n o叭 、
1.0 0 m m
《〕l/ L 4 种浓度 OI A 处理紫花 首信 M A 4 原生
质体 10 m in 、 表 l 结果显示 ,随着处理浓度的增加 ,原
生质体的存活率逐渐下降 。 经 .5 0 m m ()l I/ ()I A 处理
的原生质体在培养 3 天后 ,存活率仅为 1.5 2% , 且继
沙打旺与首蓓属 Jl a体 细胞杂交
一
蝴一 表 1E f fe C t 不同浓度 IO A 对首蓓 M A 礴原生质体存活率的影响 T al be of d ife r e nt c o nce nt r at i o nof i od 砚, a c e ta m i d e o n P r o to Pla s t
v ia b i li t y o f M
` id e ag
o s a
it
v a L
.
l ( ) A 浓度 ( : , 1 .1 1( , l / L ) C。 , n 、、 n t r a t i`、 , 1 。〕 f I O A ( ,。 n l o l / L )
培养 3 天 后的原生质体存活率 (供 )
F r e ox u `、 一l 。
·
y o f l ) x、 , t t ) I, la s一 v ia l) i li ly e u lt一 z砂 〔1 1一1 3 d (% )
形成小细胞克隆 的能 力
C a l
, a (
·
i l y
` ,
l 【飞一r l ,一i n g 、 n 一a l l c e ll e o l ( ) r l e s
( ) 2刀 10刀
7 5
.
5 3 2 2 2
.
() 】5 . 2
+ 干
十 : 能形 成小细胞克隆 ; 一 : 不能形成小细胞克隆
续培养不能形成小细胞团 。 这表明 , 5 . o m m ol / L IO A
处理 10n l i , 1 为首蓓原生质体预处理的适宜条件
.2 2 P E G 的浓度对原生质体融合效果的影响
PE G 的浓度对融合效果有 明显 影响 图 l 显
示 , 随着 P E G 浓度从 3 0%增加到 4 0% , 无论总融 合
率还是异源融合率都相应增加 但当 P E C 的浓度提
高荣 4 5%时 ,总融合率和异源融合率均下降 在这
种条件下 , 观察到原生质体大量集聚 变形 , 紧密粘
连 ,且 大多数原生质体破碎形成絮状漂浮物 。 用 高
p H 高钙液洗涤后 , 一些原生质体不能恢复圆球形
当 P E C 浓度为 35 %和 4 0%时 ,异源融合率相近 。 由
aK
。 和 M i c h ay lu k 建立 的 P E G一高 p H 高钙法 {` l , ,是
一种一直被厂`泛采用的植物原生质体融合程序 他
们认为 , P E G 由于含有醚键而具负极性 , 与水 、 蛋白
质和碳水化合物等正极化集团能形成氢键 。 当 PE G
分子链足够长时 , 可作 为邻近原生质体 的表面之 间
的分子桥而使之粘连 。 由于 P E G 本身对原生质体
具毒性 , 为了减少 P E G 对异核体进一步分裂 的负面
效应 , 本研究选择的 35 %的 P E G 浓度是首藉与沙打
旺原生质 体融合的适宜浓 度 此时 ,异源融合率为
4
.
6%
, 且多数为一对 一 的融合 二
产
J 气) j 〕 斗U 斗勺
P EG ( % )
图 1 P E G 浓度对原生质体融合频率的影响
a :总融 合率 ; }, : 异源融合率
F ig
.
l E fe
c t o f d ife
r e n t e o n e e n t r a t io n o f P E G o n t h e
P or t
o P l a s t fu s io n fr e q u e n c y
.2 3 杂种融合细胞的筛选和培养
沙才J一 F[] 原生质体 (图版 I , 图 l) 与经过 IO A 预处
理的首信 M A 4 原生质体 ( }冬I版 I , 图 2 )混合物 在加
人 PE C 融合液后 , 原生质体之间相互粘连 (图版 I ,
图 3 ) 在用高 l) H 高钙液洗涤过程中 ,粘连的成对原
生质体逐渐 各 自变成半球形 , 接着合成 一个圆球体
( 图版 I , 图 4 ) 变圆后其问的界线很快消失 。 融合
体细胞明 显较大 , 在培养 4 天左右开始变成椭 圆
形 , 6 天左右出现第一 次分裂 ( 图版 I , 图 5) 由于
选择培养基为不加外源激素的 D P D 培养基 ,它有效
地淘汰 J’ 两 个亲本的原生质体 、 _ 一定浓度的 10 八可
通过抑 制细胞的糖酵解途径使原生质体的细胞质
失活 , 这样 的原生质体不能持续分裂 。 然而 , 当其与
另一亲 j父自{lJ 卜常原生质体融合后 , 杂种细胞 由于代
谢互补能够正常分裂 因此可被用来进行杂种细胞
的筛选 `2 I O A 可 以 与磷酸甘油醛脱氢酶上的一 S H
发生不 l叮逆的结 合 , 通过抑制酶的活性 , 来阻止 3 -
磷酸 甘油醛 氧化生成 3一磷酸 甘油酸 , 使糖酵解不能
进行 , 细胞生长发育 的能量 由于得不到供应 , 因而
细胞停 止分裂或死 亡 _ 经 lo A 处理的细胞只有当与
细胞质完整的另一 亲本细胞融合 ,代谢 仁得到互补 ,
才能正常分裂 杂种细胞在 2 周后分裂形成几十个
细胞构成的小细胞团 ( 图版 I , 图 6 ) , 5 周后形 成肉
眼 可见的 2 n l n l 大小的愈伤组织 (图版 1 . 图 7 ) 。 两个
月左右 ,愈伤组织直径可达 I c 了钱 融合产生的愈伤组
织的生 长速度比 末经 OI A 处理的 菌楷 M A 4 原生质
体单独培养时明显加快 , 表现 出杂种生长优势 。 融
合体产生 的愈伤组织 外观介于 双亲之 间 , 颜 色淡
黄 , 质地松脆 , 表面呈颗粒状结构 。 首蓓 M A 4 原生质
体愈伤组织呈现 黄绿色颗粒状较 紧密而脆 的状态 。
沙打旺原生质体愈伤组织颜色淡黄 , 质地疏松 ,表
面无颗粒状结构
融 合处理 后的原生质体群体包含一对一 与一
对 一 以 上 的异源融 合体 、 同源融合体 以 及未融合
ǎ享à讯二-t屯nl出一uē)工?-J了力l牙百ē工
卷一,夕一17 0 金 红 贾敬芬 郝建 !川
的亲本原生质体 由于 菌拾 M A 4 原生质体在融合
前用 OI A 进 行了预处理 , 因此首 信 M A 、 原生质体
及其 同源融合体 不能持 续分裂 。 沙打 旺 A E r 原生
质体及其 同源融合体在选择培养基上也 不能持续
分裂 、二」 只有在代谢上互补 的异 源融 合细胞才可能
持续分裂
所 设对照 (均中 ,经过 I O A 处理的首藉 M A 、 原
生质体单独培养 , 原生质体 多数不能分裂 , 有的仅
分裂 l 一 2 次 , 不能形成小细胞团 、 ( 2) 未经 OI A 处理
的首希 M A 4 原生质体单独培养 , 4 天以 后原生质体
出现第一次分裂 , 6 天后开始第二次分裂 , 2 周左石
形 成小细胞 团 , 6 周左右形 成直径 Z m m 的愈 伤组
织 。 ( 3 )沙打旺原生质体单独培养 , 原生质体可分裂
形成几 十个细胞的细胞 团 ,但在选择培养基上逐渐
褐化死亡 ( 4) 未经诱导融合的混合培养 , 首楷 M A 4
原生质体可正常生 长 , 情形类似 ( 2 ) 。 ( 5) 首蓓 M A 」
原生质体融合处理后的培养 ,未融合的原生质体可
正常分裂 , 同源融 合的原生质体体积增大 ,但 并不
分裂 。 ( 6) 沙打旺 A rE 原生质体融合处理后的培养 ,
情形类似 ( 3)
.2 4 融合产物的再生
在选择培养基上共获得 6 块愈伤组织 , 分别 记
为 R !一 R 6 , 在无激素培养基上 R ,一 R 6 均没能分化出芽
点 。 在分化培养基上 , 仅无性系 R ! (图版 I , 图 8) 在
0
.
2 m g / L N A A
一与 0 . 7 m g / L 6 B A 和 0 . s m g / L Z T
3 种激素组 合时 出现 了芽的分化 , 并长 出小苗 ( 图
版 I , 图 9丸 但 未能进一步长大 〕
.2 5 染色体分析
对双亲愈伤组织染 色体计数表 明 , 首希转化系
愈伤组织细胞染色体有减数现象 , 染色体多为非整
倍体 约 7 9%的细胞染色体数为 Z n 二 2 7( 图 2一 a) ,其
余细胞染色体数介于 犯一 18 条之间 。 这种经转化后
培养物 出现染 色体减数 的现 象是较 为普遍 的 , ’ 3
X u 和 iJ a 对农杆菌 A 4 转化后的红豆草 ( O no b哪瓜、
。 ic i汰夕乙l讯 )培 养物出现的染色体减数现象进行了较
为详细的研究 , 并且认 为这种染色体数 目的变异可
能与继代培养中培养基附加的激素有关 〔` 4 。 本研究
所用沙打旺抗 乙硫 氨酸变异系愈伤组织的染色体
数稳定为 Z n = 16( 图 2 一 b ) 。 对杂种细胞系 R ! 的愈伤
组织进行压片处理 , 染色体数在 30 一43 条之间 。 一
些细胞的染 色体数为 4 3 条 ( 图 2 一 C ) , 即双亲染色体
数之和 而且观察到杂种细胞分裂过程中出现落后
染色体 ,并形成染色体桥 。
图 2 染色体数 目
。 :
2l]
=
27 (茵恰 ) ; 卜: 21 = 16 (沙打日切 ; 。· : 21 = 4 3( 杂种 R )
F ig
.
2 C h r o m o s o m e n u m b e r
.2 6 冠瘦碱分析
纸电泳结 果(图 3) 表明首萦转化系亲本的冠瘤碱
合成酶基因 己被整合到杂种组织中 ,并得到表达 L
图 3 杂种愈伤组织 R : 的冠瘦碱分析
] : 沙打旺 A E甲 P 、 ;
2
: 白蓄卜 )沙们一旺 杂种愈伤组织 R ;
3 :首稿 M A 4 P P 、 ;
4 :芭一藉 M A ; 发状 根 ;
5
: 冠瘤碱 :1a rke r
F i g
.
3 O P i
n e a n a ly s i s o f t h e h y b
r
id e a l lu s R
-
.2 7 同工酶分析
对 双亲愈伤组织 与杂种愈伤组织 R . 进行 了同
I
_酶电泳比较 结果如图 4 所示 二 过氧化物酶同工
酶 酶 谱 显示 , R . 具有 2 条首 希 的特 异 酶带 ( R汗
3 期 沙打旺与苗偕属间体细抱杂交 1 1 7
图 4 双亲及杂种 RI的 同工酶图谱
a : 过氧化物酶同工酶 ; 卜: 酉旨酶同工酶 ; 、 · : 细胞色素氧化酶
F ig 4 T h e is o e n
z yme e le e t r o Ph o r e s i s o f t h e Pa r e n t s a n d th e fu s io n
a : Pe r( ) xi ( la s e ; b
: E、 le l妞 、 e 二 f 4 : C v l` , ( 、 }1 1、 ) 11一e ( ) x jo la s e
.
M : M 八 r〕 I)、 : 八: , \ E , I, I )、 ; 一飞.: 入 (+ )M .
, 11: 、」l a ,二 e t e r i s r i。 h a n d 。 2 M A止, P * , 。 : 。 一1 : ,一。 `一。· r i、 一《 一, a ,1 , { ` , , A E, P P、 , :1 :
P r o d u e t s R l
一l e w l〕 a n 〔1
.
表 2 首蓓一沙打旺体细胞杂种与亲本的 R A P D s 多态性 比较
T a b le 2 e o m p a r is o n o r 以 P D p o 一ym o r p h i sm s b e t w e e n M A 4 a n d AE , s o m a t ie h y b r i d a n d t h e p a r e n t s
引物 / rP im e f
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’ 一 3 ’ 、 e q L: e r l (
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A 11 A R M A R
I一3一、一M一M一R一气一M一 O00-,1O PA一 0 4 (A A TC (二(二(二C T(二)( ) PA一 0 8 ( (汀 G AC G『 l’ AG C )() PA一0 9 ( ( ; G (子T AA C (; C C )O P A一 2 0 (G件 (子(二C A T C (: )( ) P H一 0 2 (T C G G A C G 『r G A )0 1) H一 04 ((二G A A G TC G C C )O P H一 07 (C T G C AT C G T (子)() P H一 12 (AC C C G C A『r G 『r )
T。 ) t a l 3 7 30 4 0 2 1 ! 2 17 8 9 1
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A E r i r一 R I ; M AR
. : 。 ·。 ,“ 一r一。 n 一)a f l一s 。) r M A 4 、 A E r a n (一R I ; N : r l o w 一 r一:一。 ,一f 、 一: 、 一l`一 , : : : 1。一、 .卜I R :
0
.
2 6
,
0
.
7 8 )
,
2 条沙打旺的特异酶带 ( R 产0 . 3 3 , 0 . 7 3 ) , 带 , 显不 了杂种特征
并出现 1 条新带 ( fR = .0 3 8 ) ; 酉旨酶同工酶酶谱显示 , .2 8 R A P D 分析
R
. 分别具有 1 条首蓓 的特异酶带 ( R「= .0 7 4) 和 l 条 采用 E A I〕 l〕技 术 比较 了亲本 和杂种在 基因组
沙打旺的特异酶带 ( R 尸.0 83 ) , 以及 1条新带 ( R I二 l) 刊A 水平 卜的同源性变化 。 如图 2 所示 ,所扩增的带型
.0 7 ) ; 细胞色素氧化酶的同工酶酶谱显示 , R . 同样 中 ,两亲本的 几气P l〕产物表现出明显的特异性 。 不同引
分别具 有 1 条首蓓的特异 酶带 ( R =f .0 4 9) 和 1 条沙 物与同一亲本组合得到的扩增 DN A 多态性之间也存
打旺 的特异 酶带 ( rR = .0 68 ) , 以 及 1 条新带 ( R=f 在很大差异 ,但杂种 与两亲本之间具有较大的同源性 。
0
.
72 )
) 同工酶酶谱显示 ,杂种愈伤组织 R . 不但包含 从美国 O p e or n eT ch no lgo y tL d . 公司 A 组和 H
双亲的某些 特征酶带 , 而 目产生了 自己 的特异 条 组 的随机引物 中 , 筛选 出 O P AO4 、 O PA 08 、 O P A09 、

3 期 沙士]一旺 ` J 曲一价属间体细咆杂交 17 3
讨称体细胞杂交及植株再 ’ !一 科学迪报 4 0 (6) :5 7 5 一 5 7 6
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珑一3一贾敬 井 郝建 {引é一一。一 图 版
沙打旺与首情属问体 细胞杂交 5 1 7
图 版 说 明
图 版 I
沙打旺乙 硫氨酸抗性系原生质体 ; x
首菇 发根农杆菌转化系的原生质体 ;
沙打旺与苗蓓原生质体一 比 一的融合 ;
沙打时: 与首情原生质体融合细胞 ; 沐
融合细胞的第一次分裂 ; x5 0
融合细胞分裂形成的细胞团 ; 火 5 0
融 合细胞分裂形成的的小愈伤组织 ;
杂种愈伤组织分化出绿色芽点 ;
杂种愈伤组织分化出小苗 。
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