全 文 ：红树林木果楝属植物可培养内生真菌的多样性
及其代谢产物抗肿瘤活性
李宁1，2，阮飞盈1，2，闻正顺4，李建华2，陈日道2，刘晓2，
谢丹2，李敏一3，王春梅1，吴军3，戴均贵2*
( 1．北京中医药大学 中药学院，北京 100102;
2．中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050;
3. 暨南大学 药学院，广东 广州 510632; 4. 浙江海洋学院 食品与医药学院，浙江 舟山 316000)
［摘要］ 从 3 种红树林木果楝属植物材料的枝、叶及果皮中经反复分离纯化获得 24 株真菌，采用 rDNA-ITS序列分析技
术对菌株进行了种属鉴定，结果表明它们分属于 3 纲 9 目 11 科 14 属;并发现不同种属、不同产地的木果楝属植物内生真菌在
种群组成和数量上存在差异，其中拟茎点霉属 Phomopsis、炭疽病菌属 Colletotrichum在 3 种植物材料中均分离得到。采用 MTT
法对菌液乙酸乙酯提取物进行体外抗肿瘤活性评价，发现 15 株真菌菌液乙酸乙酯提取物表现出良好的体外抗肿瘤活性，值得
进一步研究和开发。
［关键词］ 木果楝属;内生真菌;分离鉴定;抗肿瘤活性
［收稿日期］ 2013-03-31
［基金项目］ 广东省重大科技专项 (2011A080403020)
［通信作者］ * 戴均贵，研究员，博士生导师，Tel: (010)63165195，
E-mail:jgdai@ imm. ac. cn
［作者简介］ 李宁，硕士研究生，E-mail:ningjianger@ 163． com
植物内生真菌(endophytic fungi) 是指其生活史
的某一段时期生活在植物组织内、对植物组织没有
引起明显病害症状的真菌［1］。内生真菌长期生活
在植物体内的特殊环境中，与宿主协同进化，可能有
与宿主相同的次级代谢途径［2］; 另外，真菌往往具
有易培养、易控制、易通过现代生物技术改造遗传性
状等特点，因此内生真菌是活性天然产物的重要来
源。目前关于传统药用植物以及特殊生境中植物内
生真菌的研究日益增多，获得了许多结构新颖的活
性化合物，进展较快［3-5］。
红树植物(mangrove plants) 是一类较为特殊的
木本植物群落，生长在热带、亚热带海岸潮间带，受
海水周期性浸淹，生长环境独特。红树林生态系统
开放性强，生物种类繁多，不仅在自然生态平衡中起
着特殊作用，而且具有抗菌、抗肿瘤等药用价值［6］。
近年来，对此类植物内生真菌的种类、次级代谢产物
类型的多样性及其抗菌抗肿瘤活性等研究日益增
多［7］。楝科木果楝属 Xylocarpus 植物是红树林的组
成树种，常混生于红树林中，世界范围内木果楝属植
物仅有 X. granatum，X. moluccensis，X. rumphii 3
种，分布于非洲、亚洲及大洋洲北部的热带海岸，我
国境内只有 X. granatum( 木果楝)1 种，分布于海南
沿海［8］。长期以来，印度人一直使用木果楝来治疗
疟疾等一些发热性疾病，一些东南亚国家也将其用
来治疗腹泻、霍乱和疟疾等发热性疾病。目前，对木
果楝的研究主要集中在化学成分方面，其特征性成
分柠檬苦素类化合物具有抗肿瘤、抑制 HIV、抑菌、
杀虫等良好的生物活性［9-11］。然而，有关木果楝属
植物内生真菌的研究未见报道。本研究以采自海南
三亚和泰国南部的董里府(Trang province) 海岸的
木果楝属植物的枝、叶、果皮为材料，研究其内生真
菌的种属多样性及其次级代谢产物的抗肿瘤活性，
一方面为研究木果楝植物与其内生真菌之间的关系
奠定基础，另一方面，旨在获得有良好药理活性的菌
株，以寻找具有新颖结构的生物活性先导化合物，用
于创新药物研究。
1 材料
1. 1 植物 木果楝 X. granatum 枝、叶、果皮分别
于 2011 年 11 月采自海南三亚，2012 年 8 月采自泰
国南部的董里府海岸;X. moluccensis于 2012 年 8 月
采自泰国南部的董里府海岸，采集和鉴定工作由暨
南大学药学院吴军教授完成。采集后的材料放于保
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鲜袋并于冰盒中保存，3 d内进行内生真菌的分离。
1. 2 内生真菌培养基 PDA 培养基( 马铃薯葡萄
糖培养基) :马铃薯200 g 去皮切块煮沸 30 min，纱
布过滤，MgSO4 0. 75 g，KH2PO4 3. 0 g，葡萄糖 20 g，
水 1 L，pH 5. 8，121 ℃灭菌 15 min。分离培养基另
添加琼脂 1. 2%、氨苄青霉素和链霉素( 无菌过滤加
入，各 100 mg·L －1) 用于抑制细菌生长。
1. 3 药品与试剂 真菌 DNA 提取缓冲液:100 mL
Tris-HCl(pH 8. 5) ，25 mL 0. 5 mol·L －1 EDTA(pH
8. 0) ，25 mL 10% SDS，7. 3 g NaCl，加水定容至 500
mL。克隆载体 pEASY-T1、大肠杆菌感受态细胞
Trans1-T1 购于北京 Transgen 生物技术有限公司;
Taq DNA polymerase，10 × PCＲ buffer，dNTPs Mix及
MgCl2购于 Invitrogen 生物技术公司; 引物ITS1F，
ITS4 合成及测序工作送交 Invitrogen 生物技术公司
完成。
1. 4 仪器 PCＲ 仪( 美国Bio-Ｒad 公司) ，电泳仪
( 北京六一厂) ，ELX800 全自动酶标仪( 美国Biotek
公司)。
2 方法
2. 1 内生真菌的分离、纯化 分别取 3 种材料的茎
段、树叶、果皮，按以下程序严格进行表面消毒:采集
的材料在流水下冲洗干净，无菌条件下，用 75%乙
醇浸泡 3 ～ 5 min，无菌水冲洗 5 次，0. 1%升汞浸泡
10 ～ 15 min，无菌水冲洗 5 次，用无菌滤纸片吸干水
分。将叶片、果皮去除边缘，切成 1 cm × 1 cm 的小
块，茎段去除两端，先纵切为 4 部分，再切成 2 cm长
片段，处理好后的材料接种于装有内生真菌分离培
养基的平皿上，28 ℃倒置暗培养 3 ～ 15 d，每日定时
观察真菌生长情况，将新长出的菌丝挑取尖端部分
转移至新鲜分离培养基上，多次反复转接纯化。纯
化后的菌株编号后于 PDA培养基的试管斜面保存。
以最后一次漂洗水涂在培养基上做对照组 1，以不
做切割的材料做对照组 2，以确定得到的是内生真
菌，而不是表面附带的菌。
2. 2 内生真菌的鉴定及 ITS 序列分析 将分离得
到的菌株分别接种至盛装 80 mL PDA 液体培养基
的 250 mL三角瓶中，于 28 ℃，150 r·min －1条件下
培养 10 d，培养物过滤后得菌液和菌丝部分( 菌液
用于提取代谢产物)。菌丝用无菌水冲洗、抽干，冷
冻干燥后用于提取基因组 DNA，其过程简述为: 将
冻干菌丝用液氮快速研磨，加入到真菌 DNA提取缓
冲液中，用 Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇 25 ∶ 24 ∶ 1 反复
抽提，异丙醇沉淀 DNA，70%乙醇洗涤，用无菌双蒸
水溶解 DNA样品，－ 20 ℃下保藏备用。ITS 序列用
真菌内转录区通用引物 ITS1F (CTTGGTCATT-
TAGAGGAAGTAA) 和 ITS4 (TCCTCCGCTTATT-
GATATGC) 扩增［12］。PCＲ扩增条件:94 ℃预变性 6
min，94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 30
s，30 个循环，最后 72 ℃延伸 5 min。通过琼脂糖凝
胶电泳检测提取的 DNA 及 PCＲ 扩增产物的质量，
切胶回收 PCＲ 产物，连接 PCＲ 产物与克隆载体
pEASY-T1，连接产物转入大肠杆菌感受态细胞
Trans1-T1，蓝白斑并结合 PCＲ 筛选阳性转化子，挑
取 3 ～ 4 个阳性转化子测序，测序工作由 Invitrogen
生物技术公司完成。
用 BioEdit 软件分析序列，将 18S rDNA-ITS 序
列在 NCBI 数 据 库 进 行 比 对 分 析 (http:/ /
blast. ncbi. nlm. nih. gov /Blast. cgi) ，从GenBank中找
到相关种属同源性最高、有效发表的 rDNA-ITS序列
信息，用 MEGA5 软件中 Clustal W 功能对 ITS 序列
进行比对分析，用邻接法(NJ 法) 构建系统发育树，
并进行 1 000 次重复的自展检验［13］。
2. 3 体外抑制肿瘤细胞生长活性评价 将得到的
菌液部分用 2 倍体积乙酸乙酯萃取 1 次，将萃取液
用滤纸过滤并浓缩至干，得到粗提物，用 DMSO 将
粗提物浸膏稀释到 25 mg·L －1，采用体外细胞毒
MTT法测定发酵液提取物抑制肿瘤细胞生长活性。
所用肿瘤细胞株分别为:人结肠癌细胞HCT-116、人
肝癌细胞 Bel-7402、人胃癌细胞 BGC823、人肺癌细
胞 A549 和人卵巢癌细胞 A2780。将对数生长期的
细胞，用 0. 25%胰酶-EDTA 消化后，配制成一定浓
度的单细胞悬液，根据细胞生长速度的差异，按每孔
1500 个接种于 96 孔板，每孔加入细胞悬液 100 μL。
24 h后，加入含不同浓度提取物及相应溶剂对照的
新鲜培养基，每孔加 100 μL (DMSO 终浓度 ＜
0. 1%) ，每种受试样品设3 个剂量组，每组至少设 3
个平行孔，于 37 ℃继续培养 96 h 后，弃上清，每孔
加入 100 μL新鲜配制的含 0. 5 g·L －1MTT 的无血
清培养基，继续培养 4 h，弃上清后，每孔加入 150
μL DMSO 溶解 MTT 甲簪沉淀，微型振荡器振荡混
匀后，酶标仪在参考波长 450 nm，检测波长 570 nm
条件下测定吸光度(A) ，以溶剂对照处理的肿瘤细
胞为对照组，计算提取物对肿瘤细胞的抑制率，并按
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以下方法计算 IC50:抑制率=( 对照组平均吸光度－
给药组平均吸光度)/对照组平均吸光度 × 100%。
采用 SPSS14. 0 软件进行数据统计与分析，P ＜ 0. 05
为有显著性统计学意义。
3 结果
3. 1 木果楝内生真菌分离、鉴定及多样性 从 3 种
红树林木果楝属植物材料中共分离得到 62 株内生
真菌单菌落，根据菌株的形态特征，包括菌落外观形
态、大小、颜色、质地、生长速度、生长培养基颜色等
特征初步去重，挑选了 48 株内生真菌单菌落进行分
子生物学鉴定，结果发现它们分属于为子囊菌门 3
纲 9 目 11 科 14 属 24 种。实验观察到内生真菌在
木果楝属植物的叶、枝以及果皮中广泛分布，在种属
水平上呈现多样性，不同产地、不同种属植物分离得
到的内生真菌在种属组成和数量上存在差异( 内生
真菌的鉴定结果见表 1，系统进化发育树见图 1)。
拟茎点霉属 Phomopsis、炭疽病菌属 Colletotrichum菌
株在 3 种材料中均分离得到; 分离自泰国董里府海
岸 X. granatum的内生真菌中，拟茎点霉属 Phomop-
sis、叶点霉属 Phyllosticta为优势菌属;而分离自中国
海南三亚 X. granatum 的内生真菌菌群中，木霉属
Trichoderma 为优势菌属; 分离自泰国董里府海岸
X. moluccensis的内生真菌中，拟茎点霉属 Phomop-
sis、叶点霉属 Phyllosticta为优势菌属，且不同的分离
部位之间分离的真菌也存在差异。
3. 2 体外抑制肿瘤细胞生长活性评价
曲霉属 Aspergillus terreus Xy03、葡萄座腔菌属
Botryosphaeria sp. Xy04、赤霉属 Gibberella sp. Xy08、
青霉属 Penicillium sp. (Xy12，Xy13，Xy15，Xy16) 等
菌株代谢产物对人结肠癌细胞 HCT-116、人肝癌细
胞 Bel-7402、人胃癌细胞 BGC823、人肺癌细胞 A549
和人卵巢癌细胞 A2780 5 种肿瘤细胞增殖生长均有
良好的抑制作用。Phomopsis sp. (Xy19，Xy20，
Xy21，Xy22) 等多株拟茎点霉属菌株的菌液乙酸乙
酯提取物对人结肠癌细胞 HCT-116、人胃癌细胞
BGC823 有良好的选择性抑制活性。这些结果为下
一步活性菌株的进一步挑选和代谢产物的分离提供
了依据，见表 2。
4 讨论
内生真菌的分类鉴定主要依据其营养体( 菌
丝) 的形态特征，而其形态特征容易受到培养条件
和其他因素影响，本文结合内生真菌培养过程中的
表 1 来源于 3 种木果楝属植物材料的内生真菌
Table 1 Endophytic fungi isolated from three plant materials of
Xylocarpus
菌株编号
Xylocarpus granatum
(海南三亚)
X. granatum
(泰国董里府)
X. moluccensis
(泰国董里府)
Aspergillus sp. Xy01 +
Aspergillus sp. Xy02 +
Aspergillus terreus Xy03 +
Botryosphaeria sp. Xy04 +
Cladosporium sp. Xy05 +
Colletotrichum sp. Xy06 + + +
Fusarium sp. Xy07 +
Gibberella sp. Xy08 +
Lasiodiplodia sp. Xy09 +
Myrothecium sp. Xy10 +
Nigrospora sphaerica Xy11 +
Penicillium sp. Xy12 +
Penicillium sp. Xy13 +
Penicillium sp. Xy14 + +
Penicillium sp. Xy15 + +
Penicillium sp. Xy16 +
Pestalotiopsis sp. 17 + +
Pestalotiopsis sp. 18 +
Phomopsis sp. Xy19 + +
Phomopsis sp. Xy20 + +
Phomopsis sp. Xy21 + +
Phomopsis sp. Xy22 +
Phyllosticta sp. Xy23 + +
Trichoderma sp. Xy24 +
总计 8 10 15
注:+. 从材料中分离得到。
外观形态、大小、颜色、质地等特征，采用分子生物学
rDNA-ITS序列分析技术对其进行了初步分离和鉴
定，方法快捷简便，避免了传统形态学鉴定方法不易
产孢子等困难，但以 ITS 序列作为分子标记的应用
技术也存在限制:有的真菌由于进化顺序、变异等因
素，在间隔区上表现的差异性较小，不适合于属内种
的准确标记，同时受分析方法、数据库不完善等限制
因素，精确鉴定到种需借助形态学或其他分类技术
手段综合分析。
本研究表明，红树林木果楝属植物 X. moluccen-
sis和 X. granatum中内生真菌丰富多样，如拟茎点
霉属 Phomopsis、拟盘多毛孢属 Pestalotiopsis、叶点霉
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采用邻接法构建系统树，Schizophyllum commune (gi 134105874) 作为
外群;括号中为参考菌株在GenBank中的登录号。
图 1 基于 ITS序列的木果楝内生真菌系统进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree (NJ)based on rDNA-ITS sequence of
endophytic fungi associated with Xylocarpus
表 2 木果楝内生真菌菌液乙酸乙脂提取物抑制肿瘤细胞
生长活性
Table 2 In vitro antitumor activity of the fermentation broths EtO-
Ac extracts of endophytic fungi associated with Xylocarpus %
菌株编号
IC50
HCT-116 Bel-7402 BGC823 A549 A2780
Aspergillus terreus Xy03 4. 98 21. 21 4. 04 25. 41 9. 94
Botryosphaeria sp. Xy04 8. 09 13. 80 14. 99 13. 80 8. 20
Colletotrichum sp. Xy06 40. 82 20. 86 ＞50 38. 73 15. 20
Fusarium sp. Xy07 8. 12 ＞50 9. 76 ＞50 28. 03
Gibberella sp. Xy08 8. 63 22. 05 8. 71 24. 18 9. 63
Penicillium sp. Xy12 ＞50 26. 92 20. 69 19. 16 ＞50
Penicillium sp. Xy13 4. 94 11. 45 4. 35 23. 43 5. 49
Penicillium sp. Xy15 10. 29 ＞50 16. 31 ＞50 ＞50
Penicillium sp. Xy16 13. 52 ＞50 29. 37 ＞50 ＞50
Phomopsis sp. Xy19 2. 72 ＞50 11. 06 ＞50 ＞50
Phomopsis sp. Xy20 3. 34 ＞50 4. 24 40. 24 40. 20
Phomopsis sp. Xy21 8. 48 ＞50 12. 84 ＞50 ＞50
Phomopsis sp. Xy22 1. 78 ＞50 6. 22 ＞50 8. 98
Phyllosticta sp. Xy23 12. 15 ＞50 19. 58 ＞50 ＞50
Trichoderma sp. Xy24 15. 53 10. 41 18. 86 21. 28 12. 18
注: 其他未列菌株的菌液乙酸乙酯提取物的IC50均大于 50 mg
·L －1。
属 Phyllosticta、青霉 Penicillium、炭疽菌 Colletotri-
chum、木霉 Trichoderma、曲霉 Aspergillus 等 14 属真
菌，其中拟茎点霉属 Phomopsis、拟盘多毛孢属 Pesta-
lotiopsis、叶点霉属 Phyllosticta 为分离得到的优势种
属，拟茎点霉属 Phomopsis 与炭疽菌 Colletotrichum
在 3 种材料中均分离得到。3 种材料的内生真菌统
计结果表明不同种属植物、不同生态环境的木果楝
属内生真菌存在差异，内生真菌与宿主植物及外部
生态环境密切相关。本文结果为下一步挑选菌株进
行放大发酵，分离鉴定其中的次级代谢产物，发现结
构新颖、生物活性显著的天然产物奠定了基础。
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Diversity and in vitro antitumor activity of endophytic fungi from
mangrove plants Xylocarpus
LI Ning1，2，ＲUAN Fei-ying1，2，WEN Zheng-shun4，LI Jian-hua2，CHEN Ｒi-dao2，
LIU Xiao2，XIE Dan2，LI Min-yi3，WANG Chun-mei1，WU Jun3，DAI Jun-gui2*
(1. College of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China;
2. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines，Institute of Materia Medica，
Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China;
3. College of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou 510632，China;
4. Food and Pharmacy College，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，China)
［Abstract］ A total of 24 biologically pure entophytic fungal strains were isolated from stems，leaves，and seed coats of Xylo-
carpus plants by repeated purification，and identified with Internal Transcribed Spacer (ITS)rDNA molecular method，which belonging
to 14 genera，11 families，9 orders and 3 classes. There were differences in genus and species levels among three plant materials from
different habitats and species，and it was found that the strains of Phomopsis and Colletotrichum existed in all three plant materials. In
vitro assay of antitumor activity by MTT method revealed that the EtOAc extracts of 15 strains exhibited potent antitumor activity. These
results suggest that it is of value for further investigation on the above fungal strains.
［Key words］ Xylocarpus;endophytic fungi;isolation and identification;antitumor activity
doi:10． 4268 /cjcmm20131412
［责任编辑 吕冬梅］
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