全 文 ：Marine Sciences/Vol.29, No.5/2005 23
研究报告REPORTS
木榄属 3种红树植物的遗传变异和亲缘关系分析
潘 文1 ,2 , 周涵韬1 ,3 , 陈 攀 1 , 林 鹏1 , 2
(1.厦门大学 生命科学学院 ,福建厦门 361005;2.厦门大学 湿地与生态工程研究中心 ,福建 厦门 3361005;
3.福建省农业科学院 生物技术中心 ,福建 福州 350003)
摘要:用随机扩增多态性 DNA(RAPD)和 inter-简单重复序列 (ISSR)分子标记技术对木榄属
(Bruguiera)3种红树木榄 (Bruguiera gymnorrhiza)、海莲(B.sexangula)、尖瓣海莲(B.sexangula
var.rhynchopetala)进行遗传亲缘关系研究 。 12个 RAPD引物和 10个 ISSR引物分别扩增出 240
和 191条带 , 多态位点百分率分别为 38.75%和 52.88%, ISSR检测到的多态位点率高于
RAPD 。运用 Nei指数法计算木榄-海莲 、木榄-尖瓣海莲 、海莲-尖瓣海莲之间的遗传距离 ,
RAPD分析结果为 0.47 、0.36 、0.29 , ISSR分析结果为 0.62 、0.41 、0.32。同时运用 UPGMA统计
法进行聚类分析 , 结果显示 ,海莲和尖瓣海莲聚为一组 , 木榄单独一组 。结合宏观形态和等位
酶资料 ,作者把尖瓣海莲确定为海莲的变种 。
关键词:木榄属;ISSR;RAPD;分子标记
中图分类号:Q37 文献标识码:A 文章编号:1000-3096(2005)05-0023-06
收稿日期:2004-02-10;修回日期:2004-10-12
基金项目:教育部科技重点项目(104105);福建省青年科技
项目(2001J033)
作者简介:潘文(1967-),女 ,福建人,博士生 ,研究方向为分
子生态学 , E-mail:pcpanwen@citiz.net;周涵韬 , 通讯作者 ,
E-mail:htzhou@jingxian.xmu.edu.cn
DNA 序列多态性的检测和利用是分子生物学
最主要的进展之一[1 ]。目前 , 已发展了多种以 DNA多
态性为基础的遗传标记 ,其中 RAPD(RandomAmplified
Polymorphic DNA) [2 ]和 ISSR(Inter -Simple Sequence
Repeat)[3 ]标记 , 在生物种属鉴定 、种质资源的遗传多
样性 、基因定位 、分子连锁图构建 [4 -7 ]等方面得到了
迅速而广泛地运用 。相对于组织蛋白和等位酶分析
而言 ,RAPD和 ISSR具有多态性高 、无需活材料 ,能实
现全基因组无偏取样和无组织器官特异等优点;与微
卫星分析相比 , 二者不要求预知基因组序列信息 , 大
大减少了多态性分析的预备工作 。
红树林是分布于热带海岸潮间带的木本植物群
落 , 是热带海岸重要的植被类型 , 是维护海岸生态平
衡的特殊生态系 。由于不合理的开发利用 ,全世界的
红树林都面临着资源枯竭的严重境地 ,为保护和可持
续利用这一独特资源 ,各有关国家开展了许多研究 。
但研究多集中在生理学 、生态学、生物化学 [8 ]等领域 ,
而分子生物学的研究较少 。与其他生物保护一样 ,用
分子标记的方法研究红树植物遗传多样性是红树植
物种质资源保护及开发利用的基础 。目前 ,红树植物
某些种属的分类关系仍不确定 。红树植物中红树科
木榄属的植物在中国共有 4种 [ 9] :柱果木榄 、木榄 、海
莲 、尖瓣海莲 。柱果木榄在海南有记录 ,现已灭绝。木
榄在我国分布较广 , 海莲 、尖瓣海莲均分布在海南
岛 。3种红树植物在形态学上的差异较小 ,主要集中在
花器的结构上 ,这给引种、造林研究造成一定困难 。通
常 ,证实种间关系主要依靠形态学 、次生化合物 、染色
体 、地理分布和实验杂交等方法 , 但这些方法都有其
局限性 。相比之下 , 分子标记技术是一种有效的分析
手段 , 对于任何一个类群来说 , 要么含有某个基因位
点 , 要么不含该位点 , 不存在形态性状中难以判断的
中间性状。作者利用 RAPD和 ISSR两种 DNA分子标
记技术对木榄属 3种红树植物木榄 、海莲 、尖瓣海莲
的进行遗传亲缘关系研究 。
1 材料和方法
1.1 材料
木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、海莲(B.sexangula)、
尖瓣海莲 (B.sexangula var.rhynchopetala)均采集于海
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南岛东寨港红树林保护区内 。选择生长良好 , 无病虫
害 , 胸径 4 cm以上的母树 。每隔 5～ 10m随机选取一
株 ,每个种取 5个个体 ,采集幼嫩叶片单独做好标记 。
叶片采集后置于-20℃冰箱或液氮储存备用。
RAPD和 ISSR引物 ,以及 Taq酶等药品均购自上
海生工生物工程技术服务有限工司 。
1.2 方法
1.2.1 红树植物 DNA的提取
参照周涵韬 [8 ]等的方法进行总 DNA的提取 。
1.2.2 RAPD-PCR反应
从 100个 RAPD随机引物 (上海生工)中筛选出
12个能获得清晰多态性条带 , 反应稳定引物。RAPD-
PCR扩增总体积为 25μL。包括 Tris-HCl 10.0mmol/L
(pH8.0), KCl 50.0 mmol/L , 0.1%Tritonx-100 , 2.5
mmol/L MgCl2 , 0.1 mmol/L dNTPs , 0.4μmol/L引物 ,
80 ng的 DNA模板 , 1UTaq聚合酶。PCR循环设置为:
94℃变性 1min ,36℃退火 1 min , 72℃延伸 2 min ,共 40
个循环 ,然后 72℃延伸 7 min。反应产物在含有 EB的
1.4%琼脂糖凝胶中电泳检测 ,电压为 5 V/cm , 2 h ,电
泳结束后 , 在紫外检测仪上观察 , 并在凝胶成像系统
保存图像 。
1.2.3 ISSR-PCR反应
按照与 RAPD相同的筛选策略从 30个 ISSR引
物中选出 10个用于 ISSR的 PCR反应 。ISSR-PCR扩
增总体积为 20 μL。包括 Tris-HCl 10.0 mmol/ L
(pH8.0), KCl 50.0 mmol/L , 0.1%Tritonx-100 , 2
mmol/L MgCl2 , 0.2mmol/L dNTPs ,0.4μmol/L引物 , 80
ng的 DNA模板 , 1UTaq聚合酶 , 无菌水 6.6μL。PCR
循环设置为:94℃变性 5 min后 , 94℃变性 30 s , 52℃
退火 45 s , 72℃延伸 2min ,共 45个循环 ,然后 72℃延
伸 7min。反应产物在含有 EB的 1.5%琼脂糖凝胶中
电泳检测 ,电压为 5V/cm , 2 h记录和拍照同 RAPD。
1.2.4 数据统计分析
在 RAPD和 ISSR扩增结果电泳图谱中 , 有带计
为“1” ,无带计为“0” ,强带和弱带均计为“1”。
遗传一致度 、遗传距离及聚类分析:根据 RAPD
扩增结果所统计的数据 , 遗传距离(D)和遗传一致度
(F)的计算运用 Nei指数法 [10 ] , F =2Nxy/(Nx+Ny),
其中 Nxy 为两个个体共同享有的 RAPD标记数 , Nx ,
Ny 分别为 X和 Y 个体分别拥有的 RAPD标记数 , 再
经 D=1-F 计算相应的遗传距离 。聚类分析采用
UPGMA(unweighted pair group mean average)进行 [11 ]。
2 结果与分析
2.1 RAPD分析结果
在运用 RAPD引物对 3个供试材料的 DNA扩增
过程中 。需对模板 DNA的浓度做梯度实验 。模板浓度
在 50 ～ 150 ng时都有扩增 ,最后选定为 80 ng /μL。在
PCR扩增中 ,酶是最主要的影响因素 ,由于不同厂家不
同批次酶的活性不同 , 对镁离子浓度要求不同 , 因此 ,
每次买新酶必须做镁离子梯度实验 , 以确定最佳镁离
子浓度 。本实验最后选定镁离子浓度为 2.5mmol/L。
从 100个 RAPD引物中筛选出 12个能获得清晰
条带 ,反应稳定的引物(重复 2 ～ 3次)进行研究 。引物
号序列以及 RAPD扩增情况见表 1。RAPD反应扩增
片段大部分集中在 0.35 ～ 3.5 kb范围内 , 如图 1。12
个 RAPD引物在木榄属 3种红树植物中共扩增出 290
条带 ,平均每个引物扩增出 20条带 ,其中具有多态性
的扩增带有 93条 , 占总扩增带的 38.75%, 平均每个
引物可扩增出 7.75条多态性带 。
根据 RAPD扩增结果 , 运用 Nei指数法计算木榄
属 3种红树植物的遗传距离和遗传一致度 , 结果见表
2。木榄-海莲 ,木榄-尖瓣海莲 ,海莲-尖瓣海莲的
遗传距离分别为 0.47、 0.34 、0.29。平均遗传距离为
0.36。并运用 UPGMA统计分析对木榄属 3种植物的
亲缘关系进行聚类分析 ,结果见图 2。木榄与海莲 、尖
瓣海莲的亲缘关系较远单独聚为一组 ,海莲与尖瓣海
莲的关系较近 。两者聚为一组 。
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2.2 ISSR分析结果
在 RAPD体系的基础上 , 发现 ISSR体系模板
DNA的浓度与 RAPD差别不大 ,同时也对镁离子进行
梯度实验 ,以获得最适合酶活性的镁离子浓度 。实验
结果以 Taq酶用量 1 U ,镁离子浓度为 2 mmol/L ,
从 30个 ISSR引物中筛选出 10个扩增效果好的
引物进行遗传差异研究(表 3)。ISSR反应扩增片段大
部分集中在 0.2 ～ 2.0 kb范围内 , 如图 3。10个 ISSR
引物在木榄属 3种红树植物中共扩增出 191条带 , 平
均每个引物扩增出 19.1条 , 多态性条带有 101条 , 占
总扩增带的 52.88%。平均每个引物可扩增出 10.1条
多态性带 , ISSR1引物扩增多态性条带百分率最高达
85%。运用 Nei指数法 ,根据 ISSR扩增结果 ,计算木榄
属 3种红树植物的遗传距离和遗传一致度(表 4), 木
图 1 木榄属 3种红树植物 RAPD引物扩增图谱
Fig.1 genomic DNA fingerprints of 3 mangrove species in Brugiera by RAPD
1.木榄;2.海莲;3尖瓣海莲 ,M为λDNA EcoRⅠ/Hind Ⅲ 分子量标记
1.Bruguiera gymnorrhiza;2.B.sexangula;3.B.sexangula var.rhynchopetala , M:λDNA EcoRⅠ/Hind Ⅲ
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图 3 木榄属 3种红树植物 ISSR引物扩增图谱
Fig.3 genomic DNA fingerprints of 3 mangrove species in Brugiera by ISSR
1.木榄;2.海莲;3尖瓣海莲 ,M为λDNA EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ 分子量标记
1.Bruguiera gymnorrhiza;2.B.sexangula;3.B.se xangula var.rhynchopetala , M:λDNA EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ
榄-海莲 、木榄-尖瓣海莲 、海莲-尖瓣海莲的遗传
距离分别为 。0.62 、0.42 、0.31 ,平均值为 0.45。运用
UPGMA统计分析对木榄 3种红树植物的亲缘关系进
行聚类分析 ,结果见图 4。木榄与海莲 、尖瓣海莲的亲
缘关系较远单独聚为一组 ,海莲与尖瓣海莲的关系较
近 ,两者聚为一组 。
3 讨论
多态位点百分率是衡量物种遗传变异水平高低
的一个重要指标 , 是度量遗传多样性的重要参数 。
Hamrick等 [12 ]用等位酶对 449种植物进行遗传变异研
究 , 首次在种水平上对植物的遗传多样性做出估计 ,
并且和在种群水平上的遗传多样性做了对比 ,揭示出
种多态位点平均水平为 50.5%, 种群多态位点平均
水平为 34.2%。本研究用 RAPD方法检测木榄属 3种
红树植物的平均多态百分率为 38.75%, 低于 449个
种的平均水平 ,高于种群平均水平 。ISSR方法检测的
平均多态百分率为 52.88%。说明 ISSR比 RAPD检测
到更多的遗传多态位点 。显然 ,这与它们在对基因组
进行扩增时引物结合位点的不同有直接的关系 。在小
麦和水稻的研究中也证明 ISSR检测遗传多态性的能
力比 RAPD更高 [5 ,13 ] 。RAPD和 ISSR分析所获得的遗
传距离和 UPGMA聚类树状图结果均比较一致 。说明
这两种分子标记技术可以有效地应用于象红树植物
这类遗传多态性低物种的个体鉴定和遗传多样性评
价研究 。
遗传变异是进化的动力 , 而进化过程必然伴随或
大或小的遗传变异 , 这是新物种形成的关键一步
[14 ]。一般来说 , 随着分类或进化水平的提高 , 分类群
间遗传一致度下降 ,遗传距离加大 。Gottlieb [15 ]对 28种
植物的亲缘关系用等位酶进行了研究 ,发现种内种群
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间遗传距离很低 ,平均值为 0.05。种间遗传距离明显
升高 ,平均值为 0.33。在本研究中 ,RAPD和 ISSR方法
所获得木榄 、海莲 、尖瓣海莲平均的遗传距离分别为
0.36和 0.45。表明 3种红树植物为属内种间关系 。从
分子聚类图上 ,海莲 、尖瓣海莲聚为一组 ,而木榄单独
聚为一组 , 表明海莲与尖瓣海莲亲缘关系较近 , 二者
与木榄的亲缘关系较远 。电泳图谱上 ,尖瓣海莲与海
莲的指纹图谱极为相似 , 而与木榄的指纹图谱差异较
大 。林鹏 [9 ]对中国红树植物的形态学分类描述中 , 木
榄与海莲 、尖瓣海莲在形态有较大的差别 , 而海莲与
尖瓣海莲仅存在极小差异(表 5), 但这些差异都不是
辨别种的主要特征 , 因此 , 把尖瓣海莲定位海莲的变
种 。葛菁萍 [ 16 ]用等位酶方法对木榄属 3种红树植物进
行了种间亲缘关系分析 , 共检测了 5个酶系统 , 7个
酶位点和 17个等位基因 , 结果表明 , 木榄-海莲的遗
传一致度为 0.796 6 , 海莲-尖瓣海莲的遗传一致度为
0.915 0 , 尖瓣海莲-木榄的遗传一致度为 0.889 5 , 表
明海莲与尖瓣海莲之间的亲缘关系要近于木榄 ,尖瓣
海莲是海莲的变种 。综合上述研究 ,作者认为把尖瓣
海莲处理为海莲的一个变种似乎更为妥当 。
作者用 RAPD和 ISSR两种分子标记有效地将亲
缘关系接近的尖瓣海莲和海莲区分开来。可看出分子
分类对于红树资源的鉴定 、分类及遗传多样性评价是
一种有效手段 。它应用于红树植物的分子分类研究是
可行的。分子分类技术结合传统的分类方法必将进一
步促进红树资源的合理开发 、保护和利用 。
参考文献:
[ 1] 阎文昭 ,蔡平钟 ,宣 朴 ,等 .RAPD技术在生物学研究
中的应用[ J] .世界科技研究与发展 , 1999, 2:83-84.
[ 2] Williams J G L.DNA polymorphisms ampli fied by arbit rary
primers are useful as genetic markers [ J] .Nuc Aci Res ,
1990 , 18(22):6 531-6 535.
[ 3] Ziekiewicz E, Rafalski A , Labuda D.Genome fingerprinting
by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase
chain reaction amplification [ J] .Genomica, 1994, 20:
176-183.
[ 4] 王建波 .ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应
用[ J] .遗传 , 2002, 24(5):613-615.
[ 5] 杜金昆 , 姚颖垠 , 倪中福 , 等 .普通小麦、斯卑尔脱小
麦、密穗小麦和轮回小麦选择后代材料 ISSR分子标记
遗传差异研究[ J] .遗传学报 , 2002, 29(5):44-48.
[ 6] 陈 洪 , 朱立煌 , 徐吉臣 , 等 .水稻 RAPD分子连锁图
谱的构建[ J] .植物学报 , 1995, 37:677-684.
[ 7] Penner G A , Chong J , Levesque L M , et a l.Identification of a
RAPD marker linked to the oat stem rust gene Pg3[ J] .Theor
Appl Genet , 1993, 85:702-705.
[ 8] 周涵韬 ,林 鹏 .中国红树科 7种红树遗传多样性分析
[ J] .水生生物学报 , 2001, 25(4):362-369.
[ 9] 林 鹏 .红树林[M] .北京:海洋出版社, 1984.
[ 10] Nei M , Li W.A mathematical model for studying genetic
variation in the terms of restriction endonucleases[ J] .Proc
Natl Acad Sci USA, 1979, 17:5 269-5 273.
[ 11] Vierling R A , Nguyen H T.Use of RAPD markers to de-
termine the genetic diversity of diploid , wheat genotyes
[ J] .Theor Appl Genet , 1992 , 84:835-838.
[ 12] Hamrick J L,GodtM JW.Alloayme diversity inplant species
[ A] .BrownA HD , Clegg M T , Kahler A L, et al.eds.Plant
populationgenetics , breeding , and genetic resources[ C] .
研究报告 REPORTS
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Genetic variation and relationship of 3 Bruguiera species by
RAPD and ISSR
PAN Wen1 ,2 , ZHOU Han-tao1 ,3 , CHEN Pan1 , LIN Peng1 ,2
(1.School of Life Science , Xiamen University , Xiamen 361005 , China;2.Research Centre for Wetlands and Ecological
Engineering , Xiamen University , Xiaman 361005 , China;3.Biotechnology Centre , FuJian Academy of Agricultural
Science , Fuzhou 350003 , China)
Received:Feb., 10 , 2004
Key word:Bruguiera;RAPD;ISSR;molecular marker
Abstract:Random amplified polymorphic DNA (RAPD)and inter-simple sequence repeat (ISSR)methods were
applied to detect genetic variation and relationship of 3mangrove species of Bruguiera(Bruguiera gymnorrhiza , B.sexangul ,
B.sexangula var.rhynchopetala).12 RAPD and 10 ISSR primers generated 240 and 191 bands , of which 91 and 101 were
polymorphic , respectively.Percentages of polymorphicbands of RAPD and ISSRwere 38.75%and 52.88%.Comparison of
the two marker systems shows that ISSR was better than RAPD in terms of reproducibility and ability of detecting genetic
polymorphism.It was found that the average gene tic distance among different 3mangrove species of Bruguiera by RAPD and
ISSR were 0.37 and 0.45 , respectively.Based on UPGMA cluster analysis , it showed that Bruguiera sexangula and
B.sexangula var.rhynchopetala were classified into same group , while Bruguiera gymnorrhiza in an other group.Comparing
with the results of morphology and allozyme by other reports , B.sexangula var.rhynchopetala could be regarded as a varie ty of
Bruguiera sexangula.
(本文编辑:张培新)
Sunderland Mass:Sinauer , 1989.43-46.
[ 13] 钱伟, 葛颂 , 洪德元 .采用 RAPD和 ISSR标记探讨中
国疣粒野生稻的遗传多样性 [ J] .植物学报 , 2000, 42
(7):741-750.
[ 14] GrantV.Plant speciation [M] .New York:Columbia Uni-
versi ty.Press, 1981.149-172.
[ 15] Gottlieb LD.Electrophoretic evidence and plant systematics
[ J] .AnnMissouri BotGard, 1977, 64:161-180.
[ 16] 葛菁萍 .几种红树植物遗传变异和生态分化的研究
[ D] .厦门大学博士论文 , 1999.
研究报告 REPORTS