全 文 ：　　收稿日期:2001-08-30;修订日期:2001-12-30
基金项目:国家自然科学基金(30000117)、基金委重点项目(39830260)和瑞典国际科学基金(IFS)等项目资助[ This researchwas financially sup-
ported by the National Natural Science Foundation of China(No.30000117 , 39830260), and the International Foundation for Science(IFS)in Stockholm , Sweden
through a grant to Dr W.W.Guo(D/ 2895-2)]
①联系人。 E-mai l:dxxwwlj @ public.wh.hb.cn
印度酸桔与飞龙枳属间体细胞杂种的胞质遗传分析
程运江 ,郭文武 ,邓秀新①
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,武汉　430070)
摘要:对印度酸桔(Citrus reticulata )+飞龙枳(Poncirus trifoliata)属间体细胞杂种的 3棵 8 年生植株及其融合亲本
的胞质基因组进行了 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)和 RFLP分析。用 5 对叶绿体和 5 对线粒体通用
引物对(universal primer pairs)对杂种及亲本的总 DNA 进行PCR扩增 , 都没有检测到多态性 ,但扩增产物分别用 11 种
限制性内切酶酶切后 ,发现 3 个有多态性的叶绿体 CAPS 标记和 1个线粒体 CAPS 标记。结果表明杂种的叶绿体都
来源于飞龙枳 ,而线粒体都来源于印度酸桔。为了证实 CAPS 分析结果的可靠性 , 用5 种限制性内切酶对总 DNA 进
行单酶切 ,分别与 1 个叶绿体探针和 5个线粒体探针杂交 ,结果与 CAPS 分析一致。初步证实该组合体细胞杂种的
胞质遗传组成为:“印度酸桔的线粒体+飞龙枳的叶绿体” 。结果表明细胞融合确实能导致细胞核 、线粒体和叶绿
体的重新组合 ,为柑桔体细胞杂种中线粒体偏向来源于悬浮亲本而叶绿体偏向来源于叶肉亲本的胞质分配现象提
供了新的证据 ,并为通过体细胞融合技术定向转移柑桔胞质基因的品种改良思路提供了重要理论依据。
关键词:柑桔;体细胞杂种;cpDNA;mtDNA;CAPS;RFLP
中图分类号:Q343　　文献标识码:A　　文章编号:0397-4172(2002)04-0364-06
Inheritance of Organelle Genomes of the Somatic Hybrid
Between Cleopatra Mandarin(Citrus reticulata)and Flying
Dragon(Poncirus trifoliata)
CHENG Yun-Jiang , GUO Wen-Wu , DENG Xiu-Xin①
(NationalKey Laboratory of Crop Genetic Improvement , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , China)
Abstract:Cleaved Amplified Polymorphic Sequence(CAPS)was successfully applied to analyze the organelle
composition of three eight-year-old trees of the somatic hybrid between Cleopatra mandarin(Citrus reticulata)
and Flying Dragon(Poncirus trifoliata).Five chloroplast and five mitochondrial universal primer pairs were
used.All chloroplast primer pairs (rbcL-rbcL , rbcL-PSA Ⅰ , TrnH-Trnk , TrnD-TrnT , TrnK-TrnK)and
three (nad 1 exon B-nad 1 exon C , 18S rRNA-5S rRNA , nad 4 exon 1-nad 4 exon 2)of the five mitochondrial
primer pairs , were efficiently amplified ,but no polymorphism was detected , when the PCR products were di-
gested by eleven restriction endonucleases , including , Hin6Ⅰ , Bus RⅠ , TaqⅠ , MspⅠ , HinfⅠ , AluⅠ ,
Dra Ⅰ , EcoRⅠ , Hind Ⅲ , BamH Ⅰ and Pst Ⅰ respectively , three polymorphic cpDNA-CAPS markers
(rbcL-rbcL/ Hin 6Ⅰ , TrnD-TrnT/ BusRⅠ , TrnD-TrnT/ Taq Ⅰ)and one mtDNA-CAPS marker (nad 1-
nad1/ Msp Ⅰ)were found.The results showed that cpDNA in the somatic hybrid plants came from Flying
Dragon , the mesophyll parent , and mtDNA from Cleopatra mandarin , the embryogenic suspension parent uni-
formly .In order to prove the reliability of CAPS results , and to get more detailed information about the mtDNA
遗 传 学 报 , 29(4):364～ 369 , 2002
Acta Genetica Sinica
inheritance , RFLP analyses was conducted.Genomic DNA of the somatic hybrids and their corresponding par-
ents were digested by five restriction endonucleases(DraⅠ , EcoRⅠ , HindⅢ , BamH Ⅰ and PstⅠ), and
hybridized with five mitochondrial probes(Cob , Pro 2 , ProⅠ , atp 6 , 26S rRNA)as well as one chloroplast
probe , i.e.the PCR product of Flying Dragon with the primer pair of trnd 1-trnt 1.The results were in line
with those of CAPS , and no novel bands were detected , which indicated that no organelle DNA recombination
or rearrangement have been detected in the hybrid plants.The research showed that novel pattern of nuclear-
mitochondria-chloroplast interaction could be reached via protoplast fusion.
Key words:citrus;somatic hybrids;cpDNA;mtDNA;CAPS;RFLP
　　原生质体融合技术有效地克服了柑桔常规育种
中遇到的珠心胚干扰和性器官败育等困难 ,使一些
以前难以重组的种 、属间实现了遗传重组 ,这一技术
现已广泛应用于柑桔品种改良实践[ 1] 。10余年来 ,
全世界已创造近 200例柑桔体细胞杂种[ 1] ,其中属
间组合多达60余例(郭文武等 ,文章待发表)。部分
杂种相继开花结果 ,人们在扩大融合组合范围的同
时 ,将注意力更多地转向杂种的综合利用评价及其
遗传规律的研究。近几年 ,体细胞杂种的叶绿体和
线粒体遗传规律的研究越来越引起重视[ 1～ 5] 。开展
柑桔体细胞杂种胞质遗传研究不仅能为杂种鉴定提
供可靠的分子生物学证据 ,而且能为体细胞杂交应
用于柑桔遗传改良 ,尤其是定向转移胞质基因的育
种策略提供重要的理论依据。柑桔体细胞杂种的胞
质遗传研究由于材料和技术原因 ,分离足够量的高
纯度细胞器 DNA 难度较大 , 此前的报道一直以总
DNA对柑桔体细胞杂种的胞质遗传进行 RFLP 分析
研究[ 1 ～ 5] 。最近 2 年 , Bastia 等[ 6] 和 Froelicher 等[ 2]
将CAPS分析技术分别用于油菜和柑桔体细胞杂种
的胞质遗传研究 , 与 RFLP 分析相比 ,效率大为提
高 。
本研究参考了 Froelicher 等的 CAPS 分析方
法[ 2] ,并增加了叶绿体和线粒体通用引物对的数目 ,
首次结合 CAPS 和 RFLP 两种方法对印度酸桔+飞
龙枳属间体细胞杂种的叶绿体及线粒体的来源进行
了比较全面的分析 , 探明了杂种叶绿体基因组
(cpDNA)和线粒体基因组(mtDNA)的来源 。
1　材料和方法
1.1　材料
　　印度酸桔+飞龙枳属间体细胞杂种由佛罗里达
大学柑桔研究与教育中心 Grosser 教授提供[ 7] 。体
细胞杂种及飞龙枳都种植在华中农业大学柑桔研究
所的实验园 ,印度酸桔的愈伤组织也由 Grosser教授
提供 ,现保存于华中农业大学作物遗传改良国家重
点实验室。叶绿体和线粒体通用引物对的序列来源
参见表 1 、表 2 ,由上海生工生物工程公司合成。线
粒体探针由佛罗里达大学柑桔研究与教育中心
Moreira 博士及华中农业大学张方东博士惠赠。
表 1　叶绿体通用引物对的序列 、来源及扩增片段长度
Table 1　cpDNA universal primer sequences , size of amplified fragments and references
引物 1　Primer 1 引物 2　Primer 2 扩增片段 Fragment length(bp) 文献来源 References
rbcL rbcL 1381 [ 10]
5′-ATGTCACCACAAACAGAAACT 5′-CTTCACAAGCAGCAGCTAGTT
AAAGCAAGT-3′ CAGGACTCC-3′
rbcL PSAI 3350 [ 11]
5′-TTTGGTGGAGGAACT 5′-GCAATTGCCGGAAATACTAAGC-3′
TTAGGACACCCTTGGGG-3
TrnH TrnK 1750 [ 12]
5′-ACGGGAATTGAACCCGCGCA-3′ 5′-CCGACTAGTTCCGGGTTCGA-3′
TrnD TrnT 1600 [ 12]
5′-ACCAATTGAACTACAATCCC-3′ 5′CTACCACTGAGTTAAAAGGG-3
TrnK TrnK 2569 [ 10]
5′-AACCCGGAACTAGTCGGATG-3′ 5-TCAATGGTAGAGTACTCGGC-3′
4期 程运江等:印度酸桔与飞龙枳属间体细胞杂种的胞质遗传分析 365　
表 2　线粒体通用引物对的序列 、来源及扩增片段长度
Table 2　mtDNA universal primer sequences , size of amplified fragments and references
引物 1　Primer 1 引物 2　Primer 2 扩增片段 Fragment length(bp) 文献来源 References
nad 1 exon B nad 1 exon C 1184 [ 13]
5′-GCATTA CGATCTGCAGCTCA-3′ 5′-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3′
18S rRNA 5S rRNA 1177 [ 14]
5′-GTGTTGCT GAGACATGCGCC-3′ 5′-ATATGGCGCAAGACGATTCC-3′
nad 4 exon 1 nad 4 exon 2 2100 [ 13]
5′-CAGTGG GTTGGTCTGGTATG-3′ 5′-TCATATGGGCTACTGAGGAG-3′
1.2　总 DNA的提取
参见程运江等的方法[ 8] ,取 5 ～ 8g 健康的叶片
或愈伤组织 ,加入液氮研碎 , 加入 CTAB 提取缓冲
液 ,于 65℃水浴 ,除去 RNA ,用苯酚/氯仿抽提一次 ,
加入水饱和乙醚结合高浓度的 NaCl抽提一次 ,沉淀
DNA ,用低浓度乙醇漂洗后溶于 TE中备用 。
1.3　CAPS分析
使用 5个叶绿体和5个线粒体通用引物对对总
DNA进行 PCR扩增。PCR反应在 PTC-200 Thermo-
cycler 中进行。反应体系为(50 μl):0.2 μmol/L
dNTP ,15mmol/L MgCl2 ,2 U Taq DNA聚合酶(Canada)
和1×buffer , 正反向引物各 0.2 μmol/L ,模板 DNA
100ng 。扩增程序为:94℃变性 3min;接着 32 个循
环:94℃变性 1min , 55℃复性 40s , 72℃延伸 2min;最
后 72℃延伸 10min , 4℃保存 , 取 4 μl 扩增产物在
1.8%的琼脂糖凝胶上检测后 ,取 5 ～ 8 μl扩增产物
用5U限制性内切酶 37℃保温 4 ～ 5h ,在 2.0%的琼
脂糖凝胶(含 5 μg/ml EB)中 2.5V/cm 电泳 2 ～ 3h ,
在紫外灯下照相 。
1.4　RFLP分析
向200μl的微量离心管中加入 10μg 总 DNA ,
70U限制性内切酶和 5μl 10×Buffer(含 BSA)用去离
子水将总体积加至 50μl ,混匀后加一滴矿物油覆
盖 ,于 37℃保温 18h。酶切的 DNA样品在 0.8%的
琼脂糖凝胶(含 5μg/ml EB)中 1.5V/cm 电泳 12h。
DNA印迹参见 Hybond-N+Nylon膜(Amersham)使用
手册(1998 年),电泳后的琼脂糖凝胶经酸变性 、碱
变性后用碱转法 ,将 DNA样品印迹到尼龙膜上 ,经2
×SSC 漂洗后 ,80℃烘 2h ,用保鲜膜包好于4℃保存 。
探针标记 、杂交 、洗膜均参见 Feinberg 等的程序[ 9] ,
并作适当修改。尼龙膜预杂交 6h 后 ,与 d(CTP)32P
标记的探针 65℃杂交过夜。采用高严谨条件(0.1
×SSC ,0.1×SDS)洗膜 3 ～ 5次(1h/次),用保鲜膜包
好 ,尼龙膜于-80℃曝光 1 ～ 4d。
2　结果与分析
2.1　体细胞杂种中叶绿体的遗传
　　本研究使用了 rbcL-rbcL , rbcL-PSA I ,TrnH-TrnK ,
TrnD-TrnT ,TrnK-TrnK 等 5个叶绿体通用引物对(表
1),每个引物对都能扩增出预期大小的片段 ,但都没
检测到多态性。当这些 PCR 产物分别被 Hin6Ⅰ ,
BusRⅠ , Taq Ⅰ ,Msp Ⅰ ,Hinf Ⅰ , Alu Ⅰ ,Dra Ⅰ, EcoRⅠ,
HindⅢ ,BamH Ⅰ , Pst Ⅰ等 11种限制性内切酶单酶
切后 , 其中在 rbcL-rbcL/ Hin 6Ⅰ, TrnD-TrnT/ BusRⅠ,
TrnD-TrnT/ Taq Ⅰ等 3个引物对/内切酶组合中找
到了多态性。结果显示 ,杂种叶绿体都来源于飞龙
枳(叶肉亲本)(图1)。为了验证CAPS分析结果的
图 1　cpDNA的 TrnD 1-TrnT 1/ Bus RⅠ CAPS图谱
1:200bp DNA ladder;2:印度酸桔;3～ 5:体细胞杂种;6:飞龙枳
Fig.1 cpDNA analyzed by CAPS with the primer/ enzyme
combination of TrnD 1-TrnT 1/ Bus R Ⅰ
1:200bp DNA ladder;2:Cleopatra mandarin;3～ 5:somatic
hybrids;6:Flying Dragon
可靠性 ,将总 DNA经 Dra Ⅰ酶切 ,用飞龙枳的 TrnD-
TrnT的 PCR产物作探针杂交 ,表明与 CAPS 分析的
结果一致 ,且都没有检测到 cpDNA的重组(图 2)。
这与前人关于柑桔体细胞杂种叶绿体来源的遗传研
究结果一致(郭文武等 ,文章待发表)。
366　 遗　　传　　学　　报 29卷
图 2　总 DNA的 Dra Ⅰ/TrnD 1-TrnT 1 杂交图谱
1:印度酸桔;2～ 4:体细胞杂种;5:飞龙枳
Fig.2　cpDNA analyzed by RFLP.Genomic DNA digested
by Dra Ⅰ and hybridized by TrnD 1-TrnT 1
1:Cleopat ra mandarin;2～ 4:somat ic hybrids;5:Flying Dragon
2.2　体细胞杂种中线粒体的遗传
使用 5个线粒体通用引物对对总 DNA 进行扩
增 ,但仅有 nad 1-nad 1 , 18S rRNA-5S rRNA , nad 4-
nad 4 ,3个引物对能有效扩增(表 2),但每个引物对
扩增出的线粒体 DNA片段长度都没有差异 ,用与叶
绿体 CAPS分析中相同的 11种限制性内切酶对 PCR
产物进行酶切后 ,仅在 nad 1-nad 1/ Msp Ⅰ组合中有
多态性 。CAPS 分析结果表明 ,杂种线粒体 DNA 都
来源于印度酸桔(悬浮系亲本)(图 3)。由于 CAPS
分析线粒体基因组的变异不如分析叶绿体基因组有
图 3　mtDNA 的 nad 1-nad 1/ Msp Ⅰ CAPS 图谱
1:200bp DNA ladder;2:印度酸桔;3～ 5:体细胞杂种;6:飞龙枳
Fig.3　mtDNA analyzed by CAPS with the primer/ enzyme combination of
nad 1-nad 1/ Msp Ⅰ
1:200bp DNA ladder;2:Cleopatra mandarin;3～ 5:somatic hybrids;
6:Flying Dragon
效[ 2] ,而且体细胞杂种中线粒体遗传较叶绿体更为
复杂 ,为了更多地获取杂种线粒体基因组可靠的遗
传信息 ,并证实 CAPS 分析结果的可靠性 ,我们对线
粒体基因组进行了 RFLP 分析。用 Cob , Pro 2 , Pro
Ⅰ , atp 6 ,26S rRNA 等 5个线粒体探针与 EcoRⅠ ,
HindⅢ , BamH Ⅰ , Dra Ⅰ , Pst Ⅰ等 5种限制性内
切酶单酶 切的总 DNA 样品 进行杂 交 , 其 中
EcoRⅠ/ atp 6 , PstⅠ/ Cob , Pst Ⅰ/Pro Ⅰ 等内切酶/
探针组合具有多态性 ,杂种中线粒体的特征带型与
印度酸桔完全一致 ,没有检测到线粒体的遗传重组
(图 4)。3个供试杂种植株线粒体带型具有高度的
一致性 ,并且 8年来植株生长表现一直正常 ,表明了
杂种线粒体遗传的稳定性。
图 4　总 DNA 的 Pst I/ Cob 杂交图谱
1:印度酸桔;2～ 4:体细胞杂种;5:飞龙枳
Fig.4 mtDNA analyzed by RFLP.Genomic DNA digested by Pst Ⅰ and
hybridized by Cob
1:Cleopatra mandarin;2～ 4:somatic hybrids;5:Flying Dragon
3　讨论
RFLP分析是研究植物胞质遗传的常规方法。
而 CAPS 是特异引物PCR与限制性内切酶相结合而
产生的一种 DNA标记 ,当特异扩增产物的电泳谱带
不表现多态性时 ,可用限制性内切酶对扩增产物进
行酶切 ,然后通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测其多态性[ 15] 。CAPS用于体细胞杂种胞质遗传分
析最近才有报道[ 2 ,6] 。同 RFLP 相比 ,CAPS 分析的
主要优点在于[ 2 , 6] :该方法易操作 、低成本;直接用
总 DNA进行扩增;无须分离细胞器 DNA;样品用量
少 ,特别适合于对杂种进行早期遗传分析 。
本研究采用的是叶绿体和线粒体特异性引物
对 ,且最初均非来源于柑桔 ,但在柑桔上能有效扩增
(两对线粒体引物除外),说明叶绿体和线粒体基因
组的某些区域在物种进化中比较保守;而柑桔属与
枳属之间的 CAPS 分析出现了多态性 ,表明不同物
种间胞质基因组的差异普遍存在 。本研究中 ,柑桔
属间体细胞杂种胞质遗传的 CAPS 分析结果的可靠
性得到了 RFLP 分析的进一步证实。Xu等认为 ,在
体细胞杂种的胞质遗传研究中 ,分离细胞器 DNA ,
尤其是线粒体 DNA非常困难 ,因此建议用胞质基因
特异性探针与总 DNA 进行 RFLP 分析[ 16] 。柑桔体
细胞杂种的分子鉴定中 ,用总 DNA对叶绿体和线粒
体进行 RFLP 及 CAPS 分析现已被研究者广泛接
受[ 1～ 5] 。另外 ,胞质基因组与核基因组可能存在同
4期 程运江等:印度酸桔与飞龙枳属间体细胞杂种的胞质遗传分析 367　
源性 ,Stupar 等用原位杂交技术首次证明了拟南芥
mtDNA有大约 620kb的片段插入 2号染色体中[ 17] ,
但在柑桔等木本植物中尚无这方面的报道。在用成
年态材料分离高纯度细胞器 DNA 的技术未成熟之
前 ,用总DNA 进行 RFLP 及 CAPS 分析依然是柑桔
体细胞杂种胞质遗传研究的主要手段 ,并对其他木
本植物的胞质遗传研究具有一定的参考价值 。
同一年生作物相比 ,柑桔体细胞杂种更有无性
繁殖优势 ,无需保存大的群体 ,一旦需要 ,在短期内
便可大量繁殖。迄今 ,柑桔体细胞杂种在无籽三倍
体培育[ 18] 、新型多抗砧木育种[ 19] 等方面已表现出
潜力。对柑桔体细胞杂种的遗传背景进行深入分
析 ,将有助于将其应用于柑桔遗传改良实践。本研
究的结果与郭文武等对红桔+枳属间体细胞杂种的
胞质遗传进行分析时得到的结论相同(文章待发
表),初步研究结果表明 ,以枳属作叶肉亲本与柑桔
属的融合组合似乎都呈现出“双亲的核+桔类的线
粒体+枳类的叶绿体”的核 、质互作模式 。柑桔体细
胞融合过程中叶绿体随机分离 ,或偏向来源于叶肉
亲本[ 20] ,极少有重组发生;而线粒体都来源于悬浮
系亲本[ 3 ,4] ,且常常发生重组 。出现这种分离现象
的分子机理尚不清楚 ,对此有几种不同的解释:Mor-
gan等[ 21]认为是由于原生质体融合过程中细胞器受
到损伤的程度不同所致;而 Moreira 等[ 3 ,4] 则认为是
由于融合亲本中细胞器的相对含量差异所致 。
Palmer等[ 22]的观点是 ,亲本叶绿体发育状态以及培
养选择压力影响叶绿体的分离趋向 ,并认为叶绿体
的遗传稳定性与它的两个稳定的反向重复区域可以
防止序列重排有关。
作物胞质基因控制着许多重要的农艺性状。无
籽是柑桔育种的目标之一。Yamamoto 等的研究已
表明 ,温州蜜柑的无籽机理是由胞质基因互作导致
花药败育所致[ 23] ,因此 ,通过原生质体融合将温州
蜜柑的线粒体定向转移到其他有籽的柑桔栽培品种
以获得无籽新类型的品种改良思路正在进行之中 。
郭文武等认为叶绿体可能与某些抗性有关 ,并将叶
绿体在原生质体融合中的分配现象应用于新型多抗
砧木育种研究[ 19] 。本研究结果为弄清柑桔体细胞
杂种胞质基因的分离与重组规律增添了新的证据 ,
为以原生质体融合为手段的柑桔育种研究提供了理
论依据。
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(责任编辑:张艳)
4期 程运江等:印度酸桔与飞龙枳属间体细胞杂种的胞质遗传分析 369