全 文 ：第 3 卷 第 4 期
20 0 0 年 1 2月
实 验 生 物 学 报
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3 3
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4
氏 e e m b e r 2 0 0 0
原生质体电融合再生柑橘属间体细胞杂种 `
刘 继红 胡春根 邓秀新
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,武汉 4 3 0 0 70)
澳洲指橘 (iM e cor i t、 s 户助 : ` a n a s w i n g l e )
是柑橘近缘属 ,与柑橘属均为柑橘族柑橘亚族 ,
都是真正的柑橘类植物 。 澳洲指橘具有抗穿孔
线虫 、 抗早 、抗寒和抗脚腐病等优 良性状川 。 酸
橙 ( iC t ur : a u ar nt iu m L . )是过去用得较多的一
种 砧木 ,对土壤的适应能力强 , 抗裂皮病 ,但不
抗穿孔线虫 。 由于酸橙具有多胚特性 ,通过常规
有性杂交难 以得到与澳洲指橘的有性杂种 。
原生质体融合是克服有性杂交不亲和 、 绕
过珠心胚干扰的有效方法 。 自从 O h ga w a ar 等
得 到柑橘与积属间体细胞杂种阁以来 , 已获得
一批柑橘种 、 属间体细胞杂种阁 。 本研究通过原
生质体融合技术 , 成功获得酸橙与澳洲指橘属
间体细胞杂种 。
材 料 和 方 法
一 、 材料
澳洲指橘 ( .M P aP ua , )愈伤组织由美国佛罗里达
大学柑橘教育研究中心 ( C R E C )的 J w G r o s s e r 博士赠
送 ,酸橙 ( C . au ar 耐依。 )种子采自华中农业大学柑橘园 。
愈伤组织保存于固体培养基 (M T + 5 0 9 / L 蔗糖+
0
.
7% 琼脂 )中 ,每 30 天继代一次 。 取生长在固体培养
基上的愈伤组织建立悬浮系 ,悬浮培养基为 M T + 5 0 9 /
L 蔗糖十 。 . 59 / L 麦芽提取物 ( M E ) + 1 . 59 / L 谷氨酸
胺 。 每 12 天继代 1次 ,继代 3 次后 , 于第 7一 10 天时取
愈伤组织分离原生质体 。
种子经 lm ol / L N a O H 脱果胶 , 0 . 3%次氛酸钠 (有
效饭 )表面消毒 2 0m in ,无菌水冲洗 5次 ,播种于 M T 基
本 培养基 (含 309 几 蔗糖 和 0 . 7 %琼脂 )中 , 播 种后
2。一 30 天左右取充分展开的叶片分离叶肉原生质体 。
二 、 方法
1
. 原生质体分离 、 纯化 : 将澳洲指橘愈伤组织 ( 1 9
左右 )放人 15 m m 火 60m m 培养皿中 , 加人 1 . 5m l 酶液
( 1 %纤维 素酶 O n o z u k a R一 1 0 + 2 %果胶 酶 决 r v a +
12
.
8%甘露醇+ 0 . 1 2% M E S + 0 . 3 6 % C a C I: , p H 5 . 6 ,
过滤灭菌 )和等体积的 0 . 7m ol / L EM E 培养基 ( M T +
0
. 殆L/ M E + 2 4电 / L 蔗糖 ) , 2 5 ,C放在低速 ( 2 6 r /m i n )
摇床上酶解 2 0 h 。 将叶片切成 1一 Zm m 宽的小条后放人
2 5m l三角瓶中 ,酶液组成及酶解条件同愈伤组织 。 原生
质体纯化方法参照 G r o s s e r 等 [` ]的方法 。
2
. 原生质体融合 、培养 : 融合方式为电场诱导融
合 ,融合条件同以往闭 。 融合小室 型号为 F T C 一 04 , A c
为 7V5 / e m ,作用时间 6 0 5 ; 1) C 为 1 2 5 o V / e m , 5 次脉冲 ,
间隔时间 2 5 . 直流电场处理后 ,静置 2 0一 3 om in , s o o r /
m访 离心 sm in ,沉淀后的原生质体用 B H : 培养基41[ 悬
浮至 5 x 1O 5 / m l 。 采用液体浅层培养方法培养原生质
体 。 1m5 m x 6m0 m 培养皿中加人 Zm l 原生质体悬浮液 ,
28 ℃ 暗培养 . 待细胞团长到肉眼可见时 ,转人 EM E 50
培养基 ( M T + 50 m g / L M E + 5 09 / L 蔗糖+ 0 . 7%琼
脂 ) 中 , 长 出的胚状 体转 人 EM 1E 50 。培 养基 ( M T 十
15 0 0gnz / L M E + 5鲍 /L 蔗糖 + 。 . 7%琼脂 )上 ,诱导 生
芽培养基为 M T + 0 . l m g /L N A A + 0 . s m g / L B A +
.0 s m g / L K T 十 2 5 9 /L 蔗糖 + 。 . 7%琼脂 。 诱导生根培
养基为 1 2/ M T + 0 . 1 m g / L BI A + 0 . 5 m g / L N A A + .0
5 9 / L 活性炭 + 25 9 / L 蔗糖+ 0 . 7 %琼脂 。
3
. 染色体检查 、 D N A 提取及 CP R 扩增 : 染色体观
察参考 G or s se r 等的方法 41[ 并作适当修改 : 取根尖作为
观察染色体的试材 , 用饱和对 一二饭苯溶液将材料处理
h3
, 用蒸馏水将其充分洗千净 ;卡诺氏固定液 (1 份冰醋
酸 + 3 份 95 %酒精 )固定 Z Oh ,洗干净 ;用 s m ol /L 盐酸
酸解 1m8 in ;用 4%硫酸铁按媒染 h1 , 用蒸馏水反复洗
几次 ,最后用 0 . 5 %的海氏苏木精染色 h3 , 45 写醋酸分
色 , 压片 , 用研究显微镜 ( O lym uP s B H 一 2) 观察并照相 。
本文 1 9 9 9 年 1 1月 8 日收到 。 2 0 0 0 年 8 月 1 8 日接
二 国家 自然科学基金资助项目 。
刘继红 胡春根 邓秀新 33卷
参考史永忠等的方法提取酸橙叶片 、 澳洲指橘愈伤组
织 和再生植株 叶片的 D N A , 并根据其程序进行 CP R
扩增和电泳检测 61[ 。
结 果
一 、 植株再生
原生质体融合产物在培养后第 25 天就长
出肉眼可见的小愈伤组织 ,转入 EM E S。。培养基
后 , 很快就能再生出胚状体 ( 10 一 15 天 ) ,胚状
体在 E M E 1 5。。培养基上进一步长大 , 子 叶期胚
状体在生芽培养基上再生出很多丛芽 , 这些丛
芽生长快 ,生根能力很强 ,所有转人生根培养基
的芽都在 1 5一 30 天左右长出新根 。 目前 , 已有
一批生根植株移人温室 (图版 I , 图 1 ) 。
二 、 细胞学检查和形态特征
对再生植株中的 20 棵进行染色体检查 ,发
现所观察到的细胞都具有 18 条染色体 ,表明它
们都是二倍体 ( Zn = Zx 一 18 ,图版 I , 图 2 ) 。
酸橙和澳州指橘的叶片在形态上差别很
大 ,前者叶片大 , 具有翼叶 ,后者叶片很小 ,从形
态上很容易将二者区分开 。 这些再生植株中 ,绝
大部分在形态上与叶肉亲本 (酸橙 )一样 , 叶片
大 , 翼叶大且较宽 (图版 I , 图 3 ) 。 但有两棵植株
(M S
, 和 M s Z )的叶片在试管阶段既不象酸橙 ,
也不象澳洲指橘 ,移到室外后一段时间长出与
酸橙叶片相似的新叶 , 但与酸橙叶片不同的是 ,
有些叶片更厚 、宽 。 出乎意料的是 ,本组合有 1
棵再生植株有 2 片小叶分别具有二叶 (图版 I ,
图 4) 和三叶 (图版 I , 图 5 ) ,该植株移到温室后 ,
也长出与酸橙 叶片一样的新叶 ,但具二叶和三
叶的小叶片生长缓慢 。
三 、 再生植株 R A P D 分析
对已进行倍性检查的 lz 棵植株 ( 即 1一 12
号 , 其中 1 1 和 1 2 号分别为 M S , 和 M S Z )进行
杂种特性鉴定 。共选用 4 个随机引物 (O P A 一 04 、
O P A
一
0 7
、
O P A
一
0 5 和 O P A A 一 1 7 ) , 4个引物都能
将澳洲指橘与酸橙区分开 。 在引物 O P A A 一 17
带型图中 ,所有 12 棵植株的带型与酸橙完全一
致 (图版 I , 图 6 ) ;在 O P A 一 08 引物的带型图中 ,
M S
, 和 M S : 的带型与澳洲指橘一样 ,其他植株
的带 型与酸橙一样 (图版 I , 图 7 ) ;在 O P A 一似
的扩增带型图中 , 12 棵植株的 R A P D 谱带 出现
3种类型 : 第 6、 8 、 9 和 10 号植株与酸橙谱带一
样 ; 11 号和 1 2 号 (即 M S I 和 M S : 两棵植株 )综
合了双亲的谱带 ; 1 、 2 、 3 、 4 、 5 和 7 号植株具有
酸橙和澳洲指橘的部分特征带 (图版 I , 图 8) ;
在 O P A 一 07 的带型图中 ,所分析植株 (缺 1 号植
株 ) 的带型也有 3种 : 2 、 3 、 4 、 5 和 7 号植株与酸
橙一样 ; n 和 12 号植株与澳洲指橘一样 ;其他
的与酸橙相似 ,但具有澳洲指橘的 1 条特征带 ,
6 号植株还出现了 1 条新带 (图版 I , 图 9) 。 12
棵植株在 4个引物的扩增产物中具有融合亲本
的特征带情况见表 1 ,从表 1 中可以看 出 ,尽管
单个引物不能完全鉴定所有再生植株的杂种特
性 ,但综合 4个引物的结果 ,可以看出所分析的
12 棵植株都是澳洲指橘与酸橙的体细胞杂种 。
结合染色体检查的结果 ,表明上述植株都是二
倍体体细胞杂种植株 。 具二叶和三叶的值株是
在上述 12 植株的杂种特性鉴定完成后才再生
出来的 ,故其 R A P D 带型未包括在内 ,但它仍
是杂种起源 (刘继红 ,未发表资料 ) 。
讨 论
柑橘原生质体融合常用 “ 叶肉原生质体十
悬浮系愈伤组织原生质体 ”模式 , 由于柑橘及其
近缘属主要为二倍体 ,所以 , 绝大部分体细胞杂
种为异源四倍体 。 但在部分融合组合 中也出现
一些二倍体植株 ,这些植株在形态上与叶肉亲
本 一样 , 所 以通常称之 为 “ 叶肉亲本 型植株 ”
(L e a f
一
p a r e n t
一
t y p e p l a n t )
。 迄今为止 , 已从近 2 0
个融合组合中再生出二倍体叶肉亲本型杂种植
株 ,但 以往得到的此类植株都只是在种间组合
中获得「7一` 3〕 , `澳洲指橘 + 粗柠檬 ’ 是再生此类
植株的首例属间组合阁 ,这是继该组合之后 ,通
过对称融合再生属间二倍体叶肉亲本型杂种植
株的又一例报道 。这两个属间组合中 ,都用到澳
洲指橘 ,而且都是悬浮系愈伤组织亲本 ,是否它
4 期 原生质体电融合再生柑橘属间体细胞杂种
表 l 再生植株在 4 个引物扩增产物中具有双亲特征带的情况
T al be 1 B an sd s P e e if i ct oth e f u s i on P r e an s tP
r e s e oti n th e P r odu e s t of 4 P
r im e r s
引物 融合亲本
F
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再生植株 R e g e n e r ate d pln ats
P
r im e r s
par e n ts 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 11 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
OP A A
一
17 十+十
OP A
一
0 8
十+十
十+十+ +
+ +
+
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OP A
一
0 4
OP A
一
0 7
` + 十
十+十++十十一++.
+
一缺衅0 5P Ms o
MP 和 S ( )分别表示澳洲指橘和酸橙 ;十 表示所在植株具有融合亲本的特征带 ;一表示不具有特征带 ;, O P A -
0 7 引物中酸橙没有出现特征带 。
M P
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a r e 械 c ocr ￡tr u s P aP u n a a n d S o u r o r a n g e r e s p e e t i v e l y ; + i n d ica t e s th a t t h e p la n t s h a v e t h e e h a r a e -
t e r i
s t ie b a n d s o f t h e f u s io n P a r e n t s ;
一
in d ie a t e s t h a t th e P la n t s d o n
, t h a v e t h e e h a r a e t e r i s t ie b a n d s o f th e f u s io n
p a r e n t s ; N o b a n d s s p e e if ie t o S o u r o r a n g e w e r e d e t e e t e d in O P A
一
0 7
·
在融合中有利于再生二倍体叶肉亲本杂种植
株 , 还有待进一步研究 ,但有研究表明 , 融合亲
本基因型的确对再生此类植株具有影响 8[] 。
与 `澳洲指橘 + 粗柠檬 夕组合相 比 , 本组合
又有所不同 : 第一 ,再生植株的叶片形态 多样 ,
`澳洲指橘十粗柠檬 夕再生植株的叶片无一例外
地与叶肉亲本 (粗柠檬 )一致 , 而本组合再生植
株叶片形态并非如此 。 更 出乎意料的是 ,有 1 棵
植株出现具有二叶和三叶的小叶片 。 原生质体
融合再生出在形态上出现变异的植株的现象以
往 已有报道 , H a m l in 甜橙与酒饼勒的四倍体体
细胞杂种 出现两种 叶形 , 即宽 叶型和异常窄叶
型 1[ `〕 ; M ot o m ur a 等进行澳洲指橘与红橘融合
时 , 既得到了叶片形态介于双亲之间的体细胞
杂种 ,还得到了叶片薄 、小的植株 1s[ 1 。 目前还不
清楚是什么原因造成上述现象 ,一个可能的原
因是原生质体融合 、 再生过程 中亲本或杂种细
胞产生染色体结构或数 目变异 l[ 6〕 。 第二 , 再生
植株 R A P D 分析带型变化大 。 在 `澳洲指橘 十
粗柠檬 ’ 组合杂种特性鉴定 中 ,共用 了 6 个引
物 , 其中在 5 个引物的扩增产物上 ,再生植株 的
带型与叶肉亲本 (粗柠檬 )完全一致 ,再生植株
之间带型无差别 ; 而在本组合所用的 4 个引物
中 , 只在 引物 O P A A 一 17 和 O P A 一 0 8 的扩增 产
物中 ,再生植株 (尤其是叶肉亲本型 ) 的带型与
叶 肉 亲本 一致 , 但在另 2 个引物 ( O P A 一 04 和
O P A
一
07 ) 的扩增产物中 ,再生植株带型表现为
3 种类型 , 而且植株与植株之 间在带型表现上
也不完全相同 。 史永忠等曾报道二倍体叶肉亲
本型植 株 之 间在 R A P D 带 型 上存 在 细微差
别 v1[ 〕 , 造成这一现象的原因可能是杂种细胞之
间核质基因重组分配不 同18[ 〕 ,从而使与引物结
合的位点 (序列 )不一致 ,是否如此 ,还需对这些
杂种植株的核质基因组进行分析才能确定 。
摘 要
电场诱导酸橙 ( iC t。 ` , a u ar nt ilt m L . ) 叶肉
原 生 质体 与澳 洲 指 橘 (几人` cor it 八“ P aP au n a
s w in gl
e )悬 浮系原生质体融 合 , 融合 产物经培
养再生 出具有三种 叶片形态的植株 ,绝大部分
与酸橙叶片完全相似 ( 即叶 肉亲本 型植株 ) ;有
2 棵植株叶片大且厚 ;有 1 棵植株出现二叶和
三叶 。细胞学检查表明这些植株均为二倍体 。 采
用 R A P D 标记对前两种植株进行杂种特性分
析 ,共选用 4个 10 一m e r 随机引物进行扩增 。 在
引物 O P A A 一 17 的扩增产物中 , 再生植株的带
3 28 刘继红 胡春根 邓秀新 3 3 卷
型与酸橙一致 ; 在引物 OP A 一8 0的扩增产物中 ,
再生植株 的带型与酸橙或澳洲指橘相似 ; 而在
引物 O P A 一 04 和 O P A 一 07 的扩增产物中 , 再生
植株 的带型出现三种情况 , 4 个引物 的扩增结
果证明所分析的植株均是体细胞杂种 。 综合染
色体检查和 R A P D 标记的结果 ,表明获得 了酸
橙与澳洲指橘属间二倍体体细胞杂种植株 。
关键词 :柑播 澳洲指擂 电融合 体细胞杂种
R A P D 形态变 异
参 考 文 献
仁1 〕 G r o s s e r J . W , F . A . A . M o u r 扛。 一 F o , F .
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b r id iz a t io n
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, 姿勺矽2. G e ” e t . , 9 2 : 5 7 7
一 5 8 2 .
〔2 〕 o h g a w a r a T . 5 . K o b a邓 s h i , E . O -
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U e h i功 iy a , 5 . Is h ii , 19 8 5 ,
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p l a s t f u s主o n be t w e e n C心z侧 s ` i n en s1’ a nd
P 《万砚` 扩“ s
7 1 : 1一 4
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P l a ” r B r f ` d
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R四 . , 8 : 33 9一 3 7 4 .
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R e f o : g ia t o R e e 。拌 r o , P . C u -
e in o t t a
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19 9 6
,
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a s t s f o ll o w in g
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. 尸2召 n t 价 l R ` P , · 1 5 : 6 72一
6 7 6
.
〔 8 〕M o r ig u o h i T , T . H id a k a , M . O m o r a , T .
M
o ot m u r a
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A k i h a m a
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19 9 6
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G e n o ty P e
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c y o f e y b r i d in d u e t i o n i n C笼t邝 5 by e l e e t r o fu -
5 io n
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S c￡, , 3 1 : 2 7 5一 2 82 .
[ 9 〕M o t o m u r a T , T . H id a k a , T . M o r i g u e h i ,
T
.
A k i h a讯 a , M O m u r a , 1 9 9 5 , Int e r -
g e n e r ie s o m a t ie h yb
r id s b e t w e e n C “ r u s a n d
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a么 n t i a o r s卿 e斤 n ia b y e l e e t r o f u s io n , a n d
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「1 0〕 S a it o W , T . O h g a w a r a , J . hS im议 u , S ·
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,
1 9 9 1
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P 么” t s 瓦 . , 7 7 : 1 2 5一 13 0 .
〔1 1】S a it o W , T . O h g a w a r a , J . hS i。 连u , 5 .
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,
19 9 3
,
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仁12〕 S a i t o W , T . hO g 、 r a , J . S h im主z u , S ·
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P勿刀 t S c f . , 9 9 : 8 9一 9 5 .
〔1 3〕 Y a anr m o t o M , 5 . A . oK b a y a s h i , 1 9 95 ,
C y b r id p la n t p r o d u e e d b y e le e t r o f u s io n b e
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〔1 5〕 L o u z a d a E . 5 . G r o s s e r J . W , F . G . G m i t -
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1 9 9 3
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nI t e r g e n e r ie s o m a t玩 h y -
b r id i z a t i o n o f s e x u a l ly i nc o m p
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a la n t么 “ , 勿 n ica
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肠 1 . 尺记沪 . , 1 2 ; 68 7一 6 9 0·
〔1 6〕M o t o m u r a T , T . M o r ig u e h i , T . A k ih a ma ,
T H id a k a
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1 9 9 6
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(刊a n e h ) S w in g l e . J . PJ n . S、 . 刀心r ￡.
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〔1 7〕叶新荣 、邓秀新 、 肖顺元 、章文才 , 1 9蛤 ,柑橘
种间原生质体融合植株再生及染色体数目
变异的研究 。 实验生物学报 , 2 ` ( 1 ) : 19 一 29 。
4期 原生质体电融合再生柑橘属间体细胞杂种 3 9 2
〔18 〕史永忠 、 邓秀新 , 19 ” ,柑橘原生质体融合再
生叶肉亲本型植株的遗传分析 。 遗传学报 ,
2 6 ( 3 ) : 2 4 4一 2 4 8 。
〔1 9〕 K o b a y a s h i S , T . O h g a w a r a , E . O h g a w a r a
1
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3 3 0 刘继红 胡春根 邓秀新 3 3 卷
图 版 说 明
图 版 1
图 1 澳洲指橘 + 酸橙 融合再生二倍体植株 ;
图 2 二倍体细胞 ( Zn = Z x = 18 , 火 1 8 0 0 ) ;
图 3 二倍体植株与融合亲本叶片形态 比较 (从左至右分别为酸橙 、 二倍体植株 、澳州指橘 ) ;
图 4 , 5 具有二叶和三叶的植株 ,箭头分别示二叶 (图 4) 和三叶 (图 5) ;
图 6一 9 再生植株杂种特性的 R A P D 分析 : 分别为引物 O P A A 一 1 7 、 O P A 一 08 、 O P A 一 04 和 O P A 一07 的扩增带型 (从左
至 右依次为澳洲指橘 、 酸橙和再生植株 1一 12 号 , 图 9 中无 1号植株 ) 。
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